Bộ giáo dục và đào tạo Bộ Y Tế
Trờng đại học Dợc hà nội Chử Thị Thanh Huyền Nghiên cứu định lợng
acid oleanolic trong đinh
lăng bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao luận văn thạc sỹ dợc học
Hà nội 2012
Bộ giáo dục và đào tạo Bộ Y Tế
Trờng đại học Dợc hà nội
Chử Thị Thanh Huyền Nghiên cứu định lợng
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà
Nội, các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia, Bộ môn Hóa
phân tích – độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người
đã luôn động viên, khích lệ và trợ giúp cho tôi về mọi mặt để tôi có được kết quả
như ngày hôm nay. Hà Nội, ngày 24 tháng 9 năm 2012
Học viên
Chử Thị Thanh Huyền MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG , BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG І: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về cây đinh lăng và các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật 3
1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến 3
1.1.3. Thành phần hóa học 4
1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng của đinh lăng 4
1.1.5. Các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường 5
1.2. Tình hình tiêu chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm đông dược ở Việt Nam và thế giới 6
3.2.2. Độ phù hợp của hệ thống sắc ký 43
3.2.3. Tính chọn lọc 43
3.2.4. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ 51
3.2.5. Độ lặp lại 53
3.2.6. Độ đúng 54
3.2.7. Độ ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic 55
3.3. Ứng dụng định tính, định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng 57
3.3.1. Ứng dụng định tính acid oleanolic trong dược liệu đinh lăng và cao khô đinh lăng 57
3.3.2. Ứng dụng định lượng 61
Chương IV: BÀN LUẬN 64
4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu ở Việt Nam 64
4.2. Về quy trình xử lý mẫu 67
4.3. Phương pháp định lượng acid oleanolic trong đinh lăng 68
4.4. Bàn luận về kết quả định lượng acid oleanolic trong một số mẫu đinh lăng khác nhau 70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71
A. Kết luận 71
B. Kiến nghị 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤCDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AR:
Thuốc thử dùng trong phân tích (Analysis Reagent)
BuOH:
Butanol
DAD:
Detector mảng điốt (Diode array detector)
Dd:
RSD:
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
TLC:
Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
UV:
Tử ngoại (Ultraviolet)
λ
em
:
Bước sóng phát xạ (emission)
λ
ex
:
Bước sóng kích thích (exitation)
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng Nội dung Trang
1.1
Các dược liệu nghiên cứu và phương pháp sử dụng nghiên cứu
phát triển bộ dữ liệu chuẩn
9
1.2 Hoạt tính sinh học của acid oleanolic trong một số dược liệu 15
1.3
Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao
16
3.1
Nồng độ acid oleanolic thu được từ các quy trình xử lý mẫu khác
nhau
31
3.2
Hình Nội dung Trang
3.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết acid oleanolic 34
3.2
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động
MeOH: H
2
O (95:5)
35
3.3
Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động
MeCN: H
3
PO
4
0,1% có tỷ lệ khác nhau
36
3.4
Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN: H
3
PO
4
0,1%
(70:30)
37
3.5
Sắc ký đồ mẫu dược liệu với pha động MeCN: H
3
PO
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đinh lăng là một cây thuốc đã được đưa vào dược điển Việt Nam, có tác
dụng bổ ngũ tạng, tiêu thực, lợi sữa… Đây là một vị dược liệu có mặt trong
nhiều bài thuốc Đông y để chữa mệt mỏi, sốt lâu ngày, sưng vú, mẩn ngứa do dị
ứng, liệt dương, sốt rét…[1]. Theo GS. Ngô Ứng Long, đinh lăng có nhiều tác
dụng giống nhân sâm, đặc biệt là tác dụng tăng lực, tăng sức đề kháng, tăng khả
năng thích nghi với điều kiện bất lợi [14].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đinh lăng được thực hiện nhiều vào những
năm 70-90 với một các công trình nghiên cứu của Ngô Ứng Long [15], Nguyễn
Khắc Viện [21], Nguyễn Thới Nhâm [11] với các nghiên cứu sâu về tác dụng bổ
chung, tác dụng tăng lực, tác dụng sinh thích nghi, tác dụng trên tim mạch, tiết
niệu, hệ thống máu, hệ thần kinh trung ương, hoạt động sinh dục và hệ thống
enzym. Giai đoạn những năm 90 các nghiên cứu về thành phần hoá học ở mức
độ cao hơn đã được tiến hành, đã xác định cấu trúc phân tử của các hoạt chất
bằng các thiết bị phân tích hiện đại như UV, IR, NMR [20], [29], các nghiên cứu
này đều cho thấy trong đinh lăng có chứa các saponin triterpenoid với một genin
đã được xác định là acid oleanolic.
