BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN HỮU THẾ

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH
HỌC CỦA CÂY Ý DĨ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU THẾ
NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH
HỌC CỦA CÂY Ý DĨ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Trần Văn Ơn
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật – Trường ĐH
Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
3
1.1
Cây Ý dĩ
3
1.1.1
Vị trí phân loại của chi Coix L.
3
1.1.2
Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Coix L.
3
1.1.3
Thành phần hóa học
5
1.1.4
Tác dụng sinh học
8
1.1.5
Công dụng và sử dụng của cây Ý dĩ
10
1.2
DNA và phương pháp xác định trình tự gen
12
1.2.1
Một số tính chất và chức năng của DNA
12

21
2.2
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
21
2.2.1
Nghiên cứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học
21
2.2.2
Nghiên cứu đa dạng về di truyền
24
2.2.3
Nghiên cứu về hóa học bằng phương pháp HPTLC
25
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
27
3.1
Tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học
27
3.1.1
Đặc điểm hình thái của các mẫu Ý dĩ ở thời điểm ngày
02/05/2013
27
3.1.2
Đặc điểm nông học của các mẫu Ý dĩ
35
3.1.3
Kết quả nghiên cứu tính đa dạng về đặc điểm hình thái và
nông học
36

Adenin
C
Cystosin
CTAB
Cetyltrimethylammonium (cetrimonium) bromide
DNA
Acid deoxyribonucleic
dATP
Deoxy Adenosine Triphosphate
dCTP
Deoxy Cytidine Triphosphate
dGTP
Deoxy Guanosine Triphosphate
dTTP
Deoxy Thymidine Triphosphate
ddATP
Dideoxy Adenosine Triphosphate
ddCTP
Dideoxy Cytidine Triphosphate
ddGTP
Dideoxy Guanosine Triphosphate
ddTTP
Dideoxy Thymidine Triphosphate
ddNTP
Dideoxy Nucleoside Triphosphate
dNTP
Deoxy Nucleoside Triphosphate
EDTA
Ethylen Diamin Tetraacetic Axit
FDA

DANH MỤC CÁC BẢNG
TT
Ký hiệu
Tên bảng
Trang
1
Bảng 1.1
Các phản ứng hóa học đặc hiệu khi thực hiện giải trình
tự gen bằng phương pháp Maxam và Gilbert
15
2
Bảng 2.1
DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
Ký
hiệu
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1
Công thức cấu tạo của Coixol và α-monolinolein
5
2
Hình 1.2
Công thức cấu tạo của Coixenolide
6
3
Hình 1.3
Công thức cấu tạo của các hợp chất (4) – (8)
7
4
Hình 1.4
Công thức cấu tạo của các hợp chất (9) – (13)
8

Đặc điểm hình thái mẫu Y5 (Chiang Rai – Thái Lan)
30
13
Hình 3.6
Đặc điểm hình thái của mẫu Y6 (Thuận Châu – Sơn La)
31
14
Hình 3.7
Đặc điểm hình thái mẫu Y7 (Mường Thanh – Điện Biên)
32
15
Hình 3.8
Đặc điểm hình thái mẫu Y8 (Thành phố Hải Dương)
33
16
Hình 3.9
Đặc điểm hình thái mẫu Y9 (Văn Quan – Lạng Sơn)
34
17
Hình
3.10
Thân mang lá mẫu Y10 (Ba Vì – Hà Nội)
34
18
Hình
3.11
Các giai đoạn phát triển của cây Ý dĩ
35
19
Hình
DANH MỤC PHỤ LỤC
TT
Kí hiệu
Tên phụ lục
1
Phụ lục 1
Các chỉ tiêu nông – sinh học theo dõi được từ tháng 12/2012
đến tháng 05/2013
2
Phụ lục 2
Bảng mã hóa các biến số đặc điểm hình thái và chỉ tiêu nông
– sinh học
3
Phụ lục 3
Kết quả chồng peak sắc ký 10 mẫu Ý dĩ
4
Phụ lục 4
7 đoạn trình tự nucleotid dùng để so sánh từ ngân hàng gen
quốc tế
5
Phụ lục 5
Trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ
6
Phụ lục 6
Độ tương đồng di truyền của 9 mẫu Ý dĩ
7
Phụ lục 7
Kết quả gióng hàng trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ và 7

