BỘ YTẼ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
socjgCOsoüg
PHẠM KHUÊ TÂM
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA SAPONIN KIM NGÂN
ĐỐI VỚI HOẠT Độ a- CHYMOTRYPSIN TRONG QUÁ
TRÌNH CHÓNG VIÊM
( KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ KHÓA 2001- 2006 )
Giảng viên hướng dẫn :Ths. Lê Thị Diễm Hồng
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá sinh
Thời gian thực hiện : 02 - 05/2006
Hà Nội, 05- 2006
sềđ%ẮẨ(ểJr
x ù t ủ à ụ t ¿ ừ in ỹ ể iế t ổ tt ế đ u iắ r Ỉứỉ ^ßff. ÍĨỈJ{ fL yfynỹễit ^^ u ãn
n /iíê m ấâ n w ti /ifiả ế in /t h rừ ĩn ự ( ề a ỉ h o e ÍJ'rứừ‘ ’} ( à t/irîf, tĩầ
^ỈIA. ỉ£ ê f /u iđ}iễm ờ /u ỉự cô íu ô tt ẹ n a )! tã m , fa n ũ n /i ầ ư đ n ọ f /ẫ it I‘à
/ tế f id n ọ ỸÌ(ự t đ ữ tô i /to à n f /ià n / i /tả n ỉtiđ n lĩă n n át^ ‘
^ôf xin cỉiărt f/iàn/i cảm iỉn, eắr tỉià ỹ ỸỈáũ, m ựiáo ùtiừỉnỹ Q'ai /ưi{'
iifûfr ^‘ỈCà d a r / í ỉê t c ắ e t h ầ y ựỉá<ì, cô ự iá o , cá c c ỉd Ẩ'f t / u ì đ t m ên , Ổ )ê
m ồ H >'J(<ìả u n h , đ ã Ỹ Ìú ịi đ ĩ i' tô i n / ù ê t ù n /t h o n ụ íìn ô t (fim ỉtìtiỉi íw e t ã ịt nà
t/tffc ỉừ ê n đ ê ừ ii.
x in c ả m (ĩn c /ia m e, n ỉiĩù K Ị nỹfừU th â n /ỉà ẫ a n á è đ ã ỉu ũ it e ể tm
đ S n /ỵ m ề n nà ỸÙ ựi đ ĩỉ tũ i ầOỉiỹ c a Se ếSÍưỵ -nà /ư.itự /to e tâfi,
'"Jía jV h i, H ỹày J8 ỉ/u ín ọ 0 5 H ầ m 2 0 0 (ì
ffin J i lũ ê n ^ ả a m J i / u f é
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN Đ Ề
1
Chương 1: TổNG QUAN 3
1.1. Cơ sở lý thuyết về viêm 3
1.2 . Các thuốc chống viêm 7
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIÊU THAM KHẢO
KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
a-CT a - chymotrypsin
c o x Cyclooxygenase
SKNC Saponin kim ngân cuộng
IL Interleukin
INF Interferon
NSAID Non-steroid anti-inflammatory drug(Thuốc chống viêm phi steroid )
PAF platelet activating factor ( yếu tố hoạt hóa tiểu cầu )
TNF Tumor necrosis factor ( yếu tố hoại tử khối u )
NOS nitric oxide synthetase ( enzym xúc tác tổng hợp NO)
ĐẶT VÂN ĐỂ
Viêm không phải là một bệnh cụ thể mà là một quá trình bệnh lý chung
gặp, nhiều bệnh khác nhau. Do đó viêm là một quá trình bệnh lý rất phổ biến,
do nhiều nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản úng bảo vệ cơ
thể giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm. Tuy nhiên, nếu viêm nặng
kéo dài dẫn đến tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng các cơ quan có thể
ở mức độ rất nghiêm trọng, nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân. Vì vậy, việc
phát huy tác dụng bảo vệ và ngăn ngừa các ảnh hưởng có hại của viêm là rất
cần thiết.
