BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ MINH TẤN
TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN
MÃ HÓA CYP2D6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HỒ MINH TẤN
TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN
MÃ HÓA CYP2D6
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Xuân Bắc

MỤC LỤC

Trang
Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CYP2D6 2
1.1. CYTOCHROM
− P450
2
1.1.1. Phân bố 3
1.1.2. Phân loại và danh pháp 3
1.1.3. Cơ chế xúc tác của CYP 4
1.2. CYP2D6 6
1.2.1. Cấu trúc của CYP2D6 7
1.2.2. Cơ chế tác dụng của CYP2D6 8
1.2.3. Cơ chất của CYP2D6 9
1.3. GEN MÃ HÓA CYP2D6 15
CHƯƠNG 2. ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 16
2.1. KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN 16

3.4.4. Áp dụng trên CYP2D6 51
3.5. KỸ THUẬT PCR PHỨC HỢP 52
3.5.1. Nguyên tắc: 52
3.5.2. Ưu điểm 53
3.5.3. Nhược điểm 53
3.5.4. Áp dụng trên CYP2D6 giúp chẩn đoán allen *5 và allen*10 53
3.6. MỘT SỐ KỸ THUẬT KHÁC GIÚP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN CYP2D6 56
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 56
4.1. HIỆN TƯỢNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 56
4.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH CYP2D6 TRÊN THẾ GIỚI 57
4.3. ĐỀ XUẤT HƯỚNG NGHIÊN CỨU CYP2D6 Ở VIỆT NAM 58
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN 59
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
KÝ HIỆU/CHỮ TÊN TIẾNG ANH
TÊN TIẾNG VIỆT
(nếu có)
ADN Deoxyribonucleic Acid
ADR Adverse Drug Reaction

Single nucleotide
polymorphism
Đa hình đơn nucleotid
UM Ultra metabolism Chuyển hóa siêu nhanh

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Ảnh hưởng của đa hình di truyền CYP2D6 lên một số thuốc điều trị 38
Bảng 3.1. Các mồi và enzym cắt tương ứng từng allen [79] 50

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1. Tỷ lệ chuyển hóa thuốc bởi các CYP [65] 4
Hình 2: Cơ chế xúc tác của CYP [1] 5
Hình 3. Mô hình phân tử CY2D6 [100] 7
Hình 4. Cấu trúc vùng hoạt động của CYP2D6 [100] 7
Hình 5. Cơ chế xúc tác của CYP2D6 [68] 9
Hình 6. Chuyển hóa của dextromethorphan bởi CYP2D6 [105] 12
Hình 7. Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37] 15
Hình 8 Mô tả các loại đột biến điểm [2] 19
Hình 9 Gen EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N [2] 20
Hình 10. Hình thành gen lai [33] 29
Hình 11. Sự lặp lại một hay nhiều lần và xóa toàn bộ gen CYP2D6 [43] 36
Hình 12. Kiểu gen CYP2D6 ở các vùng địa lý khác nhau [109] 37

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vào cuối những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện và tập
trung nghiên cứu một hệ thống enzym có vai trò vô cùng quan trọng đối với con
người, đó là hệ thống cytochrom P450 hay còn được gọi là CYP450. Hệ thống
enzym này là tác nhân xúc tác chuyển hóa cho các chất nội sinh như các steroid,
cholesterol, các acid mật…cũng như các chất ngoại sinh có cấu trúc khác nhau
trong đó có các chất độc, chất gây ung thư và đặc biệt là chuyển hóa thuốc. Hiện
nay người ta đã phát hiện được 57 isozym trên hệ thống CYP450 ở người và chia nó
thành các họ và phân họ khác nhau.
Trong số những isozym này, CYP2D6 giành được sự quan tâm đặc biệt. Bởi
lẽ, dù chỉ đứng thứ hai về mặt số lượng các thuốc chuyển hóa nhưng CYP2D6 lại là
một trong những enzym có hiện tượng đa hình phổ biến nhất. Và những hậu quả của
hiện tượng này nhiều khi rất nghiêm trọng. Hơn thế nữa các nhóm thuốc điều trị
được enzym này chuyển hóa như tim mạch, giảm đau, thần kinh, ung thư là những
nhóm thuốc rất phổ biến hiện nay và có cửa sổ điều trị hẹp. Do đó, việc hiểu biết về
CYP2D6 trên các phương diện: các đột biến gen, những biến đổi ở kiểu hình, hậu
quả lâm sàng kèm theo và các phương pháp phát hiện đột biến là cần thiết, góp phần
vào việc “tối ưu hóa điều trị”.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Tổng quan về các đột biến gen mã hóa CYP2D6” với những mục tiêu sau:
1. Tìm hiểu các đột biến gen mã hóa CYP2D6 đã được phát hiện.
2. Tìm hiểu về các phương pháp phát hiện đột biến gen CYP2D6.

