21 và có đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (môi trƣờng chỉ thích hợp với một vài loài vi
khuẩn) [44], [50].
Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, còn nhiều bằng chứng cho thấy
mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng không phải là mối quan
hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khoáng chất từ cây,
đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hoá và chuyển hoá quan trọng ở cây chủ.
Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp
amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo
hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp
chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hóa một số
cơ chất không cần thiết ở thực vật thành sản phẩm có giá trị [35].
Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích
sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9].
Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn
Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trƣờng nuôi cấy in vitro
tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật. Thuốc lá, cây lanh và
khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển
mạnh) [39], [40].
Năm 1994, Holland và cộng sự công bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn
Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hoá nickel [35].
Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây có mối quan hệ mật thiết với
các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn
Methylobacterium sp. có tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây
lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo.
Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng
Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ:
nuôi cấy mô, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong môi
trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. có khả năng

quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp. có tác dụng khác nhau nhƣ tăng chiều
cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi. Vi khuẩn Methanotropic có ảnh hƣởng đến sự
23 hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh
cây [40]. Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên môi trƣờng nuôi
cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39]. Từ
những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ tƣơng hỗ
có lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trƣởng của thực vật trong
điều kiện in vitro và in vivo.
2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin
Không chỉ có thực vật mà vi sinh vật cũng có thể tổng hợp auxin và
cytokinin, đối với các vi khuẩn có lợi và vi khuẩn tƣơng tác với thực vật thì đây có
thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển.
Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi trƣờng
chứa dịch nổi của PPFM bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân
tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) đã chứng
tỏ vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50].
Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự
phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM có ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin có
trong mô tế bào thực vật [35].

24 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

C

Đặc điểm
Chủng 1019
Màu sắc khuẩn lạc trên MMS
Hồng nhạt
Đƣờng kính khuẩn lạc
2-3 mm
Hình dạng khuẩn lạc
Tròn, lồi, nhầy, có viền trắng
bên ngoài
Kích thƣớc tế bào
2-4 x 4-6 m
Khả năng di động
Có
Gram
-
pH thích hợp
5,8 ± 1
Nhiệt độ
25-35
o
C

Hình dạng tế bào
Dấu phẩy, phình to ở hai đầu

Trong giới hạn nồng độ các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật thƣờng sử
dụng trong môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật, thì nồng độ các chất điều hoà
tăng trƣởng thực vật không ảnh hƣởng tới sự phát triển của chủng 1019, do vậy

+
Citrate
+
L-Glutamate
+
D-Glucose
+
D-Xylose,
L-arabinose
+
Fructose
+
Betaine
+
Tartrate
+
Serbacate
+
27 Ethanol
+
Nutrient agar
+
Lactose
+
Sucrose
+



3.2.5 Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)
(Phụ lục 1).
Môi trƣờng phân lập và làm thuần chủng 1019 là môi trƣờng MMS
(methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Môi trƣờng MMS đƣợc thanh trùng bằng
cách hấp ở nhiệt độ 121
o
C trong 20 phút, sau đó để nguội và bổ sung methanol
vào môi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, môi trƣờng rắn có bổ sung agar 20g/l
trƣớc khi hấp. Hầu hết các chủng PPFM đều không cần vitamine hay các nhân tố
tăng trƣởng khác trong quá trình tăng sinh.
Môi trƣờng giữ giống chủng 1019 là môi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ
lục 3).
* Các môi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
o
C trong 20 phút.
Các thành phần khác:
- Đƣờng: 20g/l
- Agar: 7g/l
pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 – 5,8
Các chất kích thích sinh trƣởng:
- BAP (6- benzylamino purine)
- NAA (α- naphthaleneacetic acid)

3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo)
Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khi khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng MS + 2
mg/l 2,4- D để tạo mô sẹo [16].


dụng mô sẹo làm vật liệu thí nghiệm.

30 Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên môi trƣờng tạo sẹo

3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn
Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng MMS (sử dụng
phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 10
10
tế bào/ml), lắc ở 37
o
C sau 87 giờ, sử dụng
để bổ sung vào môi trƣờng thí nghiệm.