hiệu quả kinh tế và điều trị có thể khác nhau.Vì vậy, việc xác định tính đa dạng sinh
học của cây Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam là cần thiết. Năm 2012, Dược sĩ Nguyễn
Kim Khanh đã nghiên cứu sự đa dạng sinh học của 6 mẫu Ý dĩ ở miền Bắc Việt
Nam. Kết quả thu được là 6 mẫu Ý dĩ ít có sự đa dạng về hóa học nhưng có sự khác
biệt về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền [11]. Tuy nhiên nghiên cứu này
mới chỉ nghiên cứu trên 2 thứ là:
Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi và Coix
lacryma-jobi L. var. stenocarpa Oliv.
Do đó đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của cây Ý dĩ” được tiếp tục
thực hiện với 2 mục tiêu chính là:
1. Xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền của
một số giống Ý dĩ.
2

2. Khảo sát sự khác biệt về thành phần hóa học trong hạt của một số giống
Ý dĩ bằng phương pháp HPTLC.
Phân bố: Mọc phổ biến ở vùng nhiệt đới, đặc biệt là châu Á nhiệt đới, mọc
hoang ở ven bờ nước, nơi ẩm như bãi, ruộng. Cây cũng được trồng chủ yếu bằng
hạt [5].
Mùa hoa quả: Tháng 5 - 12 [2].
Ở Việt Nam, đã xác định Ý dĩ có 4 thứ sau: [5], [9]
- Coix lachryma-jobi L. var. lachryma-jobi - Cườm gạo: Cây cỏ sống nhiều
năm, thân có đường kính 8-10mm. Lá phẳng, cuống dài 40-50cm, rộng 4-5cm, gân
giữa to, gân bên rất mảnh; bẹ nhẵn, lưỡi nhỏ 1mm. Cụm hoa ở ngọn nhánh. Bông
chét đực ở trên, dài 6-7cm. Nhị vàng. Bông chét cái ở dưới, có bao hình bầu, dài 8-
9mm, đường kính 6mm, khi chín nâu đen rồi trắng, rất cứng. Thứ này mọc ở các đất
hoang đến vùng nước lợ.
- Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Rom) Stapf (C.chinensis Todaro ex
Balansa) – Ý dĩ, Bo bo: Cây cỏ sống hàng năm. Thân phân nhánh, nhẵn, to, xốp,
cao 1-2m. Lá phẳng, thuôn dài, hình tim ở gốc, nhọn đầu, dài 10-50cm, gân giữa
4

lớn nổi rõ, gân bên rất mảnh; bẹ lá nhẵn, kéo dài, thường rất rộng. Cụm hoa là bông
mọc thẳng đứng, có cuống. Hoa đơn tính cùng gốc. Bông chét đực mọc chụm 2-3
chiếc một chỗ trên cuống chung mảnh, có mày cứng bao bọc. Bông chét cái hình
bầu dục; lá bắc rất dày, cứng mà trắng nhạt hay xanh xám. Quả hình cầu hay hình
bầu dục, có vỏ dạng giấy hay hóa cứng. Phân bố Ấn Độ, Việt Nam, Lào, Indonexia,
Philippin. Ở Việt Nam, cây mọc hoang và cũng được trồng, thường gặp ở các bờ
nước, nơi đất ẩm ven rừng, ven đường. Ra hoa từ tháng 7 đến tháng 12.
- Coix lacryma-jobi L. var. puellarum Balansa (C.puellarum Balansa) – Bo
bo dại, Cườm gạo: Cây cỏ sống nhiều năm, cao trên 50cm, phân nhánh nhiều, ruột
xốp, nhẵn. Lá mềm, phẳng, mép nhăn nheo, đầu nhọn, gốc hình tim, gân mảnh nổi
rõ cả 2 mặt; bẹ lá nhẵn, thuôn dài. Cụm hoa ở nách lá hay ngọn thân. Bông chét đực
ở trên đỉnh, hợp với cuống chung xếp sát nhau; mày bóng, cứng. Bông chét cái có lá
bắc cứng bao bọc, màu trắng tím, bóng. Quả có lá bắc phát triển ôm lấy toàn bộ
phần bên trong nhỏ bé, hình cầu,bóng, cứng rắn. Cây mọc hoang ở ven đồi thấp ẩm,