và có sóng hấp thụ cực đại ở 450nm khi gắn với CO. Sự có mặt của một chất màu
phản ứng với CO và đi kèm với cytochrom b5 trong microsom đã được phát hiện
bởi G.R.William vào năm 1955 và Garfinkel (1958) trong quỹ học bổng Johnson và
bởi Klingenberg [59]. Chất màu này được đặc trưng bởi một băng hấp thụ của hợp
chất với CO ở 450 nm, vì vậy gọi là P450. Để đơn giản và thống nhất về mặt thuật
ngữ, người ta qui ước dùng chữ CYP thay cho Cyt-P450. Sau đó, Sato và Omura
(1962,1964) đã xác định bản chất hem của nhóm ngoại của nó. Loại protein chứa
hem có mặt trong microsom mới được phát hiện này có những thuộc tính riêng biệt
đã được xác định là một enzym oxy hóa cuối cùng của nhiều phản ứng oxy hóa
khác nhau tham gia vào một số quá trình chuyển hóa quan trọng ở cơ thể động vật:
3

sinh vật tổng hợp hormon steroid, acid mật từ cholesterol và chuyển hóa thuốc [85,
86].
1.1.1. Phân bố
CYP là hệ enzym gắn màng có ở hầu hết các mô trong cơ thể, trong đó tập
trung nồng độ cao chủ yếu ở vi thể trên lưới nội sinh chất nhẵn của tế bào gan và
một lượng ít hơn ở ruột non, phổi, thận và não.
Ở người, CYP tập trung nhiều nhất ở tế bào gan. CYP cũng được tìm thấy
trong ti thể của thượng thận chuột cống và ở ti thể vỏ thượng thận bò [56, 132].
Người ta cũng phát hiện ra rằng CYP không chỉ có ở vi thể và ti thể của động vật có
vú mà còn phân bố rộng rãi ở các dạng tồn tại khác nhau của sự sống bao gồm:
động vật và vi sinh vật. Những nghiên cứu về CYP tăng lên đặc biệt nhanh chóng
trong nửa sau của những năm 1960, khi những nghiên cứu được tập trung chủ yếu
vào chức năng của CYP trong chuyển hóa thuốc ở vi thể gan. Vai trò của CYP trong
sự hoạt hóa các chất gây ung thư khác nhau (carcinogen) đã được khẳng định vào
đầu những năm 1970 và nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu các hóa chất gây ung
thư chuyển sang nghiên cứu CYP, mang lại sự phát triển vượt bậc lần thứ hai trong
lĩnh vực nghiên cứu này. Sự phát triển quan trọng tiếp theo là những nghiên cứu
làm sạch CYP từ vi thể và ti thể và dẫn tới việc tinh chế và đặc trưng được nhiều

5 Hình 2: Cơ chế xúc tác của CYP [1]
 Bước 1: Cơ chất được gắn vào CYP (dạng oxy hóa) tạo ra hỗn hợp enzym-cơ
chất. Sự gắn cơ chất này làm biến đổi đương lượng từ của CYP từ trạng thái spin
thấp (low spin). Sự biến đổi thế năng oxy hóa được gây ra bằng cách đó sẽ tạo
thuận lợi cho việc chuyển của điện tử thứ nhất.
 Bước 2: Là bước nhận điện tử thứ nhất từ NADPH dưới tác dụng xúc tác của
enzym Cyt-P450-reductase (hoặc từ một loại protein chứa sắt- lưu huỳnh (2Fe-2S)
gọi là adrenodoxin trong cơ thể vi sinh vật) tạo thành hỗn hợp enzym-cơ chất dạng
khử.
6

