BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THÚY
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
NHŨ TƯƠNG NANO
NHỎ MẮT CHỨA DICLOFENAC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÚY
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ
NHŨ TƯƠNG NANO
NHỎ MẮT CHỨA DICLOFENAC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Thúy
MỤC LỤC
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Thông tin về dược chất acid diclofenac 2
1.1.1. Công thức hóa học 2
1.1.2. Điều chế 2
1.1.3. Đặc tính lý hóa 2
1.2. Thuốc nhỏ mắt 3
1.2.1. Định nghĩa 3
1.2.2. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt 3
1.2.3. Thuốc nhỏ mắt chứa diclofenac 4
3.1.4. Xác định độ chụm 28
3.1.5. Kết luận 28
3.2. Bào chế nhũ tương nano và xác định thời gian đồng nhất hóa thích hợp 29
3.2.1. Bào chế nhũ tương nano bằng phương pháp siêu âm kết hợp đồng nhất
hóa ở áp suất cao 29
3.2.2. Bào chế nhũ tương nano bằng phương pháp siêu âm kết hợp đồng nhất
hóa phân cắt tốc độ cao 30
3.2.3. Bào chế nhũ tương nano bằng phương pháp siêu âm 32
3.3. Xác định tỷ lệ dược chất được nhũ tương hóa 33
3.4. Đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro 33
3.5. Bào chế nhũ tương nano ở quy mô 1 lít bằng phương pháp siêu âm 35
3.5.1. Khảo sát sự thay đổi kích thước tiểu phân của nhũ tương nano theo thời
gian siêu âm 36
3.5.2. Khảo sát sự thay đổi tỷ lệ dược chất được nhũ tương hóa theo thời gian
siêu âm 38
3.5.3. Khảo sát sự thay đổi mức độ giải phóng dược chất in vitro theo thời
gian siêu âm 39
3.6. Đánh giá sự thay đổi một số thông số của nhũ tương nano trong điều kiện
lão hóa cấp tốc 1 tháng 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
PP BC Phương pháp bào chế
SA Siêu âm
SD
Standard deviation
Độ lệch chuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu về nhũ tương nano dành cho nhãn khoa 12
Bảng 1.2: Một số chế phẩm nhũ tương nano trên thị trường 15
Bảng 1.3: Các nghiên cứu về nhũ tương nano nhỏ mắt chứa diclofenac 15
Bảng 1.4: Công thức NTN được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 17
Bảng 2.1: Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 18
Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid diclofenac 26
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC 27
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp HPLC 28
Bảng 3.4: Kết quả sự thay đổi KTTP theo thời gian ĐNH của các NTN bào chế
bằng phương pháp siêu âm kết hợp ĐNH ở áp suất cao 29
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát thời gian ĐNH thích hợp và KTTP của các NTN bào
chế bằng phương pháp siêu âm, siêu ấm kết hợp ĐNH ở áp suất cao 30
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự thay đổi KTTP theo thời gian ĐNH của NTN CT 4
bào chế bằng phương pháp ĐNH phân cắt tốc độ cao 31
Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng DC trong mẫu NTN bào chế bằng phương pháp siêu
âm. 32
Bảng 3.8: Kết quả tỷ lệ DC được nhũ tương hóa của các mẫu NTN 33
Bảng 3.9: Kết quả tỷ lệ DC giải phóng từ NTN trong 4 giờ sử dụng màng thẩm tích
12000 Dalton 34
các mẫu NTN bào chế ở quy mô 1 lít có thời gian siêu âm khác nhau 40
Hình 3.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ DC giải phóng in vitro của NTN sau thời gian bảo
quản 1 tháng ở 40±2ºC, độ ẩm 75±5% và NTN mới bào chế. 42
Hình P1: Kết quả phân bố kích thước tiểu phân mẫu NTN CT 1……………… PL1
Hình P2: Kết quả phân bố kích thước tiểu phân mẫu NTN CT 2……………… PL1
Hình P3: Kết quả phân bố kích thước tiểu phân mẫu NTN CT 3……………… PL1
Hình P4: Kết quả phân bố kích thước tiểu phân mẫu NTN CT 4……………… PL1
Hình P5: Kết quả thế zeta mẫu NTN CT 4……………………………………….PL2
Hình P6: Sắc đồ của dung dịch acid diclofenac chuẩn………………………… PL3
Hình P7: Sắc đồ mẫu NTN CT 1…………………………………………………PL3
Hình P8: Sắc đồ mẫu xác định hàm lượng DC được nhũ tương hóa CT 1………PL3 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc nhỏ mắt là dạng bào chế chiếm 90% các dạng thuốc điều trị các bệnh
về mắt và được người tiêu dùng chấp nhận vì sự tiện dụng của nó [38]. Tuy nhiên,
sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thường rất thấp (chỉ khoảng 1% - 3%) do tác động
của cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ thống nước mắt và bản chất cấu tạo các lớp mô
giác mạc [2]. Hơn nữa, sự hấp thu toàn thân của lượng thuốc thoát qua đường mũi –
lệ có thể gây ra một số tác dụng không mong muốn.
