BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN NGỌC ÁNH
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ
NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN
Bacillus subtilis natto
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC ÁNH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ
NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN
Bacillus subtilis natto
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2
1.1.1. Phân loại khoa học 2
1.1.2. Nguồn gốc 2
1.1.3. Đặc điểm hình thái 2
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng 3
1.1.5. Đặc điểm sinh lý 3
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto 3
1.2. Natto và Nattokinase 4
1.2.1. Natto 4
1.2.2. Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase 5
1.2.3. Nattokinase 6
1.3. Quá trình lên men sản xuất enzym 10
1.3.1. Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật 10
1.3.2. Thu nhận chế phẩm enzym 11
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym 11
1.4. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh
enzym Nattokinase của vi khuẩn 12
1.4.1. Ngoài nước 13
1.4.2. Trong nước 13

khuẩn sinh ra 22
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ chế phẩm Natto 22
3.1.2. Xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra 23

3.1.3. Xác định enzym trong sản phẩm Natto 25
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của
vi khuẩn B. subtilis natto 26
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon 26
3.2.2. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất 30
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng 32
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ 34
3.2.5. Xây dựng môi trường tổng hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh
protease 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39


Bảng 3.6. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong
30

môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các
nồng độ khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải
casein
Bảng 3.7. Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi
nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ
khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất
31
Bảng 3.8. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong
môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung đậu tương và
casein thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất
32
Bảng 3.9. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong
môi trường MT2 và MT2 có bổ sung một số muối vô cơ, thể hiện
bằng đường kính vòng phân giải cơ chất
34
Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong
môi trường MT2 và môi trường tổng hợp, thể hiện bằng đường
kính vòng phân giải cơ chất
36
Bảng 3.11. Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi
nuôi cấy trong môi trường canh thang và môi trường tổng hợp
37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ
1 B. subtilis natto Bacillus subtilis natto
2 E. coli Escherichia coli
3 CU Caseinolytic units
4 FU Fibrinolytic units
5 U Unit
6 t- PA Tissue plasminogen activator
7 γ – PGA γ - polyglutamat
8 Na CMC Natri carboxymethylcellulose 1

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông như chứng

1.1.1. Phân loại khoa học
B. subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc:
Họ (Family): Bacillaceae
Chi (Genus): Bacillus
Loài (Species): Bacillus subtilis
Phân loài (Subspecies): Bacillus subtilis natto [32].
1.1.2. Nguồn gốc
B. subtilis natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn truyền
thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis natto có nhiều trong
rơm rạ, cỏ khô và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương; vi khuẩn
này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo
biển, cá, thịt, tôm, cua [13], [22].
1.1.3. Đặc điểm hình thái Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto [27], [30]

B. subtilis natto là trực khuẩn hiếu khí, bắt màu Gram dương, nội bào tử hình que
có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành
3

chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn và hình
dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt
thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [20],[ 22].
1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose , đường đôi như maltose, lactose,
saccharose , polysaccharid như tinh bột Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển
của vi khuẩn là protein và aminoacid. B. subtilis natto có thể sử dụng dễ dàng acid
glutamic, arginine, acid aspartic nhưng không sử dụng được threonine, trypophan,

hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tim mạch [19].

Bảng 1.1: Thành phần chính trong 100g natto: [15], [24]
Thành phần Hàm lượng
Calorie 200 Kcal
Protein 16,5 g
Lipid 10,0 g
Đường 9,8 g
Nattokinase 7100 CU
Vitamin B1 0,07 mg
Vitamin B2 0,56 mg
Vitamin B3 1,1 mg
Vitamin K2 870 μg
Calci 90 mg