Việc nghiên cứu, ứng dụng các loại thuốc chống viêm đã được tiến hành
từ rất lâu và đã đạt được các thành tựu to lớn với sự ra đời của thuốc chống
viêm có cấu trúc steroid, thuốc chống viêm phi steroid (NSAID). Các thuốc
này đã được sử dụng nhiều năm nay, có hiệu quả chống viêm rất tốt. Tuy
nhiên bên cạnh tác dụng chống viêm hiệu quả và đa dạng, chúng còn chứa
đựng những yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp
xương, kích ứng đường tiêu hoá, ảnh hưởng tới quá trình đông máu
Chính vì vậy, cùng với sự phát triển của khoa học con người tiến hành
nghiên cứu tạo ra những thuốc chống viêm có chứa các enzym như protease
• Nguyên nhân bên trong.
- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡnơ.
- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất gian bào[10,6- 8]
1.1.2. Phân loại viêm.
- Theo nguyên nhân: viêm nhiễm trùng và viêm vô trùng.
- Theo vị trí; viêm nông, viêm sâu hoặc viêm bên ngoài và viêm bên trong.
- Theo thành phần dịch rỉ viêm: viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ.
- Theo tính chất:
+ Viêm không đặc hiệu, thường là viêm cấp.
+ Viêm đặc hiệu, thường là viêm mạn tính, do hậu quả của phản ứng kháng
nguyên - kháng thể.[ 4, 204]
- Theo diễn biến: viêm cấp và viêm mạn
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm
*1* Rối loạn vận mạch : Ngay khi yếu tố gây viêm tác động, tại chỗ lần lượt
xảy ra các hiện tượng:
• Co mạch chớp nhoáng: Xảy ra ngay khi có tác nhân kích thích, do
thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại.[4 , 204]
• Sau co mạch chớp nhoáng trong vòng vài giây là hiện tư ợ n g giãn
mạch. Đầu tiên là giãn tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh mạch, ở giai
đoạn này, có sự tăng lưu lượng lẫn áp lực máu, làm cho các mao mạch nghỉ
trở lại hoạt động, chứa đầy máu giàu oxy cung cấp năng lượng cho các tế bào
thực bào hoạt động tại ổ viêm, gây ra hiện tượng nóng và đỏ. [4,205], [10, 53]
• Phản ứng tuần hoàn mạnh quá dẫn tới các rối loạn nghiêm trọng như
giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây táng tính thấm thành mạch
làm cho thoát dịch rỉ viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản. Do sự
chèn ép của dịch rỉ viêm và do một số yếu tố mạch máu như tê liệt thần kinh
vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhớt của máu gây ứ máu làm mất
dần tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu oxy, gây rối loạn chuyển
hoá nghiêm trọng, làm tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện ( với
triệu chứng phù và đau).[4, 205-206]
phóng ra, duy trì và khuếch đại phản úng viêm. Những chất này có nguồn gốc
huyết tương, tế bào và tổn thương mô. Các chất trung gian hoá học gồm có:
• Các amin hoạt mạch
Histamin đựoc giải phóng ra do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp
ứng với các kích thích: Tổn thương vật lý ( chấn thương, bỏng), phản ứng
miễn dịch gắn kháng thể với dưỡng bào, các đoạn của bổ thể được gọi là các
độc tố gây phản vệ, các protein giải phóng histamin xuất phát từ bạch cầu, các
cytokin. Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch
của các tiểu tĩnh mạch. Serotonin giải phóng từ tiểu cầu bị kích thích khi kết
dính với sợi tạo keo, phức hợp kháng nguyên kháng thể, yếu tố hoạt hoá tiểu
cầu. Nồng độ serotonin tăng trong máu khi viêm. Serotonin có tác động tương
tự như histamin.[10, 82- 83], [7, 9]
• Các protease của huyết tương
Hệ thống bổ thể, trong đó đặc biệt có C5a và C3a làm tăng tính thấm
thành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu do giải phóng histamin bởi các dưỡng
bào. [10, 84],
