BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
MAM CHANDARA

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU
KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU
SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA
Bacillus clausii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
MAM CHANDARA KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU
KIỆN CẤP KHÍ VÀ NHIỆT ĐỘ ĐỂ THU
SINH KHỐI DƯỚI DẠNG BÀO TỬ CỦA
Bacillus clausii


2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 7
1.1.Vi khuẩn Bacillus…………………………………………………………… 7
1.1.1. Giới thiệu về chi Bacillus ……………………………………………7
1.1.2. Vị trí phân loại………………………………………………………….7
1.1.3. Đặc điểm vi khuản Bacillus…………………………………………………7
1.1.4. Bào tử và khả năng hình thành bào tử……………………………… 8
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus…………………………………… 10
1.2. Giới thiệu về Bacillus clausii………………………………………….11
1.2.1. Đặc điểm sinh thái sinh lý của Bacillus clausii………………………11
1.2.2. Ứng dụng của Bacillus clausii………………………………………14
1.3. Các phương pháp nuôi cấy……………………………………………16
CHƯƠNG 2: : NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị………………………….…… ………17
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất……………………………………………… 17
2.1.2. Máy móc, thiết bị………….………….………………….… ……… 17
2.1.3. Môi trường sử dụng………………………………………………… 17
2.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………… …….18
2.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii……………18
3

2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh khối………….18

Bảng 3.1. Lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii tại các thời
điểm khác nhau.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của
Bacillus clausii ở nhiệt độ 37
0
C.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của
Bacillus subtilis ở nhiệt độ 37
0
C.
Bảng 3.4. So sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis
ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37
0
C.
Bảng 3.5. Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C của
Bacillus clausii.
Bảng 3.6. Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C của
Bacillus subtilis.

Bảng 3.7. So sánh khả năng tăng sinh khối ở nhiệt độ 30
0
C và 37

Hình 1.6. Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử.
Hình 1.7. Chế phẩm Enterogermina.
Hình 1.8. Chế phẩm Erceflora.
Hình 1.9. Chế phẩm Bazivic.
Hình 3.1. Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng của Bacillus
clausii.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus
clausii theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37
0
C.
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus
subtilis theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37
0
C.
Hình 3.4. Đồ thị so sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus
subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37
0
C.
Hình 3.5. Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii ở
nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C.
Hình 3.6. Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis ở
nhiệt độ 30
0
C và 37
0
C.

sức khỏe, giúp phòng bệnh. Ngược lại, các vi sinh vật gây hại sẽ gây ra những
tác động xấu cho cơ thể như hình thành các chất gây hoại tử ruột, các chất gây
ung thư, tiêu chảy… Trong cuộc sống hàng ngày, hệ vi sinh vật đường ruột dễ
bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài như lão hóa, dùng kháng sinh, thức ăn
không vệ sinh… làm mất cân bằng về số lượng giữa vi khuẩn có lợi và vi
khuẩn có hại, gây nên các bệnh đường ruột trong đó tiêu chảy là một điển
hình. Vì vậy việc duy trì lượng vi sinh vật có lợi chiếm ưu thế nhằm hỗ trợ
các chức năng về tiêu hóa và miễn dịch ở đường ruột là rất quan trọng.
Sử dụng chế phẩm chứa vi sinh vật có lợi (Probiotic) nhằm mục đích
bổ sung, cân bằng lại vi sinh vật đường ruột là một trong các phương pháp
phòng và chữa bệnh tiêu chảy. Trong các Probiotic thì chế phẩm
Enterogermina thực sự nổi bật, là chế phẩm duy nhất chứa bào tử Bacillus
clausii kháng đa kháng sinh, và do sử dụng dạng bào tử nên vi khuẩn qua
dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả. Tuy
nhiên việc nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Bacillus clausii còn ít được quan
tâm. Vì vậy, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh
khối dưới dạng bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii” được thực hiện nhằm
giải quyết mục tiêu:
- Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối
dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Giới thiệu về chi Bacillus
 Từ Bacillus theo tiếng Latinh có nghĩa là hình que, do đó Bacillus còn
được gọi là trực khuẩn. Chi Bacillus gồm rất nhiều loài đã được biết đến như:
Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus globigii,
Bacillus natto, Bacillus clausii [15].

