i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
******************
TRẦN MẠNH HÀ
NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA
ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ
VÀ BỆNH UNG THƢ PHỔI LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2013
ii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn trân trọng nhất tới
các bệnh nhân đã hiến mẫu cho nghiên cứu này.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
PGS.TS. Lê Quang Huấn đã tạo điều kiện cũng như tận tình chỉ bảo và động
viên trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức quý báu cả về kiến thức
lẫn tinh thần từ tập thể phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ
sinh học.
Trong suốt thời gian khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng
quí báu của TS.BS Đào Huyền Quyên, Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Bạch Mai.
Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới chị.
Nhân dịp này em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô, bạn bè và
gia đình đã chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2013
Học viên Trần Mạnh Hà
iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
MỤC LỤC
Trang


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 2.4.2. Định lượng DNA tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế 26
2.4.3. Nhân đoạn gen bằng PCR 26
2.4.4. Phương pháp giải trình tự 30
2.4.5. Phương pháp phân tích chất lượng dữ liệu trình tự 31
2.4.6. Phương pháp tìm đột biến gen 32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Kết quả tách chiết DNA 33
3.2. Kết quả nhân gen PCR 35
3.3. Kết quả giải trình tự gen 38
3.4. Kết quả phân tích đột biến 40
3.5. Thảo luận 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 44
vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Bp Base pair (Cặp base)
DNA Deoxyribonucleic acid
D-loop Displacement loop

Quá trình sinh tổng hợp ATP trong ty thể
5
1.3
Cấu trúc hệ gen ty thể
7
1.4
Sự phân chia ty thể
10
1.5
Cơ chế sao chép mtDNA
11
1.6
Di truyền ty thể theo dòng mẹ
12
1.7
Cơ chế phát triển ung thư
15
1.8
Quá trình chết theo chương trình của tế bào
17
1.9
Sự phát triển của ung thư phổi
20
2.1
Sơ đồ nguyên lý PCR
28
2.2
Các bước của một chu kỳ PCR
29
2.3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Danh mục
bảng
Tên bảng
Trang
1.1
So sánh mã di truyền của gen nhân và gen ty thể
8
1.2
Các triệu chứng của ung thư phổi
18
2.1
Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
24
2.2
Phần mềm sử dụng
24
2.3
Sơ đồ nguyên lý PCR
30
3.1
Kết quả kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng phương
pháp OD
34
3.2
Thành phần dùng cho 1 phản ứng PCR
37

giới nghiên cứu công nhận. Các đột biến của mtDNA (Mitochondrial
Deoxyribonucleic) đã được phát hiện ở các bệnh ung thư như ung thư bàng
quang, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư cổ và đầu, ung thư thận, gan,
phổi, dạ dày và ung thư máu ác tính. Quan trọng hơn, vùng D-loop
(displacement loop) của hệ gen ty thể lại là nơi có tần suất đột biến cao, đặc
biệt là tại các vùng siêu biến như HV1 (hypervariable regions). Vì vậy đột biến
tại vùng D-loop tiềm ẩn nhiều mối liên quan tới phát triển ung thư.
Ung thư phổi trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng là bệnh
phổ biến và nguy hiểm trong tất cả các loại ung thư. Đây là bệnh có tiên
lượng xấu bởi tiến triển nhanh, di căn sớm, phát hiện bệnh thường ở giai đoạn
muộn. Ung thư phổi thường không có triệu chứng đặc biệt và có thể có các
đặc điểm giống như ở các bệnh lý khác gây ra. Vì vậy việc tiến hành các chẩn
đoán y học tin cậy là rất cần thiết. Việc xác định trình tự nucleotide vùng điều
khiển DNA ty thể được xem là công cụ hữu hiệu để đánh giá sự liên quan mật
thiết giữa tỉ lệ đột biến vùng điều khiển gen ty thể với sự phát triển, biểu hiện
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ung thư phổi. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành “Nghiên
cứu mối liên quan giữa đột biến trong vùng điều khiển hệ gen ty thể và
bệnh ung thƣ phổi”
2. Mục tiêu
Giải trình tự vùng D-loop tách chiết từ mẫu bệnh phẩm (máu) của bệnh
nhân ung thư phổi tại bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội – Việt Nam và
người khỏe mạnh.
So sánh trình tự đoạn gen HV1 vùng D-loop với các trình tự tham khảo
công bố trên ngân hàng gen và tìm điểm đột biến đặc trưng cho bệnh
nhân ung thư phổi ở Việt Nam.
Đề xuất chức năng đột biến gen ty thể liên quan tới bệnh ung thư phổi.