6
5
4
8
9
7
O
1
N
H
3
2
O
M
e
O

1. Coixol 2. α-monolinolein
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Coixol, α-monolinolein
1.1.3.1. Coixenolide [36]
Năm 1960, Tyunosin Ukita và cộng sự đã tách chiết được coixenolide từ dịch
chiết aceton của hạt Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf). Bột nhân hạt Ý
dĩ được chiết với aceton ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành phân lập và tinh chế
bằng sắc ký cột silicagel thu được hợp chất có công thức C
38
H
70
O
4
, n

Coixspirolactam A (4), coixspirolactam B (5), coixspirolactam C (6), coixlactam (7)
và methyl dioxindol – 3 – acetat (8). Bột thân Ý dĩ được chiết bằng methanol, cắn
tạo thành được lắc với các dung môi: n-hexan, ethyl acetat và n-butanol. Năm hợp
chất trên phân lập từ phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký cột silicagel và được tinh
chế bằng HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) trên cột Si – 60 Lichrosorb. Dựa vào
các phương pháp phân tích quang phổ gồm IR (phổ hồng ngoại),
1
H-NMR (phổ
cộng hưởng từ hạt nhân proton),
13
C-NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C), 2D-
NMR (phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều) và MS (phổ khối) người ta xác định
cấu trúc của 5 hợp chất đó (Hình 1.3).
7

6
5
4
3
a
7
a
7
N
H
1
3
2

H
3

6
5
4
3
a
7
a
7
N
H
1
3
2
O
1
0
8
O
9
O
H
3
C
11
H

4. Coixspirolactam A 5. Coixspirolactam B 6. Coixspirolactam C

N
H
1
2
H
O
8
O
9
OC
H
3
O

7. Coixlactam 8. methyl dioxindol – 3 – acetat
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của các hợp chất (4) – (8)
1.1.3.4. Các hợp chất có tính acid [34]
Năm 1994, Numata M và cộng sự từ dịch chiết aceton của nhân hạt Ý dĩ đã
tìm thấy các thành phần có tác dụng ức chế sự tăng trưởng khối u trên chuột. Các
thành phần này được tách riêng bằng sắc ký cột silicagel và được xác định cấu trúc
bằng các phương pháp phân tích: Quang phổ hồng ngoại và sắc ký lỏng - khí. Các
thành phần này được xác định là 4 acid béo: Acid palmitic, acid stearic, acid oleic
và acid linoleic.
1.1.3.5. Coixol và các hợp chất benzoxazinones [33]
Năm 1985, Nagao và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất benzoxazinones (9)
– (13) và coixol (1) từ phân đoạn chloroform của dịch chiết methanol rễ cây Ý dĩ
(Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf). Hợp chất (9) là 2-hydroxy-7-methoxy-
1,4(2H)-benzoxazin-3-one. Hợp chất (10) là 2-O-β-D-glucopyranoside. Hợp chất
(11) là 2-O-β-glucopyranosyl-4-hydroxy-7-methoxy-1,4(2H)-benzoxazin-3-one.
8