1.1.4. Bào tử và khả năng hình thành bào tử
 Bào tử (nội bào tử) của chi Bacillus được miêu tả lần đầu năm 1872
bởi Ferdinand Cohn khi nghiên cứu Bacillus subtilis và sau này của Koch khi
nghiên cứu mầm bệnh than do vi khuẩn Bacillus anthracis năm 1976 [12].

Hình 1.1. Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2. Bào tử Bacillus anthracis
Bào tử thường có dạng hình cầu hoặc elip, kích thước 0,8 - 1,4 µm chiều
dài, là thể nghỉ của vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng khi điều kiện sống
không thuận lợi. Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử lại nảy mầm phát triển
thành tế bào sinh dưỡng.
 Sự hình thành nội bào tử qua các bước:
- Trong tế bào sinh dưỡng ADN được phân chia thành nhiễm sắc thể
(chromosom) riêng biệt và màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào.
9

- ADN được bao bọc hoàn toàn bằng màng tế bào chất, thành bào tử
(nha bào) được hình thành và một phần vỏ cũng được hoàn thành.
- Vỏ bào tử được hình thành đầy đủ bao quanh ADN.
- Bào tử chín và được giải phóng ra ngoài tế bào [1]. Hình 1.3. Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii
 Quá trình hình thành bào tử rất phức tạp, mất khoảng 6-8 giờ, để có
thể tạo ra bào tử có cấu trúc vững bền chịu được hoàn cảnh khắc nghiệt.
 Đặc điểm bào tử vi khuẩn:

Hình 1.4. Cấu tạo bào tử
- Cấu trúc bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi
chứa ADN, các lớp bao bọc (gồm màng bào tử, thành bào tử, vỏ bào tử, áo
bào tử gồm 2 lớp áo trong và áo ngoài) chiếm tới 50% thể tích bào tử.

 Trong nông, lâm, ngư nghiệp :
- Chế tạo chế phẩm diệt côn trùng (bọ cánh cứng, bướm, ruồi, muỗi …)
từ các loài như Bacillus thuringiensis, Bacillus popiliae do các loài này có
khả năng xâm chiếm cơ thể côn trùng và sinh ra nội độc tố diệt côn trùng. Chế
phẩm sinh học tạo ra có khả năng diệt trừ sâu hại cao và ít gây ô nhiễm môi
trường.
- Tạo ra các chế phẩm sinh học từ các loài Bacillus subtilis, Bacillus
megatherium, Bacillus lichenliformis (chế phẩm Biochie) ứng dụng trong xử
lý nước nuôi thủy sản, có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, cải thiện môi
trường nước.
11

- Sản phẩm từ Bacillus subtilis có tác dụng hỗ trợ cây trồng, bổ sung
dinh dưỡng cho đất qua chu kỳ cacbon và chu kỳ nitơ của vi sinh vật, đồng
thời chống lại các vi sinh vật khác gây bệnh cho cây.
 Trong công nghiệp:
- Chất tẩy rửa: sử dụng enzym protease pH kiềm.
- Công nghiệp thuộc da.
 Trong dược phẩm, thực phẩm chức năng:
- Tạo ra các chế phẩm probiotic chống loạn khuẩn đường ruột, nhất là
sau khi sử dụng kháng sinh dài ngày.
- Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng một chủng Bacillus đơn độc
(Biosubtyl II chứa Bacillus subtilis của công ty vắc xin và sinh phẩm số 2),
hoặc kết hợp Bacillus với loài vi khuẩn có lợi khác (Bio-acimin).
1.2. Giới thiệu về Bacillus clausii
1.2.1. Đặc điểm sinh thái sinh sinh lý của Bacillus clausii
- Đặc điểm phân loại: Bacillus clausii thuộc
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus

o
C, Bacillus
clausii ATCC 31084 có nhiệt độ tối ưu là 37
o
C…[6], [11].
Về pH: khoảng pH nuôi cấy thích hợp là từ 7-10,5. Chủng Bacillus
claussii KSM-K16 có pH tối ưu là 9,0 [11].
Về dinh dưỡng: Bacillus clausii có thể sử dụng nhiều nguồn carbohydrat
khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2-ketogluconat…;
nguồn nitơ, phospho, các nguyên tố vi lượng…
Trong môi trường lỏng (canh thang): Bacillus clausii có thể kết thành
chuỗi hoặc dạng tế bào đơn độc. Trong môi trường đặc (thạch thường): tạo
khuẩn lạc màu trắng, viền hơi nhăn.
13 Hình 1.5. Bacillus clausii trên môi trường đặc
- Đặc điểm sinh hóa
Vi khuẩn Bacillus clausii có khả năng thủy phân được casein, gelatin và
tinh bột, nhưng không thủy phân được pullulan, Tween 20, 40 hoặc 60. Vi
khuẩn Bacillus clausii cho phản ứng oxidase, catalase dương tính, khử nitrat
thành nitrit.
- Bào tử và khả năng tạo bào tử
Trong điều kiện không thuận lợi, Bacillus clausii hình thành nội bào tử
(endospore) theo cơ chế và cấu trúc bào tử gồm nhiều lớp vỏ bọc bền vững
giống như các Bacillus khác. Bào tử của Bacillus clausii có dạng hình cầu,
kích thước 1,01±0,13 x 0,57± 0,05 μm [12].
Hình 1.6. Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử
phẩm sử dụng dạng bào tử vi khuẩn nên có nhiều ưu điểm là vi khuẩn qua
dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả. Hình 1.7. Chế phẩm Enterogermina
Chế phẩm Enterogermina chứa bốn loài Bacillus clausii, mỗi loài kháng
một số loại kháng sinh nhất định: O/C kháng chloramphenicol, N/R kháng
novobiocin và rifampicin, T kháng tetracycline, SIN kháng streptomycin và
neomycin [17].
Ngoài Enterogermina chứa bào tử Bacillus clausii còn một số chế phẩm
khác chứa Bacillus clausii như: Progemila, Erceflora, Bazivic, Probacin,
Enterum

Hình 1.8. Chế phẩm Erceflora Hình 1.9. Chế phẩm Bazivic

16

1.3. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
 Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả
năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát
triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển
đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục
đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất
tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men-misô) đã được nấu chín trộn hạt
cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia
là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều,
không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ
các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất
Xuất xứ
Natri clorid
Trung Quốc
Pepton
Trung Quốc
Cao thịt
Trung Quốc
2.1.2. Máy móc, thiết bị
Bảng 2.2. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị
Xuất xứ
Thiết bị
Xuất xứ
Tủ cấy
Sony clean bench (Nhật)
Tủ lạnh
Toshiba (Nhật)
Máy ly tâm
Rotofix (Đức)
Tủ sấy
Memmert (Đức)
Nồi hấp
ALP (Nhật)
Tủ lắc
Bioshake (Đức)
Đầu côn, cân kỹ thuật, bình nón, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, que trang,
giấy lọc
Nước máy
vừa đủ 100 ml
18