Trong những năm gần đây, cây đinh lăng cũng trở thành nguồn nguyên liệu
được đưa vào sản xuất thuốc Đông dược với sự ra đời của nhóm các sản phẩm
Hoạt huyết dưỡng não. Xã hội ngày càng phát triển, sức ép về công việc tăng
lên, nhu cầu về thuốc bổ thần kinh, tăng tuần hoàn não, đặc biệt thuốc có nguồn
gốc thảo dược ngày càng tăng. Sự phát triển của nhóm thuốc Đông dược nói
chung và các chế phẩm có chứa đinh lăng nói riêng trên thị trường Việt Nam đã
đặt ra yêu cầu cấp thiết về đảm bảo chất lượng thuốc. Trong điều kiện, xu hướng
2
trên thế giới hiện nay và theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới về nghiên
cứu thuốc từ dược liệu, ngoài các yếu tố như hiệu quả lâm sàng, độ an toàn,
nghiên cứu về cơ chế tác dụng, cần phải có các nghiên cứu về thành phần hóa
học cũng như các phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu một cách khoa học
lông chim dài 20 – 40 cm, không có lá kèm rõ. Lá chét có cuống gầy dài 3-10
mm, phiến lá chét có răng cưa không đều, lá có mùi thơm. Cụm hoa hình chuỳ
ngắn 7-18 mm gồm nhiều tán, mang nhiều hoa nhỏ. Tràng 5, nhị 5 với chỉ nhị
gầy, bầu hạ 2 ngăn có dìa trắng nhạt. Quả bẹt dài 3-4 mm, dày 1mm có vòi tồn
tại [13].
Dược liệu là phần dưới mặt đất của cây đinh lăng (rễ củ), được rửa sạch,
thái lát mỏng ngang, phơi sấy khô. Lát cắt ngang hình tròn, màu trắng ngà, trên
mặt vết cắt nhìn rõ gỗ xếp thành tia từ giữa toả ra. Lớp vỏ rễ dày, mặt ngoài vỏ
rễ màu trắng đục, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích
của rễ con còn sót lại. Dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, có mùi thơm, vị ngọt hơi
mặn [5].
1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến
Đinh lăng là một loại cây được trồng phổ biến làm cảnh ở khắp nước ta,
mọc cả ở Lào và miền Nam Trung Quốc [13].
Rễ củ đinh lăng thường được thu hái vào mùa thu hay mùa đông vì lúc này
hoạt chất tập trung ở rễ và rễ mềm hơn. Lượng rễ đinh lăng thu được tùy theo đất
xấu hay tốt, bón phân nhiều hay ít [1], [9].
4
Rễ củ được rửa sạch, rễ nhỏ để nguyên, rễ to chỉ dùng vỏ rễ. Thái mỏng,
phơi khô ở chỗ mát, thoáng gió để đảm bảo mùi thơm và phẩm chất. Khi dùng,
để nguyên hoặc tẩm rượu gừng 5%. Sao qua, rồi tẩm 5% mật ong, sao thơm
[1], [5], [9], [10].