Diclofenac là dẫn chất của acid phenylacetic, thuộc nhóm thuốc chống viêm
không steroid, có tác dụng chống viêm, hạ sốt, giảm đau mạnh. Tuy nhiên, trên thị
trường diclofenac dùng cho nhãn khoa mới chỉ có dạng dung dịch nhỏ mắt 0,1%,
thời gian tác dụng ngắn nên người bệnh phải dùng thuốc ít nhất 3 – 5 lần một ngày.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy thuốc nhỏ mắt nhũ tương nano khắc phục
được những nhược điểm nêu trên của thuốc nhỏ mắt dạng dung dịch. Trên thị
trường thế giới đã có chế phẩm Cationorm
®
(Novagali Pharma, Pháp) là nhũ tương
1.1.3. Đặc tính lý hóa
Tính chất vật lý:
- Cảm quan: bột kết tinh màu trắng hoặc gần trắng, hút ẩm nhẹ.
- Độ tan:
Tan rất kém trong nước, độ tan trong nước ở 25ºC thay đổi tùy theo giá trị
pH từ 17,8 – 1771 µg/mL [33].
Tan tốt trong dầu thực vật (dầu thầu dầu, dầu oliu, dầu vừng…) [11]. Không
tan/hexan, toluen; ít tan/cloroform; tan tốt/methanol; tan rất tốt/dimethyl sulfoxyd,
dimethyl formamid [51].
- Hệ số phân bố dầu nước (n-octanol/nước): log P = 1,69 [44].
Hình 1.1: Công thức cấu tạo
acid diclofenac [34]
Tên khoa h
ọ
c
:
Acid 2-[(2,6- diclorophenyl)amino]benzeneacetic
Công thức phân tử: C
14
H
11
Cl
2
NO
2
Khối lượng phân tử: 296,15
1.2.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt
Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt thường rất thấp. Chỉ có khoảng 1% - 3% lượng
DC có trong liều thuốc đã đưa vào mắt là thấm được qua giác mạc và phân bố đến
nơi tác dụng tại các khoang ở trong mắt. Đó là do tác động của cơ chế bảo vệ sinh
lý của hệ thống nước mắt và bản chất cấu tạo các lớp mô của giác mạc [1], [2], [29].
1.2.2.2. Các biện pháp cải thiện sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt
- Tăng thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: chất làm tăng độ nhớt, chất
kết dính sinh học, bào chế thuốc nhỏ mắt dạng hỗn dịch, thuốc mỡ tra mắt…[1], [2]. 4
- Tăng tính thấm của giác mạc đối với DC: chất tạo phức chelat với ion calci
(natri edetat), CDH (Tween 80, Cremophor), tạo ra các tiền thuốc [1], [2].
- Hiện nay, các hệ tiểu phân như: vi cầu, vi nang, hỗn dịch, nhũ tương,
liposom, tiểu phân chứa trong kính tiếp xúc,… có kích thước nm đến µm sử dụng
cho nhãn khoa đang được tập trung nghiên cứu nhiều, trong đó NTN với đặc điểm
riêng về cấu trúc, tính chất đã được chứng minh là có khả năng kéo dài thời gian tác
dụng của thuốc, thấm sâu hơn vào các tổ chức bên trong mắt, tăng sinh khả dụng và
hiệu lực điều trị, giảm số lần sử dụng thuốc cho người bệnh [42], [12].
1.2.3. Thuốc nhỏ mắt chứa diclofenac
Hiện nay trên thị trường, thuốc nhỏ mắt chứa diclofenac chỉ có dạng dung dịch
natri diclofenac 0,1%. Ví dụ: biệt dược Voltaren Ophtha (Novartis – Thụy Sĩ) [9].