Hệ thống đông máu và tiêu fibrin, bradykinin: đều bị hoạt hoá bởi yếu tố
Hageman.[10, 85 - 86]
• Các chất chuyển hoá c ủ a acid arachidonic: prostacyclin, thromboxan,
prostaglandin Ẽ2, leucotrien. Trong đó prostsglandin Ej đóng vai trò quan
trọng trong quá trình viêm, làm tăng tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu
tố khác làm tăng tính thấm thành mạch và gây đau. Leucotrien là chất trung
gian tiền viêm mạch, có tác dụng hoá ứng động bạch cầu.[10, 87-88]
• Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu( PAF) : Được gải phóng cùng với các chất
c h u y ể n h o á c ủ a a c id a r a c h i d o n ic , c ó tá c d ụ n g h o ạ t h o á b ạ c h c ầ u Ga n h â n t r u n g
tính, kích thích sự dính và xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng các enzym
tiêu thể, sinh oxy phản ứng và các eicosanoid.[7, 10]
• Các cytokin; gồm yếu tố h o ạ i tử khối u ( TNF-a và p) và interleukin (
IL-1, IL-6 , IL-8 ), là các polypeptid do đại thực bào và các lympho bào tiết
ra tham gia vào phản ứng miễn dịch tế bào, đồng thời giữ vai trò quan trọng
thuốc này là ức chế enzym cyclooxygenase (COX), do đó làm giảm quá trình
tổng hợp các prostaglandin và thromboxan từ acid arachidonic. Gần đây,
người ta nhận thấy cyclooxygenase có các isoenzym (COXl, C0X2). COXl
là enzym cấu tạo, tham gia tổng hợp các PG E2 và 12 có tác dụng bảo vệ : bảo
vệ niêm mạc dạ dày, chống ngưng kết tiểu cầu, giữ cho hoạt động sinh lý của
thận được bình thường. C0X2 là enzym cảm ứng, nhất là trong các phản ứng
viêm, tham gia tổng hợp các PG gây ra các triệu chứng viêm. Các thuốc chống
viêm phisteroid không chọn lọc ức chế cả COXl nên gây ra các tác dụng phụ
như loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài.[15, 617-655]
1.3. ENZYM ĐƯỢC s ử DỤNG LÀM THƯỐC CHỐNG VIÊM.
Ngày nay các enzym chống viêm được sử dụng rộng rãi bên cạnh các
thuốc chống viêm Steroid và phi Steroid. Các protease chống viêm có bản chất
tự nhiên hơn, có ưu điểm gần gũi với cơ thể người hơn nên đã phần nào giúp
tr á n h được tác dụng không mong muốn. Các enzym thường sử dụng là:
C h y m o try p s in , bromelain, seưatiopeptidase, amylase Mặc dù có nguồn gốc
khác nhau nhưng chúng dều có khả năng chống viêm trên động vật thực
nghiệm cũng như người.
8
1.3.1. a -Chymotrypsin.
a- C hymotrypsin là enzy m th u ỷ p h ân protein, thu được do ho ạt hoá
chymotrypsinogen chiết xuất từ tuỵ bò. Hoạt tính của thuốc không ít hơn 5
m ic ro k a ta l tro n g Img. a - C h y m o try p sin ở d ạ n g b ộ t k ế t tin h h a y b ộ t v ô định
hình màu vàng hay trắng vàng, tan trong nước.[16, 1689]
a- Chymotrypsin có trọng lượng phân tử 21.600, các tạo bởi ba chuỗi
peptid, số lượng acid amin là 241. Nó thuộc loại serin-protease ưu tiên cắt các
liên kết tyrosin, tryptophan, phenylananin, leucin.[9, 282-283’
ở d u n g dịch a - C h y m o try p s in c ó hoạt tín h m ạ n h n h ấ t ở pH=8. Độ ổ n đ ịn h
tốt nhất ở pH=3 và hoạt tính bị ức chế có thể phục hồi được.[16, 1689]
1.3.2. Tác dụng của a-chymotrypsin.
a- Chymotrypsin thuỷ phân các kinin, được giải phóng bởi kininogen
phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây ( rễ,
thân, lá, hoa, quả, hạt, vỏ cây )- Đây là một nhóm có nhiều tác dụng quan
trọng:[12, 173- 181]
- s a p o n in c ó tác dụng long đ ờ m chữa h o .
- Một số dược liệu chứa saponin có tác d ụ n g thông tiểu
- Saponin làm tăng tính thấm tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các
hoạt chất khác dễ hoà tan và hấp thu
10
- Một số saponin có tác dụng chống viêm, một số các tác dụng kháng
khuẩn, kháng nấm, ức chế virus
- Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm.