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của các hợp chất (9) – (13)
1.1.4. Tác dụng sinh học
1.1.4.1. Tác dụng chống ung thư
Năm 2008, Ming-Yi Lee và cs đã nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào khối u
từ thân Ý dĩ và 5 hợp chất lactam được tách từ dịch chiết MeOH thân Ý dĩ (Coix
lacryma-jobi L. var. ma-yuen). Các ông đã tiến hành thí nghiệm trên các dòng tế
bào là A549 – ung thư phổi ở người, HT – 29 (Ung thư tế bào biểu mô trực tràng ở
người) và COLO 205 – ung thư tế bào biểu mô ruột bằng phương pháp thử MTT (3
– 4,5 – dimethylthiazol – 2 – yl – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromid). Kết quả cho
thấy dịch chiết thân Ý dĩ ở các phân đoạn và 5 hợp chất phân lập được đều có tác
dụng ức chế tế bào ung thư. Tuy nhiên, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng ức chế
mạnh hơn các phân đoạn còn lại (IC
50
trong phân đoạn ethyl acetat từ 82% đến
153%) [29].
Dịch chiết cồn bột Ý dĩ cũng được báo cáo là làm giảm có ý nghĩa số lượng
các tiểu nang bất thường tiền ung thư [30].
1.1.4.2. Tác dụng hạ đường huyết

R
2
R
3
R
4
R
5
9
H
H

bình thường, chuột tiêm STZ (Streptozocin) và chuột tiêm adrenalin (Liều 20g dược
liệu khô/kg). Kết quả thu được như sau:
- Trên chuột bình thường: Sau khi cho uống dịch chiết thân cây Ý dĩ và tiến
hành xác định nồng độ glucose huyết của lô chứng và lô thử ở thời điểm 0h, 1h, 2h,
3h, 4h và 5h thấy glucose huyết không thay đổi theo thời gian.
- Trên chuột tiêm STZ: Sau khi tiêm STZ 72h, định lượng glucose huyết lúc
đói của chuột, sau đó cho chuột uống dịch chiết Ý dĩ và sau 10 ngày định lượng lại
nồng độ glucose huyết của lô chứng và lô thử. Tiến hành song song với lô chứng
uống nước cất. Kết quả cho thấy nồng độ glucose ở lô thử giảm khoảng 36%. Như
vậy dịch chiết thân Ý dĩ có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột tiêm STZ.
- Trên chuột tiêm adrenalin: Chuột nhịn đói 12h được cho uống dịch chiết.
Sau 3h tiêm adrenalin với liều 0.6mg/kg, định lượng glucose huyết ở thời điểm
trước khi tiêm và sau khi tiêm 60ph. Tiến hành song song với lô chứng uống nước
cất. Kết quả cho thấy sau khi tiêm adrenalin liều 0.6mg/kg, glucose huyết của chuột
ở cả 2 lô đều tăng, nhưng ở lô uống dịch chiết, mức tăng glucose huyết (~72%) thấp
hơn lô chứng (~125%). Như vậy, dịch chiết thân Ý dĩ có tác dụng hạn chế tăng
glucose huyết bởi tác nhân adrenalin [10].
1.14.3. Tác dụng chống viêm
Năm 2009, Din – Wen Huang và cs đã điều tra những ảnh hưởng của dịch
chiết vỏ hạt Ý dĩ (Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf) trên lipopolysaccharide
gây ra đáp ứng viêm tại đại thực bào RAW 264.7 và cho thấy dịch chiết vỏ hạt Ý dĩ
có tác dụng chống viêm do chúng chống lại sự gia tăng sản sinh tế bào của nitric
oxide và prostaglandin E2 gây ra bởi lipopolysaccharide bằng cách làm giảm sự sản
xuất ra các enzym nitric dioxide synthase và cyclooxygenase [25].
10

1.1.4.4. Các tác dụng khác :
• Tác dụng hạ mỡ máu [21], [24], [27].
• Tác dụng chống dị ứng [20], [23].
• Tác dụng co rút tử cung trong thai kỳ: Dịch chiết nước hạt Ý dĩ có khả năng