 Bước 3: Hỗn hợp enzym-cơ chất trên gắn với một phân tử O
2
. Trong hỗn hợp
này mới có sự chuyển điện tử nội phân tử để tạo thành hỗn hợp enzym-cơ chất,
trong đó sắt ở dạng oxy hóa gắn với O
2
-
.
 Bước 4: Hỗn hợp vừa tạo thành nhận điện tiếp điện tử thứ 2 từ phân tử
NADPH thứ hai do NADPH-reductase xúc tác hoặc từ NADH (xúc tác bởi NADH-
Cytochrom b
5
reductase và Cytochrom b
5
), ở vi sinh vật bước này do adrenoxin xúc
tác. Hai điện tử nhận được khử phân tử O

trầm cảm, thuốc chẹn Beta và thuốc giảm đau. Đặc điểm của các thuốc này là
những chất thân dầu với một nhóm amin đã được proton hóa và một vòng thơm
[13]. Sự sáng tỏ về cấu trúc tinh thể của CYP2D6 và việc FDA phê duyệt việc thí
nghiệm kiểm tra gen đã đưa việc nghiên cứu về enzym này lên vị trí mũi nhọn [28,
119].
7

1.2.1. Cấu trúc của CYP2D6
Phân tử CYP2D6 là một protein gồm 479 acid amin, chứa một nhóm heme, ID
trong dữ liệu Ngân hàng protein: 2f9q [100]. (hình 3). CYP2D6 có một vị trí hoạt
động, nằm phía trên nhóm hem. (hình 4) Hình 3. Mô hình phân tử CY2D6 [100]

Hình 4. Cấu trúc vùng hoạt động của CYP2D6 [100]
8

Các acid amin xoắn lại ở vùng tiếp nhận và gắn cơ chất là Asp301 (D301), Glu216
(E216), Phe483 (F483) và Phe120 (F120). (hình 4). Vai trò rất quan trọng của
D301, E216, F120 và F483 đó là nhận biết và gắn cơ chất. Trong đó D301 và E216
giúp gắn kết cơ chất. Còn F483 và F120 còn lại điều khiển sự liên kết phân tử cơ
chất ở vị trí hoạt hóa [91].
CYP2D6 được phát triển sau khi trẻ được sinh ra. CYP2D6 hoặc hoạt tính của
nó không được phát hiện ở các tế bào gan của thai nhi mặc dù ARN CYP2D6 tăng
lên cùng với sự phát triển của bào thai. Lượng CYP2D6 cùng với hoạt tính của nó
không liên quan đến tuổi của thai nhi và tăng lên cùng với sự phát triển của trẻ sau
khi ra đời. Sau khi sinh 7 ngày, hoạt tính enzym này xấp xỉ bằng 25% so với người
trưởng thành. Và khi một tuổi hoạt tính CYP2D6 ở gan bằng với mức ở người
trưởng thành [80].
Hình 5. Cơ chế xúc tác của CYP2D6 [68]
1.2.3. Cơ chất của CYP2D6
1.2.3.1. Cơ chất mẫu của CYP2D6
Cơ chất mẫu của CYP2D6 thường là những thuốc đã được dùng điều trị từ rất
lâu (tới nay có thể không còn dùng để điều trị nữa) và được chuyển hóa thông qua
CYP2D6. Sự thay đổi trên CYP2D6 sẽ ảnh hưởng rất lớn tới tác dụng điều trị của
các thuốc. Khi các nhà khoa học biết được điều này cùng với sự ra đời của các
phương pháp pháp hiện đột biến trên gen, họ đã tìm cách đưa ra mối quan hệ về
kiểu gen và kiểu hình CYP2D6. Do đó mà các thuốc này được lựa chọn làm chất để
phân loại các kiểu hình chuyển hóa nhanh (EM), chuyển hóa chậm (IM), chuyển
10