1.4.2.Cây kim ngân.
- Tên khoa học: Lonicera japónica Thunb., th u ộ c họ kim ngân
Caprifoliaceae.
- Tên gọi khác : Dây nhẫn đông.
- Bộ phận dùng: cây kim ngân cho các vị th u ố c :
+ Cành và lá kim ngân (Caulis cum folium Lonicera ) là cành và lá phơi sấy
khô của kim ngân.
+ Hoa kim ngân ( Flos Lonicera ) là hoa phơi hay sấy khô của kim ngân
- Thành phần hoá học:
+ h o a c h ứ a m ộ t f l a v o n o id .
+ Lá chứa loganin
+ Cây chứa saponin : lonicerosid A, lonicerosid B, lonicerosid c
HO
CH2OH
—o o
/' \ '\J
: OH
i '
cầu khuẩn, vi khuẩn thương hàn, trực khuẩn lỵ Shigella, trực khuẩn lỵ coli,
phế cầu khuẩn. Nước sắc lá kim ngân có tác dụng ức chế trực khuẩn lỵ
shigella, vi trùng phó thương hàn A, tụ cầu khuẩn
+ Tác dụng trên chuyển hoá chất béo: Kim ngân có tác dụng tăng cường
chuyển hoá chất béo.
+ Tác dụng trên đường huyết: Nước sắc hoa kim ngân làm tăng lượng đường
huyết trên thỏ trong vài giờ[ 8, 77]
+ Tác dụng chống choáng phản vệ; Nước sắc hoa kim ngân cho uống có tác
d ụ n g n g ă n c h ặ n c h o á n g p h ả n vệ ở c h u ộ t la n g .
+ Độc tính: Chuột chắt trắng, sau khi được uống nước sắc kim ngân liên tục
7 ngày với liều gấp 150 lần liều điều trị cho người, vẫn sống bình thường, giải
phẫu các bộ phận không thấy có gì đặc biệt. Điều đó chứng tỏ rằng, nước sắc
kim ngân không độc. [8,77]
- Công dụng và liều dùng:
+Công dụng: Thường dùng trị mụn nhọt, ban sởi, mày đay, lở ngứa, nhiệt
độc, tả lỵ, ho do phế nhiệt. Người ta con dùng kim ngân trị dị ứng( viêm mũi
dị ứng và một số trường hợp dị ứng khác) và trị thấp khớp.
+ Liều dùng: Ngày dùng 14 -15g hoa hay 10 -16g cành lá dưới dạng thuốc
sắc, hãm, cao, rưọoi thuốc hoặc hoàn tán. Có thể dùng riêng kim ngân hay phối
hợp với nhiều vị thuốc khác[ 8, 75- 77].
12
Chương 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1. NGUYÊN LIỆU.
2.1.1. Kim ngân cuộng.
Là thân, cành lá phoi sấy khô của cây kim ngân: Lonicera japónica
Thunb, thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae.
Thân, cành lá cây kim ngân( Lonicera japonicaThmih,Caprifoliaceae.)
được thu hái ở thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng
Yên và được Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội định tên khoa
Chuột cống trắng đực và cái, nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng lOOg
130g do trại chăn nuôi súc vật thí nghiệm Học viện 103 cung cấp.
2.3. THIẾT BỊ DỤNG cụ.
- Máy đo quang trung quốc 752.
- Máy ly tâm Hettich.
- Tủ lạnh.
- Tủ sấy.
- Máy điều nhiệt Mtakutesz.
- Dụng cụ đo thể tích chân chuột.
- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius.
2.4. HOÁ CHẤT THÍ NGHIỆM.
- Thuốc thử Gornall
- Dung dịch acid tricloacetic 10%:
Acid tricloacetic lOg
Nước cất vừa đủ 1 OOml
- Dung dịch đệm phosphat 0,03M( pH= 7,5 )
Na2HP04.12H20 10,745 Ig
KH2PO4 4,0827g
Nước cất vừa đủ 1000,0ml
16
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.