1.3. Nhũ tương nano (Nano-emulsion)
1.3.1. Định nghĩa
Nhũ tương nano là một hệ phân tán cơ học vi dị thể, trong suốt, trong mờ hoặc
đục như sữa, được hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất
lỏng là pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) được phân tán vào chất lỏng thứ
hai là môi trường phân tán (pha ngoại, pha liên tục) dưới dạng các tiểu phân có kích
thước hầu hết nằm trong khoảng 20 – 200 nm [1], [24], [49], [25].
1.3.2. Thành phần
vào buồng tương tác, hai dòng chất lỏng được tăng tốc do sự giảm đột ngột của
đường kính ống dẫn. Sau đó, hai dòng chất lỏng va chạm từ hai hướng ngược nhau
dẫn đến sự phá vỡ các giọt ban đầu thành các giọt nhỏ hơn [18], [56], [36].
- Kĩ thuật Dissocubes: dựa trên nguyên tắc ĐNH piston khe hẹp (piston-gap). Ở các
thiết bị này, nhũ tương được đẩy bởi piston dưới áp lực lớn (1500 – 2000 bar) qua
một khe hẹp kích thước vài µm. Áp suất động của dòng chất lỏng tăng, áp suất tĩnh
giảm xuống dưới áp suất hơi của nước ở nhiệt độ phòng. Kết quả, nước bắt đầu sôi
tại nhiệt độ phòng, hình thành các bong bóng khí, chúng bị nổ tung khi nhũ tương đi
qua khe đồng nhất và trở lại áp suất không khí bình thường. Lực nổ của bong bóng
khí đủ để phá vỡ các giọt nhũ tương thành các tiểu phân nano [47]. 6
(a) (b)
Hình 1.2: Phương pháp ĐNH ở áp suất cao [36]
(a)- Kĩ thuật tia ngược dòng
(b)- Kĩ thuật piston khe hẹp
Phương pháp siêu âm:
- Sự nhũ hóa bằng phương pháp siêu âm xảy ra qua 2 cơ chế. Thứ nhất, sóng âm tạo
ra dao động bề mặt phân cách pha, dẫn đến sự phân tán pha dầu vào trong pha nước
tạo thành các giọt nhũ tương [27]. Thứ hai, lực cơ học chủ yếu được tạo ra bởi quá
trình hình thành và phá vỡ các bong bóng khí (cavitation bubbles). Các bong bóng
khí được hình thành và kích thước lớn dần do sự khuếch tán các phân tử hơi nhỏ
hoặc khí từ môi trường vào trong bong bóng khí; đến một lúc nào đó, các bong
bóng khí bị phá vỡ, sinh ra năng lượng cơ học, chia nhỏ giọt nhũ tương [30].
- Ưu điểm: ít tốn kém, thiết bị dễ sử dụng.
- Nhược điểm: toàn bộ mẫu có thể nóng quá mức, có thể nhiễm titan từ đầu dò siêu
âm, phân bố KTTP rộng [56].
1.3.3.2. Phương pháp tự nhũ hóa hay nhũ hóa sử dụng năng lượng thấp
dynamic light scattering) hay phổ tương quan photon (PCS – photon correlation
spectroscopy).
- Hình thái và cấu trúc tiểu phân: kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM –
transmission electron microscopy).
- Điện tích bề mặt (thế zeta): dựa vào sự điện di của NTN trong điện trường.
- Khả năng thấm ướt (sức căng bề mặt).
- Ngoài ra, đối với NTN nhỏ mắt thì độ nhớt, chỉ số khúc xạ, pH, áp suất thẩm thấu
cũng là các đặc tính cần phải được đánh giá. 8
1.3.5.2. Độ ổn định vật lý
Đánh giá độ ổn định nhiệt động học [13], [23], [45]:
- Chu kỳ nóng – lạnh: thực hiện sáu chu kỳ giữa 4°C và 45°C, thời gian bảo quản ở
mỗi nhiệt độ không ít hơn 48 giờ. Các mẫu ổn định ở nhiệt độ này sẽ tiếp tục được
ly tâm.
- Ly tâm ở 3500 vòng/phút trong 30 phút và quan sát bằng mắt thường sự tách pha.
Các mẫu không quan sát thấy sự tách pha được kiểm tra tiếp bằng chu kỳ băng - tan.