hóa siêu nhanh (UM) và chuyển hóa rất chậm (PM). Sự phân biệt này sẽ được trình
bày cụ thể ở mục 2.3.
a. Spartein
Spartein và debrisoquin là hai cơ chất đầu tiên được nghiên cứu và nó cũng
được sử dụng rộng rãi để xác định kiểu hình chuyển hóa chậm (PM) của CYP2D6
[138]. Những nghiên cứu sớm chỉ ra rằng spartein chuyển hóa chủ yếu bởi một hệ
thống các CYP thành một “N-oxid”. “N-oxid” tiếp tục phản ứng, và bị mất nước để
trở thành 2-dehydrospartein (ví dụ: 2,3-didehydrospartein) và 5- dehydrospartein (ví
dụ: 5,6 –didehydrospartein). So sánh sự tạo thành 2-dehydrospartein ở vi thể gan
người từ hai kiểu hình EM (MR < 2) và PM (MR > 20) đã chỉ ra hơn sự hơn kém
nhau 32 lần đối với giá trị của hằng số thải trừ K
m
giữa EM và PM (58.3 và 1880
micromol/L ) [89].
Với tỷ lệ chuyển hóa của spartein (MR) = spartein thải trừ qua nước tiểu ÷ (
2-dehydrospartein và 5- dehydrospartein thải trừ qua nước tiểu).

hình PM, còn mức MR < 12.6 được xác định là kiểu hình EM. Có ít hơn 1% người
châu Á được phân loại là PM nếu sử dụng MR của debrisoquin = 12.6 là mức để
đánh giá [8]. Phân bố tỷ lệ chuyển hóa debrisoquin thay đổi cao hơn ở những người
châu Á có kiểu hình EM so với người da trắng có kiểu hình EM. Các thí nghiệm
kiểm tra kiểu hình sử dụng spartein hoặc debrisoquin có giá rẻ và đáng tin cậy tuy
nhiên ngày nay không còn dùng nữa.
c. Dextromethorphan
Dextromethorphan một chất tổng hợp tương tự thuốc giảm đau gây nghiện
được sử dụng như một thuốc giảm ho không cần kê đơn. Ở người nó được thải trừ
12

chủ yếu dạng nguyên vẹn và dextrorphan có tác dụng dược lý ( hình 6).

Hình 6. Chuyển hóa của dextromethorphan bởi CYP2D6 [105]
Sự hình thành dextrorphan từ dextromethorphan chủ yếu do CYP2D6 thông
qua việc cắt bỏ nhóm methyl qua cầu nối oxy [18, 49]. Do đó dextromethorphan
ngày nay được sử dụng như là một cơ chất mẫu để xác định hoạt tính CYP2D6 cả ở
in vivo và in vitro. Tùy thuộc quần thể, chủng tộc mà biểu đồ tần số phân bố, giá trị
phản ánh mà có các giá trị MR tiêu chuẩn (antimode) khác nhau. Giá trị MR nước
tiểu = 0.3 khi sử dụng dextromethorphan làm thuốc thử để phân loại EM và PM ở
người da trắng, giá trị này cũng được áp dụng cho các quần thể khác [105]. Còn đối
với MR huyết thanh giá trị sử dụng là 0.126. Tuy nhiên có sự chồng chéo giữa kiểu
hình IM và EM khi sử dụng giá trị “antimode” bằng 0.03 [60].
d. Bufuralol
Bufuralol là một thuốc chẹn β rất hay được sử dụng làm chất mẫu trong các
thí nghiệm kiểm tra CYP2D6 in vitro. Nó được chuyển hóa thành 3 chất: 1’-
hydroxybufuralol, 1’-oxobufuralol và 1’,2’-ethenylbufuralol. Nồng độ 1’-
hydroxybufuralol - chất chuyển hóa chính của bufuralol, thường được định lượng
13