1.1.3. Thành phần hóa học
Trong đinh lăng đã tìm thấy có các saponin, alcaloid, glucosid,, flavonoid,
tanin, các vitamin tan trong nước (B1, B2, B6, C) và 20 acid amin trong đó có
các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, tryptophan, cystein)
[1], [10], [14].
Một số tài liệu nghiên cứu về saponin trong đinh lăng cho thấy trong đinh
lăng có chứa saponin trong đó có một sapogenin đã được xác định là
[1], [9], [10].
1.1.5. Các chế phẩm chứa đinh lăng trên thị trường
Trong những năm gần đây, cây đinh lăng cũng trở thành nguồn nguyên liệu
được đưa vào sản xuất thuốc Đông dược với sự ra đời của nhóm các sản phẩm
Hoạt huyết dưỡng não. Một loạt các sản phẩm hoạt huyết dưỡng não trên thị
trường có thể kể đến là:
Hoạt huyết dưỡng não – Traphaco
Hoạt huyết dưỡng não – Dopharma (Công ty cổ phần dược phẩm TW2)
Hoạt huyết dưỡng não – PV (Công ty cổ phần dược thảo Phúc Vinh)
6
Hoạt huyết dưỡng não – HD (Công ty cổ phần dược vật tư y tế Hải
Dương)
Hoạt huyết dưỡng não – NDC (Công ty dược phẩm Thiên Nam)
Trà hoạt huyết dưỡng não (Công ty cổ phần dược phẩm Trang Minh)
Hoạt huyết dưỡng não – DHG (Công ty cổ phần dược Hậu Giang)
Hoạt huyết dưỡng não – Sophaco (Công ty cổ phần tập đoàn dược phẩm
và thương mại Sophaco)
Hoạt huyết dưỡng não (Công ty trách nhiệm hữu hạn Hiệp Phong)
Hoạt huyết dưỡng não Vinacare 20 (Công ty cổ phần Dược phẩm
Vinacare)
Trong đó, sản phẩm “Hoạt huyết dưỡng não - Traphaco” là một trong những
sản phẩm hàng đầu. Xã hội ngày càng phát triển, sức ép về công việc tăng lên,
nhu cầu về thuốc bổ thần kinh, tăng tuần hoàn não đặc biệt thuốc có nguồn gốc
thảo dược ngày càng tăng. Hàng năm công ty Traphaco sử dụng hàng trăm tấn
dược liệu đinh lăng phục vụ cho sản xuất dòng sản phẩm hoạt huyết dưỡng não
và dự kiến con số này còn tiếp tục tăng trong thời gian tới.
1.2. TÌNH HÌNH TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU VÀ CÁC
CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI
1.2.1. Về dược điển Việt Nam
Hoặc đối với một số nhóm hoạt chất, có các phương pháp định lượng riêng:
phương pháp chuẩn độ acid – base với nhóm dược liệu chứa alcaloid, phương
pháp định lượng tinh dầu…
8
Bước đầu đã có một vài chuyên luận sử dụng phương pháp hiện đại như
HPLC có sử dụng chất đối chiếu để định lượng. Ví dụ như chuyên luận “Chè
dây” định lượng bằng phương pháp HPLC – UV sử dụng dung chất đối chiếu là
dihydromyricetin, chuyên luận “Thổ hoàng liên” và chuyên luận “Vàng đắng”
định lượng bằng phương pháp HPLC – UV sử dụng chất đối chiếu là berberin.
1.2.2. So sánh với Dược điển của một số quốc gia khác trên thế giới
Dược điển Hàn Quốc (KP9) [41] có 181 chuyên luận về dược liệu trong
tổng số 1511 chuyên luận. Trong đó, các chỉ tiêu kiểm định chất lượng không có
sự nổi trội so với Dược điển Việt Nam IV [5].