- Chu kỳ băng - tan: thực hiện ba chu kỳ giữa -21°C và 25°C, thời gian bảo quản ở
mỗi nhiệt độ không ít hơn 48 giờ.
Mẫu NTN ổn định sau ba quá trình kiểm tra trên được coi là ổn định nhiệt
động học và được lựa chọn để nghiên cứu thêm.
Đánh giá độ ổn định cấp tốc: bảo quản NTN ở 40±2ºC, độ ẩm 60±10% trong
một khoảng thời gian nhất định, lấy mẫu đánh giá tại các thời điểm khác nhau tùy
nghiên cứu [59]. Sau đó, quan sát sự tách pha, kết tụ, sa lắng,…, xác định thay đổi
về phân bố KTTP, thế zeta, độ nhớt,… để xác định độ bền của NTN.
1.3.5.3. Định lượng dược chất trong mỗi pha
- Phương pháp siêu lọc: Sử dụng ống có gắn màng lọc với giới hạn KLPT nhỏ
(thường 10 – 12 kDa tùy vào KTTP), ví dụ ống Vivaspin – Sartorius (Đức). Mẫu
NTN đựng ở phía trên màng lọc, ly tâm với tốc độ và thời gian thích hợp (4000
Thiết bị thử hòa tan: NTN được chứa trong túi thẩm tích với 2 đầu được kẹp
chặt [12], [55] hoặc trong một ống thủy tinh hình trụ đường kính 2,5 cm, chiều dài
10 cm, một đầu được bao bởi màng thẩm tích, một đầu nối với thiết bị quay [14].
Tại những thời điểm nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán (bổ sung thể tích
môi trường mới tương ứng) và định lượng DC bằng phương pháp thích hợp. 10
Hoặc sử dụng kỹ thuật cân bằng ngược túi thẩm tích: NTN được đưa trực tiếp
vào môi trường khuếch tán đã đặt các túi thẩm tích kín (trong túi có sẵn môi trường
khuếch tán). Sau những khoảng thời gian nhất định, lấy một túi thẩm tích ra để định
lượng DC [16], [43].
Hình 1.4: Mô hình thử nghiệm kĩ thuật thẩm tách micro [39]
1.3.6. Ưu điểm chung của nhũ tương nano
- Độ bền động học cao do KTTP rất nhỏ nên hầu như không có hiện tượng kết
tụ, sa lắng, kết bông, nổi váng [24].
- Là dạng bào chế phù hợp với các DC ít tan trong nước, do nhũ tương nano
làm tăng độ tan và tăng khả năng thấm của DC.
- Thời gian tác dụng kéo dài do DC nằm trong pha nội.
- Thích hợp cho việc phân bố hiệu quả các thành phần hoạt chất qua da, màng
sinh học do diện tích bề mặt tiếp xúc lớn của các tiểu phân nano [52].
- Tính chất trong suốt của hệ, độ loãng (với nồng độ dầu hợp lý) làm cho NTN
có tính thẩm mỹ cao [52].
- NTN sử dụng nồng độ CDH hợp lý (với NTN 20% D/N, nồng độ CDH sử
dụng 5 - 10% là đủ) nên sẽ giảm được tính kích ứng của CDH [52], [24].
- Cải thiện sự hấp thu của các chất bổ sung thân dầu trong công nghệ nuôi cấy
tế bào và cho phép nghiên cứu độc tính của các thuốc tan trong dầu [15]. 12
- Do DC được hòa tan trong pha nội, hạn chế kích ứng mắt đối với DC gây
kích ứng mắt khi tồn tại dưới dạng dung dịch [48].
- KTTP nhỏ nên cho phép chúng bám đều trên các bề mặt giác mạc, lan tỏa và
sự thâm nhập hoạt chất cũng được tăng lên do sức căng bề mặt nhỏ của cả hệ và sức
căng mặt phân cách thấp của giọt D/N [52].
- NTN cation có các giọt dầu tích điện dương, tương tác tĩnh điện với các
mucin tích điện âm của giác mạc làm kéo dài thời gian lưu của thuốc trên giác mạc,
tăng cường hấp thu DC qua giác mạc, tăng sinh khả dụng của thuốc [29].