Từ hàng ngàn năm trước, Natto đã trở thành món ăn không thể thiếu của người
Nhật do nó chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe, có lợi cho tiêu hóa, tim mạch
và là một trong những món ăn làm tăng tuổi thọ của người Nhật. Vì thế, nhiều
nghiên cứu về Natto đã được tiến hành.
Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được hai loại vi khuẩn
từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi
hương đặc biệt và vi khuẩn Bacillus mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt đặc
trưng và vị ngọt [21]. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình
5

qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis
natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh
dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi
khuẩn B. subtilis natto [21].
Năm 1986, tiến sĩ Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác

thận bào thai, hoặc có thể sản xuất bằng công nghệ gen.
-Anistreplase (APSAC): là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công
nghệ sinh học [1], [2].
b. Enzym tiêu huyết khối tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những enzym hoạt hóa
plasminogen gắn trên fibrin nên có ưu điểm là ít gây chảy máu toàn thân, hiệu lực
tiêu fibrin mạnh hơn và không gây dị ứng khi sử dụng. Tuy nhiên, do sản xuất bằng
công nghệ cao nên giá thành của chúng khá đắt. Một số enzym điển hình của nhóm
này như:
- Alteplase (t-PA): có nguồn gốc từ các tế bào nội mạc của thành mạch, được tiết
ra trong hầu hết dịch ngoại bào của cơ thể như huyết tương, nước tiểu, nước bọt,
nước mắt Alteplase trong lâm sàng được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN
từ tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc và gọi là rt- PA.
- Pro-urokinase: là tiền chất của Urokinase, có trong nước tiểu. Pro-urokinase
được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp từ vi khuẩn E. Coli.
Mặc dù một số enzym đề cập ở trên được sử dụng rộng rãi trong điều trị huyết
khối hiện nay, chúng vẫn có nhược điểm, chẳng hạn như chi phí cao, thời gian bán
thải ngắn, nguy cơ chảy máu toàn thân, riêng Streptokinase còn gây phản ứng dị
ứng [9]. Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong tảo, nấm và thực phẩm
lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối an toàn và
giá rẻ [9].
1.2.3. Nattokinase
a. Nguồn gốc
Nattokinase (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất
mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật Bản có tên là Natto [23].
7

Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP, enzyme trong Natto
[32].
b. Đặc điểm cấu tạo
Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid đơn gồm 275 gốc acid amin và

[ 9].
d. Cơ chế tiêu fibrin
Nattokinase phân huỷ fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác
nhau:
8Hình 1.3 . Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase [19]

A. Nattokinase trực tiếp giáng hoá fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin từ
dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hoá có trọng lượng phân tử thấp,
hoà tan. Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
B. Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá Pro-urokinase thành
Urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm
tăng plasmin nội sinh là enzyme phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể.
C. Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá quá trình tổng hợp t-
PA (Alteplase) trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.
Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từ
fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể. Vì
vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu
bình thường [19].
e. Công dụng
Nattokinase có tác dụng phòng và phá các cục máu đông do có khả năng tiêu
fibrin một cách hữu hiệu (cao gấp 4 lần plasmin), đồng thời rất an toàn cho cơ thể
khi hấp thụ qua đường uống [23]. Nattokinase có thể hòa tan cục máu đông khi
uống 100mg/ ngày và tác dụng của nó kéo dài 8- 12 giờ. Do ưu điểm an toàn, hiệu
lực cao, giá rẻ hơn rất nhiều so với các thuốc tan huyết khối thông thường,
9