Dược điển Thái Lan [40], cũng giống như Dược điển Hàn Quốc, có rất ít
chuyên luận về dược liệu với các phương pháp thông thường như TLC, phản ứng
hóa học, đo quang… để định tính và định lượng dược liệu và rất ít sử dụng chất
đối chiếu.
Dược điển Mỹ (USP 32) [42] chỉ có hơn 40 chuyên luận về dược liệu. Tuy
nhiên, mỗi chuyên luận hầu như đều sử dụng các phương pháp hiện đại (HPTLC,
HPLC, GC) với các chất đối chiếu để định tính, định lượng.
Dược điển Trung Quốc 2010 [36], cũng giống như Dược điển Mỹ, hầu hết
đều sử dụng các phương pháp hiện đại trong mỗi chuyên luận về dược liệu. Tuy
nhiên, điểm khác biệt so với Dược điển Mỹ là số chuyên luận về dược liệu lớn
hơn rất nhiều với 2165 trên tổng số 4567 chuyên luận.
1.2.3. Xu hướng nghiên cứu dược liệu và chế phẩm đông dược gần đây tại
Việt Nam
1.2.3.1. Nghiên cứu thiết lập “dấu vân tay” của một số dược liệu bằng
phương pháp TLC và HPLC
9
10
STT Dược liệu Phương pháp sử dụng
12 Đan sâm
TLC (có chất đối chiếu danshensu và không có chất đối chiếu)
HPLC không có chất đối chiếu
13 Địa cốt bì TLC và HPLC không có chất đối chiếu
14 Diệp hạ châu đắng TLC và HPLC có chất đối chiếu là phyllanthin
15 Đương quy
TLC (có chất đối chiếu acid ferulic và không có chất đối chiếu)
HPLC không có chất đối chiếu
GC – MS
16 Hạ khô thảo TLC và HPLC có chất đối chiếu là acid ursolic
17 Hoàng đằng TLC và HPLC có chất đối chiếu là palmatins
18 Hương phụ
TLC và HPLC không có chất đối chiếu
GC – MS
19 Kê huyết đằng TLC và HPLC không có chất đối chiếu
20 Kim ngân TLC và HPLC có chất đối chiếu là acid chlorogenic
21 Mã tiền TLC và HPLC có chất đối chiếu là strychnin và brucin
22 Mẫu đơn bì TLC và HPLC có chất đối chiếu là paeoniflorin
23 Mộc thông
TLC với chất đối chiếu là acid oleanolic
HPLC không có chất đối chiếu
24 Nghệ
TLC và HPLC có chất đối chiếu là curcumin
GC – MS
25 Ngưu tất TLC và HPLC có chất đối chiếu là acid oleanolic
26 Quế
TLC và HPLC có chất đối chiếu là aldehyd cinnamic
định tính, định lượng dược liệu là một xu hướng nghiên cứu mới trong giai đoạn
hiện nay không chỉ ở Việt Nam mà ở cả các nước khác trên thế giới. Do đó,
nhằm nâng cao khả năng kiểm soát chất lượng dược liệu đinh lăng, chúng tôi dự
định tiến hành xây dựng phương pháp định tính, định lượng dược liệu đinh lăng
sử dụng chất đối chiếu là acid oleanolic để góp phần xây dựng “dấu vân tay
HPLC” cho dược liệu đinh lăng, góp phần thuận lợi cho công tác tiêu chuẩn
hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu này và các chế phẩm từ dược liệu.
12
1.3. TỔNG QUAN NHÓM SAPONIN VÀ ACID OLEANOLIC
1.3.1. Tổng quan về nhóm saponin
Nhiều công trình nghiên cứu trước đây đã cho thấy thành phần hoạt chất
chính của đinh lăng là saponin thuộc nhóm saponin triterpenoid trong đó có một
sapogenin đã được xác định là acid oleanolic.