3.3.3 Nội dung thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số mẫu ở
mỗi nghiệm thức là 30 mẫu.
* Xử lý số liệu:
Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC,
sau đó dựa vào giá trị Prob trong bảng ANOVA để quyết định nên trắc nghiệm
phân hạng hay không. Nếu có, dùng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan, ở
mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết quả thí nghiệm.

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo
của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt nhất cho khả năng nhân
sẹo ở giống lúa VĐ20.
Theo Đoàn Thị Phƣơng Thùy [6] có sự khác nhau giữa nồng độ auxin thích

NT6: MTN + 2 mg/l BAP + 1mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tạo chồi từ mô sẹo, 7 ngày theo dõi 1
lần. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = (số mẫu tái sinh / số mẫu cấy)*100
số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu

3.3.3.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ
từ mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh rễ
từ mô sẹo.
32 Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA.
Mẫu cấy: mô sẹo
NT1: MTN + 0,5 mg/l NAA
NT2: MTN + 1 mg/l NAA
NT3: MTN + 1,5 mg/l NAA
NT4: MTN + 2 mg/l NAA
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo ở các nồng độ
nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100
số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu

3.3.3.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo
của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo
mô sẹo của giống lúa VĐ20.
Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng + 2mg/l 2,4-D.
Mẫu cấy: hạt lúa đã khử

màu sắc.

3.3.3.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi
từ mô sẹo của giống lúa VĐ20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh chồi từ mô sẹo.
Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ BAP/
NAA thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 2)
Mẫu cấy: mô sẹo
Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào môi trƣờng
thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn.
NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS
NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
34 NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn
NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ở các nồng độ
nhiễm khuẩn khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu:
tỷ lệ nảy chồi(%) = (số cây nảy chồi / tổng số cây)*100
số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu

3.3.3.7 Thí nghiệm 7 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ
mô sẹo của giống lúa VĐ 20”
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái
sinh rễ từ mô sẹo.
Môi trƣờng nền: khoáng MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA
thich hợp (kết quả từ thí nghiệm 4)
Mẫu cấy: mô sẹo

36 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của
giống lúa VĐ20”
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần
nuôi cấy
Nghiệm
thức
2,4-D (mg/l)

BAP (mg/l)

NAA (mg/l)

Kích thƣớc mô sẹo
(cm) sau 4 tuần
1.1
0
0,5
1
0,91
c

1.2
1
0,5

0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1.1 1.2 1.3 1.4
Nghiệm thức
cm

Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau
37 Sau 4 tuần nuôi cấy, theo bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức (1.1) có kích
thƣớc mô sẹo lớn nhất và có sự khác biệt rõ rệt so với các nghiệm thức còn lại. Sự
khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Bên cạnh đó các mẫu
mô sẹo của nghiệm thức (1.1) có mô phát triển tốt, xốp, mô sẹo sinh phôi và có
xuất hiện chồi, còn các mẫu mô sẹo của các nghiệm thức còn lại tuy có phát triển
về kích thƣớc nhƣng mô sẹo chuyển sang màu vàng nâu và cứng, ít có khả năng
tái sinh cây.
Theo tác giả Đoàn Thị Phƣơng Thuỳ [6], các dòng lúa khác nhau có các đặc
tính di truyền khác nhau vì vậy nhu cầu chất điều hòa tăng trƣởng thực vật cho sự
hình thành và tăng trƣởng mô sẹo là khác nhau. Có lẽ, nồng độ auxin ngoại sinh
trong nghiệm thức (1.1) là thích hợp, không cần bổ sung thêm 2,4-D vào môi
trƣờng, mô sẹo của giống lúa VĐ20 vẫn tăng trƣởng và phát triển tốt hơn so với
các nghiệm thức khác.
Qua bảng 4.1, nghiệm thức (1.1) cho kết quả tốt nhất, do đó nghiệm thức
này đƣợc chọn sử dụng cho thí nghiệm 4.


ab

2.2
1
0,5
50
ab

66,66
ab

2.3
1
1
58,33
ab

58,33
ab

2.4
2
0,1
33,33
a

33,33
a

2.5

0
10
20
30
40
50
60
70
80
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6
Nghiệm thức
Tỷ lệ (%)
tuần 2
tuần 3

Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian

Nhìn chung tỷ lệ tái sinh chồi khá cao. Theo kết quả thống kê, tỷ lệ tái sinh
chồi của các nghiệm thức đều tăng chỉ có ở 2 nghiệm thức (2.3) và (2.4) là không
tăng, và nghiệm thức (2.6) có tỷ lệ tái sinh cao nhất. Sự khác biệt này không có ý
nghĩa về mặt thống kê (P>0,05). Từ kết quả bảng cho thấy, tỷ lệ nồng độ giữa
BAP và NAA quá cao sẽ gây ức chế sự tái sinh chồi, nhƣ nghiệm thức (2.4) mô
sẹo không những tái sinh chồi ít mà một số mẫu bị đen không phát triển, do đó
việc kết hợp thích hợp tỷ lệ nồng độ BAP và NAA sẽ giúp mô sẹo tái sinh tốt.
40
2.3
1
1
1,91
b

2,41
b

2.4
2
0,1
0,66
a

0,66
a

2.5
2
0,5
1,66
ab

2,16
b

2.6
2
1


Số chồi hình thành ở mỗi nghiệm thức đều tăng theo thời gian. chỉ có
nghiệm thức (2.4) số chồi hình thành rất ít và không tăng (2,66). Ở nghiệm thức
(2.3) mặc dù tỷ lệ tái sinh ở tuần thứ 3 không tăng so với tuần thứ 2 (bảng 4.2),
nhƣng số chồi lại tăng rõ rệt, có thể ở tỷ lệ nồng độ này ức chế sự tái sinh chồi
nhƣng không ảnh hƣởng đến sự hình thành và phát triển của mẫu đã tái sinh. Sau 3
tuần, ở các nghiệm thức (2.2); (2.3); (2.5), (2.6) số chồi hình thành có sự khác biệt
so với các nghiệm thức còn lại và so với tuần thứ 2. Sự khác biệt này không có ý
nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Tỷ lệ Cyt/Aux có ảnh hƣởng rất quan
trọng, nó quyết định chiều hƣớng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [6], do đó
với tỷ lệ Cyt/Aux trong môi trƣờng thích hợp sẽ kích thích sự tạo chồi của mô sẹo.
Điều này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây: hoạt động của một chất điều hoà
tăng trƣởng phụ thuộc vào:
- Sự cân bằng giữa các chất điều hoà tăng trƣởng thực vật trong mô đích.
- Loại mô đích và trạng thái sinh lý của mô đích.
[3]
Qua 2 bảng 4.2 và 4.3 cho thấy nghiệm thức (2.6) cho tỷ lệ tái sinh chồi và
số chồi hình thành cao nhất nên ta sẽ sử dụng kết quả nghiệm thức này cho thí
nghiệm 6.

42

0,5
58,33
a

2,08
a

3.2
1
91,66
a

4,16
a

3.3
1,5
83,33
a

4,25
a

3.4
2
83,33
a

2,66
a


Theo bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ tái sinh rễ rất cao, 3 nghiệm thức (3.2), (3.3),
(3.4) có sự khác biệt rõ ràng so với nghiệm thức (3.1), sự khác biệt này không có ý
nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Nhƣ vậy nồng độ NAA cao sẽ kích thích
sự tái sinh rễ tốt hơn. Ở nghiệm thức (3.4) có tỷ lệ tái sinh rễ rất cao (83.33%)
nhƣng số rễ trên mẫu lại thấp, có thể ở nồng độ này kích thích sự tái sinh rễ từ mô
sẹo nhƣng lại hạn chế sự phát triển rễ từ mẫu tái sinh. Sau 4 tuần nuôi cấy ở 3
nghiệm thức (3.1), (3.2), (3.3), một số mô sẹo xuất hiện chồi, còn nghiệm thức
(3.4) không có chồi xuất hiện, có thể do nồng độ NAA cao đã ức chế sự tạo chồi
của mô sẹo.
Hai nghiệm thức (3.2), (3.3) đều có tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ trên mẫu cao,
không có sự khác biệt về mặt thống kê, nhƣng ở nghiệm thức (3.3) rễ phát triển
nhiều và tốt hơn. Nên ta chọn kết quả của nghiệm thức (3.3) sử dụng cho thí
nghiệm 7. Hình 4.5: Mô sẹo tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần
nuôi cấy

1 cm
45
Hình 4.6: Các mẫu mô tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuôi cấy

4.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên mô sẹo của giống lúa VĐ
20”
Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa
Nghiệm thức