Nattokinase có tiềm năng lớn trong trị liệu huyết khối [21],[28]. Ngoài ra,

plus Fucoidan
2.000 Viên nang Umeken, Nhật Bản
10

1.3. Quá trình lên men sản xuất enzym
1.3.1. Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật
a. Phương pháp lên men bề mặt
Đây là phương pháp chủ yếu sử dụng cơ chất là các loại cám và bột: cám mì,
cám gạo, bột đậu, bột ngô được hấp chín và làm ẩm sau đó trộn thêm trấu và mùn
cưa để tăng độ xốp. Vi sinh vật được nuôi ở nhiệt độ khoảng 28- 30°C, độ ẩm 55-
65%, trong thời gian nuôi từ 36- 48 giờ.
Ưu điểm của phương pháp lên men bề mặt là :
- Nồng độ enzym cao hơn lên men chìm.
- Dễ sấy khô và ít hao tổn hoạt tính enzym.
- Chế phẩm thô dễ vận chuyển.
- Thiết bị đơn giản, tốn ít năng lượng.
- Có thể xử lý cục bộ khi bị nhiễm.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm đó là khó kiểm soát chính xác
độ ẩm, sinh khối, lượng O
2
, CO
2
nên chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng
đều, tốc độ sản xuất sản phẩm thấp hơn lên men chìm, khó cơ giới hóa, tự động
hóa, cần diện tích nuôi lớn [4], [5]. Hiện nay, phương pháp lên men bề mặt ít
được sử dụng trong sản xuất kháng sinh và các chế phẩm sinh học nhưng vẫn được
sử dụng trong lên men sản xuất enzym [4].
b. Phương pháp lên men chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất là tinh bột, nitơ, chất
khoáng Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các

protease, maltase, pectinase nhưng nếu nuôi cấy trên môi trường Czapek cải tiến
với nitrat và tinh bột thì chỉ tạo thành chủ yếu là α – amylase, còn các enzym khác
tạo thành với lượng không đáng kể.
Hiện tượng này chỉ thấy ở vi sinh vật chứ không thấy ở động và thực vật. Khi
trong môi trường có những chất khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường
những enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được. Vì
12

vậy khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng sinh tổng hợp
enzym của vi sinh vật có thể tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường.
Trong công nghệ sản xuất enzym cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và
xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao
nhất [4], [5].
b. Ảnh hưởng của pH của môi trường
pH môi trường biến đổi khá rõ rệt trong quá trình nuôi cấy và gây ảnh hưởng lớn
đến sự tổng hợp enzym. Do đó người ta thường điều chỉnh pH để thu được enzym
với hiệu suất cao nhất. Mỗi loại enzym thường được tổng hợp mạnh trong một vùng
pH xác định đối với từng loại vi sinh vật. Ví dụ: amylase và pectinase của nấm mốc
được tổng hợp mạnh trong môi trường có pH= 4,5 - 5,0 còn protease thì pH=6 - 6,5
[4], [6].
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Phần lớn các vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzym đều thuộc loại ưa nhiệt
trung bình, có nhiệt độ tối thích 22- 32
o
C, một số vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ cao
hơn (35-55
o
C) và chúng có khả năng tổng hợp các enzym có độ bền nhiệt cao. Khi
nâng nhiệt độ môi trường tới quá mức thích hợp thì khả năng sinh tổng hợp enzym
bị giảm rõ rệt [4], [6].


0,64 và cao nấm men: 0,74 [18].
Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp
Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Các nhân tố được chọn để khảo sát: glucose,
pepton, MgSO
4
, và CaCl
2
ở 5 mức độ. Hoạt tính đạt 3.194 U/ml với thành phần môi
trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO
4
0,2% và CaCl
2
0,5% [10]. Li Hui
Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất Nattokinase từ vi khuẩn
Bacillus subtilis natto gồm: MgSO
4
0,02%, K
2
HPO4 0,02%, KH
2
PO4 0,01%, CaCl
2

0,05%, maltose 3%, peptone từ đậu nành: 3% [16].
1.4.2. Trong nước
Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus
sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme làm tan huyết
khối (Nattokinase) từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Viện
Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực phẩm Natto; hoạt tính Nattokinase và

14 MgSO
4
Trung Quốc
15 CaCl
2
Trung Quốc
16 MnCl
2
Trung Quốc
17 Dung dịch Lugol Trung Quốc
2.1.3. Các môi trường sử dụng:
 Môi trường thạch thường (MT1):
15

Pepton 1,0 g
Cao thịt 0,5 g
NaCl 0,5 g
Thạch bột 2 g
Nước máy vđ 100ml
 Môi trường canh thang (MT2):
Pepton 1,0 g
Cao thịt 0,5 g
NaCl 0,5 g
Nước máy vđ 100ml
2.1.4. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng
Thiết bị Nguồn gốc
Tủ cấy UV Bioair Italy
Tủ ấm Memmert Đức
Tủ sấy Memmert Đức