2.5.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzym.
a) Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của enzym, protein bị thuỷ phân gải phóng ra các peptid
có các acid amin. Xác định lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid
tricloacetic. Tủa này phản ứng với thuốc thử Gornall tạo màu tím hồng. Đo
quang phổ hấp thụ, ở bước sóng X =530nm, cuvet 1 cm.
b) Tiến hành:
Pha loãng a- Chym otrypsin tro n g du n g dịch NaCl 0,9% đến độ pha loãng
thích hợp.
Đơn vị hoạt động của enzym được tính là Katal hoặc ỊiKatal (1 ịikatal =
10 Katal). Katal là lượng enzym (a -chymotrypsin ) xúc tác thuỷ phân 1 mol
cơ chất ( casein) trong thời gian 1 giây.
Công thức tính kết quả như sau;
uKata. ^ A Ì06 g09 , B
y "23600.103 .t.m
A : Lượng casein bị thuỷ phân, tính bằng mg
B : Hệ số pha loãng của dịch enzym
23600 X 10^ : trọng lượng phân tử của casein, tính bằng mg.
209 : Số dây nối của một phân tử casein,
t : thời gian thực hiện phản ứng, tính băng giây,
m : Số lượng enzym đem thử, tính bằng mg.
2.5.2. Phưong pháp gây viêm.
Phương pháp gây viêm cấp theo mô hình của Winter [20 ]: Tiêm 0.1 ml
dun g dịch c aư ag en in 1 % vào dưới bề m ặt gan b àn chân phải sau của chuột.
2.5.3. Phưofng pháp thử tác dụng chống viêm.
Sử dụng phương pháp đo độ phù chân chuột theo mô hình của Winter [20]
18
Đo thể tích bàn chân sau của chuột tới khớp cổ chân vào thời điểm trước
khi ãêm thuốc và khi chân chuột phù to nhất sau khi tiêm thuốc.
- Lô chứng: chuột uống NaCl 0,9%
- Lô chuột thử dược liệu: Chuột được uống dịch chiết dược liệu bằng một
kim cong đầu tù vào các thời điểm thích hợp so với thời điểm gây viêm.
- Lô c h u ộ t th ử v ớ i a - C h y m o try p s in : c h u ộ t được t i ê m m à n g b ụ n g
a-chymotrypsin cùng thời điểm cho uống dịch chiết dược liệu.
- Lô thử tác dụng kết hợp: chuột được uống dịch chiết dược liệu và tiêm
m àng bụ n g a - C hymotrypsin vào các thời điểm n hư ch u ột ở các lô chuột thử
dược liệu và lô ch uột th ử a- Chymotrypsin
- Lô so sánh: chuột được uống indomethacin vào thời điểm 1 giờ trước
khi gây viêm.
pH=l) và ống thứ hai 5 ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 5
giọt dung dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả hai ống trong một
phút và để yên. Quan sát thấy cột bọt trong hai ống cao ngang nhau và bền
như nhau. Từ đó sơ bộ xác định đây là saponin triterpenoid.
- Phản ứng phá huyết: 4-5g gelatin ngâm trong lOOml dung dịch NaCl 0,9%
rồi hâm nóng 50-60°C trên nồi cách thuỷ cho tan. Sau khi để nguội khoảng
40”c, thêm 8ml máu bò đã loại fibrin, trộn đều rồi đổ lên đĩa petri. Khi thạch
đã nguội và đông, dùng miệng ống nghiệm nhỏ đục thành lỗ trên đĩa thạch.
Sau đó rót vào các lỗ những dung dịch có chứa saponin . Để yên và quan sát
thấy vòng phá huyết xung quanh các lỗ.
Từ kết quả của các thí nghiệm trên chúng tôi có thể kết luận trong dịch
chiết butanol từ kim ngân cuộng theo quy trình hình 2.1 có chứa saponin.
3.2. SẮC KÍ LỚP MỎNG:
- Dung dịch chấm sắc kí: cao đặc saponin hòa tan trong methylic để làm
dung dịch chấm sắc kí.
- Hệ dung môi khai tr iể n : ethylacetat : m ethanol : nước ( 100: 23 :7)
21
Copyright: Tài liệu đại học ©