ondansetron, dolasetron và metoclopramid cũng được CYP2D6 chuyển hóa. Tuy
nhiên những CYP khác nhau thì đảm nhận vai trò khác nhau, chúng có thể đảm
nhận hoàn toàn hoặc chỉ một phần. Chẳng hạn như CYP1A2 và 3A4 cũng liên quan
đến chuyển hóa của hầu hết thuốc điều trị rối loạn tâm thần trong khi CYP2C19,
2C9 và 3A4 lại có vai trò rất lớn đối với chuyển hóa của phần lớn thuốc ức chế thu
hồi chọn lọc serotonin [141]. Do đó mà ảnh hưởng của hiện tượng đa hình di truyền
của CYP2D6 lên sự chuyển hóa hoàn toàn những thuốc này là rất đa dạng và phụ
thuộc rất nhiều vào vai trò của CYP2D6 trong sự chuyển hóa của chúng.
CYP2D6 đóng một vai trò không lớn trong sự chuyển hóa của citalopram.
Trong khi sự chuyển hóa qua CYP3A4 và CYP2C19 lần lượt chiếm tỷ lệ 70% và
7%. Tuy nhiên CYP2D6 lại có vai trò rất quan trọng đối với chuyển hóa
escitalopram- đồng phân S của citalopram. Sự phân bố tương quan giữa CYP2D6,
2C9 và 3A4 tới độ thanh thải nội tại của gan (CL
int
) của escitalopram được ước tính
theo thứ tự là 28%, 37% và 35% [125]. Gepiron là một thuốc chống trầm cảm thế
hệ mới được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6,

nhưng ở nồng độ thấp thì vai trò của
CYP3A4 lại đóng vai trò chính [39]. Một thuốc chống trầm cảm mới hơn,
duloxetin, được chuyển hóa chính bởi CYP2D6 và 1A2 [110]. Methadon là một
thuốc chủ vận trên receptor μ, được chuyển hóa chủ yếu bởi cả CYP2D6 và 3A4
[127].
Atomoxetin, một thuốc điều trị chứng tăng động, giảm tập trung hay
nicergolin – một dẫn xuất của cựa lõa mạch để điều trị mất trí nhớ cũng được
chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 [10, 99]. Selegilin, một thuốc sử dụng điều trị giai
đoạn đầu của bệnh Parkinson, trầm cảm, chứng mất trí nhớ được chuyển hóa một
phần bởi CYP2D6, nhưng CYP2B6 và 2C19 mới là những enzym chính trong sự
chuyển hóa thuốc này [44]. Almotryptan một chất chủ vận chọn lọc receptor 5-

Hình 7. Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37]
16

CHƯƠNG 2. ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6
2.1. KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN
Đột biến theo nghĩa rộng chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột. Một đột
biến gen là một sự thay đổi trong trình tự nucleotid trên gen, dẫn đến kết quả là tạo
ra một protein đột biến với trình tự acid amin thay đổi hay tác động đến quá trình
điều khiển sự tổng hợp của các sản phẩm gen. Nếu protein đột biến có chức năng
khác với dạng tự nhiên thì sẽ tạo ra một sự thay đổi tương ứng ở những đặc tính có
thể quan sát được và tạo ra thể đột biến. Sự khác biệt có thể do hoạt tính hay tính ổn
định của enzym. Một số đột biến có thể tồn tại trong quần thể bên cạnh các dạng tự
nhiên làm thành một thể đa hình [4].
Đột biến xảy ra ở các tế bào không sinh sản được gọi là đột biến sinh dưỡng
và tạo ra các thay đổi có tính cục bộ, không di truyền được như các u sắc tố ngoài
da người tạo ra nốt ruồi. Những đột biến sinh dưỡng có thể là nguyên nhân gây ra
ung thư và có thể là nguyên nhân của sự lão hóa .
Đột biến xảy ra trong giao tử được gọi là đột biến dòng mầm và được truyền
cho đời sau. Khi nghiên cứu các đột biến giao tử và đo tỷ lệ đột biến ở sinh vật đa
bào nói chung và người nói riêng cần xét đến tính lưỡng bội. Hầu hết các đột biến
gen là đột biến lặn và sẽ không được phát hiện nếu hợp tử không có hai bản của
allen đột biến. Do đó việc phát hiện và đo tần số đột biến phải dựa vào quan sát các
đột biến trội đang xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, các đột biến lặn và trội trên
nhiễm sắc thể X.
Ví dụ: chứng loạn sản sụn xảy ra rải rác là bởi các đột biến mới trong gen của
thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi. Trong 1 năm có 7 trẻ sơ sinh bị loạn sản
sụn trên tổng số 242257 trẻ sơ sinh , tỷ lệ là 7/242257 × 1/2 ( 2allen/ hợp tử) =1,4 ×
10^
-5
.