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh
khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
2.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh
khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối
Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina
Pha 50 ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml, đậy
bằng nút bông không thấm nước, hấp tiệt trùng ở 1atm trong vòng 15 phút, để
nguội đến nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy giống Bacillus clausii từ chế phẩm
Enterogermina vào bình nón trong tủ cấy vô trùng. Nuôi cấy trong máy lắc ở
37°C, 150 vòng/phút trong 24h. Sau 24h, vi khuẩn phát triển làm đục môi
trường.
Đối với Bacillus subtilis tiến hành cấy giống từ thạch nghiêng và nuôi
cấy tương tự với Bacillus clausii.
2.3.2. Giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường thạch thường, đun sôi cho đồng nhất các thành phần
trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6ml, nút kín, hấp tiệt trùng
ở 1atm trong 15 phút. Để nguội bớt rồi đặt nghiêng. Dùng que cấy vô trùng,
cấy giống Bacillus clausii trong bình đã hoạt hóa giống lên thạch nghiêng
theo hình ziczac trong tủ cấy vô trùng, để trong tủ ấm 37°C, trong khoảng

chuẩn bị, đem lắc ở 37
0
C với ba tốc độ lắc khác nhau là 100, 150 và 200
vòng/phút trong máy lắc. Sau thời gian 24h đem ly tâm dịch lên men, thu cắn
ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 - 20 phút. Xác định lượng sinh khối ướt
bằng cách cân cắn thu được. Mỗi thí nghiệm làm 3 lần để lấy kết quả trung
bình. Tiến hành so sánh với các mẫu cấy Bacillus subtilis.
20

2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả
năng tăng sinh khối
Chuẩn bị 50ml môi trường lên men canh thang, hấp tiệt trùng ở 1atm
trong 20 phút. Cấy 5 ml dịch nhân giống Bacillus clausii vào môi trường đã
chuẩn bị, đem lắc ở hai nhiệt độ khác nhau 30
0
C và 37
0
C với cùng một tốc độ
trong máy lắc. Sau thời gian 24h đem ly tâm dịch lên men, thu cắn ở tốc độ
4000 vòng/phút trong 15 - 20 phút. Xác định lượng sinh khối bằng cách cân
cắn thu được. Mỗi thí nghiệm làm 3 lần để lấy kết quả trung bình. Tiến hành
so sánh với các mẫu cấy Bacillus subtilis.
21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
- Mục đích
Xây dựng đường cong sinh trưởng, xác định thời điểm thu sinh khối của
Bacillus clausii cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Tiến hành

0.8
1
1.2
0 16 24 40 48 64 72 80 96
Thời điểm (h)
Lượng sinh khối (g)

Hình 3.1. Sơ đồ biểu diễn đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii
- Nhận xét
Dựa vào đường cong sinh trưởng, ta nhận thấy thời điểm từ 16 – 40h
lượng sinh khối của B. clausii tăng dần theo thời gian. Lượng sinh khối thu
được lớn nhất là 1,10g tại thời điểm 40h (lớn hơn 12% so với 24h). Kể từ giờ
thứ 40, lượng sinh khối giảm dần, đạt thấp nhất là 0,92g tại thời điểm 88 –
96h (ít hơn 6,5% so với 24h). Kết quả này tương tự với kết quả của Nguyễn
Thị Bích Ngọc [3] khi cho thấy sinh khối tăng nhanh theo thời gian tại thời
điểm 24 – 36h đầu. Theo một công bố khác của Nguyễn Thị Hiền [4], bào tử
bắt đầu xuất hiện sau 40 – 48h nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tự
nhiên (môi trường không bổ sung Mn
2+
, không xử lý nhiệt để thu bào tử).
Trong nghiên cứu này, hiện tượng lượng sinh khối của Bacillus clausii tại thời
điểm 40h bắt đầu giảm dần so với giá trị lớn nhất cũng có thể được giải thích
dựa vào đặc điểm hình thành bào tử của chúng.
Hơn nữa, cũng theo Nguyễn Thị Hiền [4], nếu có phương pháp xử lý phù
hợp thì hoàn toàn có thể chuyển dạng tế bào sinh dưỡng thành bào tử với hiệu
suất rất cao. Do đó, trong nghiên cứu này, việc khảo sát điều kiện để thu được
lượng bào tử lớn nhất được đưa về khảo sát điều kiện để thu được lượng sinh
88
23


24h.