trong nhiều đơn thuốc và biệt dược, như 54.5% trong bột bổ tỳ trừ giun, 40% trong
bột cam trẻ em và 10% trong viên Phì nhi liên hoàn hoặc kẹo bổ tỳ. Ý dĩ hầm với
hạt Sen và thịt nạc là món ăn – vị thuốc cho những người cơ thể gầy yếu, suy dinh
dưỡng [2].
Liều dùng 8 – 30g. Thường dùng dưới dạng thuốc sắc. Dùng riêng hay kết hợp
với các thuốc khác.
1.1.5.3. Một số bài thuốc trong Y học cổ truyền
• Chữa trường ung bụng trướng đầy tiểu tiện khó: Ý dĩ, Qua lâu nhân, mỗi vị
6 – 9g; Mẫu đơn bì, Đào nhân, mỗi vị 6g. Sắc nước uống [2].
• Chữa thủy thũng: Ý dĩ, Xích tiểu đậu, Đông qua bì, mỗi vị 30g; Hoàng kỳ,
Phục linh, mỗi vị 15g. Sắc nước uống [2].
• Chữa tiểu tiện ra máu: Ý dĩ 20g, nước 600ml, sắc đến khi còn 20ml.
Uống liên tục cho đến khi thấy tiểu tiện bình thường là được [12].
• Chữa bệnh phổi, nôn ra máu: Ý dĩ 40g, nước 400ml (2 bát) sắc còn
1 bát (200ml) thêm ít rượu vào uống làm 2 lần trong ngày. Uống luôn 10
ngày [12].
• Bổ, chữa lao lực: Ý dĩ 5g, Mạch môn đông 3g, Tang bạch bì 3g, Bách bộ
3g, Thiên môn đông 3g, nước 600ml. Sắc còn 200ml chia làm
3 lần uống
trong ngày [12].
• Chữa tê thấp: Ý dĩ nhân 40g, Thổ phục linh 20g, nước 600ml sắc còn
200ml. Chia làm 2 lần uống trong ngày. Uống liền 10 ngày nếu thấy tiểu
tiện nhiều là bệnh giảm [12].
1.1.5.4. Một số sản phẩm từ Ý dĩ
12

Thuốc tiêm Kanglaite (KLT) (Hình 1.5) [38] là thuốc chống ung thư mới được
chiết xuất từ hạt Ý dĩ. FDA (Cơ quan quản lý chất lượng thuốc và thực phẩm) của
Hoa Kỳ đã phê duyệt giai đoạn II thử nghiệm của KLT để kiểm tra hiệu quả của nó
trong điều trị ung thư phổi không phải tế bào nhỏ. Một số nghiên cứu cho thấy nó

loài sinh vật khác nhau.
Tính chất của DNA đảm bảo nó " truyền đạt" được thông tin di truyền: DNA
có khả năng tự nhân đôi, nhờ vậy NST sẽ nhân đôi đảm bảo thông tin di truyền
được truyền đạt qua các thế hệ sau. DNA chứa các gen cấu trúc, các gen này có khả
năng phiên mã để tạo mARN rời từ đó hình thành protein, quy định tính trạng cho
sinh vật.
DNA có khả năng đột biến, hình thành những thông tin di truyền mới, các
thông tin di truyền này tự nhân đôi nhờ cơ chế tái bản của DNA.
DNA có sự biến tính thuận nghịch: Khi dung dịch DNA bị đun nóng trên
nhiệt độ riêng thì cấu trúc tự nhiên bị phá hủy, hai chuỗi bổ sung tách khỏi nhau
và tạo ra cấu trúc đơn xoắn ngẫu nhiên. Nếu làm lạnh nhanh và duy trì nhiệt độ
khoảng 25°C dưới T
m
trong một khoảng thời gian nhất định thì hai sợi đơn DNA
biến tính sẽ bắt cặp trở lại theo nguyên tắc bổ sung.
Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu
nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã nội (Internal
Transcribed Spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotid . Vùng phiên mã
nội ITS của ADN ribosom (ITS-rADN) được sử dụng phổ biến trong các nghiên
cứu phân loại loài của thực vật. Vùng ITS có 3 phần: ITS1, 5.8S và ITS2 (Hình 1.6)
với kích thước thay đổi từ 500 đến 700bp.
14 Vùng ITS
Hình 1.6. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS
Trình tự nucleotid vùng ITS đã được nghiên cứu nhiều và số lượng các trình
tự nucleotid của vùng này đã được công bố trong ngân hàng gen quốc tế khá phong
phú, thuận lợi cho phân tích so sánh. Vùng ITS có ưu điểm là: Vùng ITS có độ lặp
lại cao trong ADN nhân của thực vật, sản phẩm PCR của ADN nhân có thể sử dụng