1.3.1.1. Định nghĩa glycosid và saponin
Glycosid là những hợp chất hữu cơ tạo thành do sự ngưng tụ giữa một
đường với một phân tử hữu cơ khác với điều kiện nhóm hydroxyl bán acetal của
phần đường phải tham gia vào sự ngưng tụ. Phần không phải là đường được gọi
là aglycon hoặc genin, có cấu trúc hóa học rất khác nhau, tác dụng sinh học phụ
thuộc vào phần này.
Saponin là một nhóm glycosid lớn, gặp nhiều trong thực vật. Phần genin
được gọi là sapogenin. Về mặt phân loại, dựa vào cấu trúc hóa học có thể chia
thành: saponin triterpenoid và saponin steroid.
1.3.1.2. Các phương pháp định tính saponin
a. Dựa trên tính chất tạo bọt
Đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do phân tử saponin lớn và có
cùng một lúc một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa vào hiện tượng
gây bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin steroid và saponin
triterpenoid.
Có thể định lượng saponin bằng nhiều phương pháp khác nhau:
Phương pháp cân
Phương pháp đo quang
Phương pháp HPLC
14
1.3.2. Tổng quan về acid oleanolic
1.3.2.1. Công thức hóa học [34
]
Tên khoa học: acid
(3β) – 3 – Hydroxyolean – 12 – en – 28 – oic
Phân tử lượng: 456,7 g/mol.
1.3.2.2. Tính chất hóa lý [34]
Bột kết tinh màu trắng, không tan trong nước, tan trong 65 phần ether, 108
phần alcol 95%, 35 phần alcol 95% sôi, 118 phần cloroform, 118 phần aceton,
235 phần methanol. Nhiệt độ nóng chảy 310
о
C, góc quay cực bằng + 83,3
о
,
pK
a
= 2,52.
1.3.2.3. Tác dụng sinh học của acid oleanolic
Nhân sâm (ginseng), rễ của cây nhân sâm Panax ginseng (họ Nhân sâm
Araliaceae), đã được sử dụng từ rất lâu đời bởi người dân ở các nước Đông Á
như là thuốc chữa bách bệnh và kéo dài tuổi thọ. Trong đó, người ta biết rằng,
tác dụng của nhân sâm là do thành phần hóa học saponin quyết định, với
[43]
Bột quả cây
Macrocarpium
officinalis
- Methanol:dd H
3
PO
4
:H
2
O
(88:0,05:11,95)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Kromosil C
18
(250 × 4,6mm; 5 μm)
UV
(210nm)
0,51–2,55 μg/ml
r = 0,9998
97,9%
RSD = 4,83%
(n=5)
[46] Vi nhũ tương
- Methanol:H
2
O (95:5)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
pH 5 bằng acid acetic băng
- LiChrosorb RP
18
(250 mm x 4,6 mm,
5 μm)
- Nhiệt độ phòng
(22°C)
DAD
(220 nm)
20
2,5-100 µg/ml
r
2
= 0,9997
98,9 -101,6%
[26]
Phần trên mặt đất
của cây
Mitracarpus
scaber
- MeCN–H
2
O (85:15)
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút
- SPHERISORB®
ODS (250× 4,6 mm,
5 μm)
thiệt thảo
(Oldenlandia
diffusa)
- MeOH: H
2
O (83:17 chứa 0,2%
NH
4
OAc, pH 6,74)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Cột: Zorbax Eclipse
XDB- C
18
(250 × 4,6
mm, 5 μm)
- Tiền cột: C
18
(7,5 ×
4,6 mm, 5 μm)
- Nhiệt độ phòng
UV
(210 nm)
20
5,03-201,2 μg/ml
r
2
= 0,9998
99,8%
5μm)
- Nhiệt độ cột: 30
0
C
FLD:
λ
ex
= 272 nm
λ
em
=505 nm
32 – 640 ng/ml
r = 0,9999
98,23 - 101,35%
Copyright: Tài liệu đại học ©