1.5. Một số nghiên cứu về nhũ tương nano dành cho nhãn khoa
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu về nhũ tương nano dành cho nhãn khoa
Năm Tác giả Hoạt chất
PP
BC
Thành
phần
Kết quả Nhận xét
2008 Alia A.
Badawi
và cộng
sự [14]
Indomethacin
(thuốc chống
viêm mạnh)
Phân
cắt
tốc
độ
hình trụ,
màng thẩm
tích 12
kDa).
So với vi
nang nano
(nanopartic
les), NTN
thể hiện
hiệu quả
hơn trong
việc giảm
viêm loét
giác mạc ở
thỏ, KTTP
nhỏ hơn. 13
2009 Yan Liu
và cộng
sự [32]
Azithromycin
(kháng sinh
macrolid, rất
ít tan trong
nước)
ĐNH
ở áp
suất
thẩm tích
10 kDa).
So với
dung dịch
DC 1%,
NTN có
sinh khả
dụng cao
gấp 1,73
lần và có
thời gian
lưu ở kết
mạc lâu
hơn do tiểu
phân tích
điện
dương.
2011 Jinqiu
Shen và
cộng sự
[48]
Flurbiprofen
axetil (thuốc
chống viêm
không
steroid, ít tan
trong nước)
Phân
cắt
tốc
10 kDa).
Tỷ lệ DC
được nhũ
tương hóa
cao, khả
năng thấm
ướt tốt làm
tăng thời
gian lưu
thuốc trên
giác mạc,
sinh khả
dụng cao
gấp 6,7 lần
so với
dung dịch
DC trong
dầu. 14
2012 M.
Gallarate
và cộng
sự [21]
Timolol
maleat (điều
trị bệnh tăng
nhãn áp)
Phân
mV; độ
nhớt 1,87
mPa s; ổn
định ở
25ºC và
40ºC sau 6
tháng;
dung nạp
tốt với mắt
thỏ.
Giọt dầu
tích điện
dương
tương tác
tĩnh điện
với các
mucin tích
điện âm
của giác
mạc nên
tăng độ
hấp thu DC
qua giác
mạc.
1.6. Một số chế phẩm nhũ tương nano trên thị trường
Các chế phẩm nhũ tương nano trên thị trường hiện nay chủ yếu là dạng thuốc
tiêm. Một số chế phẩm được trình bày ở bảng 1.2. Trong đó, chế phẩm Diprivan –
thuốc tiêm dạng nhũ tương nano chứa propofol sử dụng để gây mê (Astra Zeneca –
Singapor) hiện đã có mặt trên thị trường Việt Nam.
Liple Palmitat alprostadil Tiêm
5 µg/mL;
10µg/mL
Mitsubishi (Nhật)1.7. Nghiên cứu về nhũ tương nano nhỏ mắt chứa diclofenac
Trên thế giới chưa có nghiên cứu nào về nhũ tương nano nhỏ mắt chứa
diclofenac được công bố.
Ở Việt Nam, Bộ môn Bào chế - trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành
các đề tài nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của NTN nhỏ mắt chứa
diclofenac. Phương pháp và kết quả các nghiên cứu được thể hiện ở bảng 1.3
Bảng 1.3: Các nghiên cứu về nhũ tương nano nhỏ mắt chứa diclofenac
Năm
Tác gi
ả
PP BC
Thành ph
ầ
n
K
ế
t qu
ả
Nh
màng cellulose
acetat 0,2 µm)
Nồng độ đệm
càng cao và
pH càng thấp
thì hệ càng
bền; nồng độ
CDH thân
nước,
Transcutol HP
thấp, nồng độ
dung môi pha
dầu cao thì hệ
càng bền. 16
2012
Nguyễn
Thị
Phượng
[6]
Siêu
âm kết
hợp
ĐNH ở
áp suất
cao
DC 0,093%;
tỷ lệ DC được
nhũ tương hóa
cao, NTN có
khả năng kéo
dài thời gian
tác dụng.
2012
Nguyễn
Hồng
Vân [8]
Phân
cắt tốc
độ cao
DC 0,093%;
Isopropyl
myristat hoặc
Miglyol 1%;
Tween 80 hoặc
Cremophor
RH40 1 – 2%;
Span 80 0,1 –
0,5%;
Transcutol HP
0 – 0,03%; PG
5 – 15%; đệm
phosphat 0,1M
KTTP 50 – 250
d.nm; tỷ lệ DC
nghiệm 4 CT có độ ổn định vật lý và tỷ lệ DC giải phóng in vitro khác nhau để tiến
Copyright: Tài liệu đại học ©