được sự tồn tại của vật liệu di truyền ty thể (Nass and Nass, 1963; Schatz and
Klima, 1964). Từ đó đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực ty thể đã phát
triển mạnh từ giải trình tự hệ gen ty thể, nghiên cứu chức năng cơ bản của ty
thể cũng và những bệnh liên quan tới rối loạn chức năng ty thể. Trong phần
này, chúng tôi sẽ giới thiệu về (1) cấu trúc ty thể, (2) hệ gen ty thể và di
truyền gen ty thể, (3) Rối loạn cấu trúc/chức năng ty thể và các bệnh liên
quan.
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

1.1.1. Cấu trúc ty thể

Hình 1.1. Cấu trúc ty thể
Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn (Hình 1.1). Tùy
thuộc vào tế bào, ty thể có cấu trúc tổng thể khác nhau. Nhìn chung ty thể có
hình hạng phổ biến là hình que hoặc bầu dục với kích thước 5 - 10 µm x 2 – 3
µm. Ty thể có cấu trúc màng kép bao gồm màng ngoài ty thể và màng trong
ty thể. Hai màng này có chức năng hoàn toàn khác biệt với nhau. Lớp màng
ngoài ty thể bao trùm toàn bộ ty thể, tạo nên ranh giới ngoài của nó với tế bào
chất. Lớp màng trong ty thể tạo thành các nếp gấp gọi là mào ty thể (cristae)
hướng vào tâm. Mào ty thể là nơi chứa các bộ phận cần thiết cho quá trình hô
hấp và tổng hợp ATP (adenosine triphosphate). Các màng ty thể chia bào
quan này thành hai khoang khác biệt nhau: “khoang chứa chất cơ bản” nằm
bên trong ty thể, và “khoang liên màng” nằm giữa lớp màng ngoài và màng
trong. Màng ngoài chứa các Protein tạo kênh (Porin) cho phép tất cả các phân
tử < 5 kDa đi qua. Màng trong được cấu tạo phần lớn từ cardiolipin, là các
nếp gấp, được gọi là mào ty thể. Lớp màng trong chỉ cho phép thấm lọc một
số ion. “Khoang liên màng ty thể” có chứa các enzyme tham gia quá trình
phosphoryl hoá, oxy hoá và tổng hợp ATP. “Khoang chứa chất nền” bên


cấu trúc protein và cấu trúc màng ty thể. Điều này dẫn tới kết quả chết tế bào
theo chương trình. Khi tế bào chết một cách bất bình thường do mất chức
năng ty thể thì chức năng của các cơ quan sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng (Wu
et al., 2013).
Ty thể còn có các chức năng chuyên biệt khác tùy thuộc vào loại tế bào
mang chúng. Ty thể tham gia vào các quá trình xây dựng, phân hủy, tái tạo
các sản phẩm cần thiết cho các hoạt động của tế bào biệt hóa. Ví dụ, một số
các thành phần tạo DNA và RNA được tổng hợp trong ty thể. Ty thể còn
tham gia tổng hợp một phần máu và hormone như estrogen và testosterone.
Ty thể cũng rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất và thải độc ammonia.
Vì vậy, nếu ty thể không hoạt động đúng chức năng, không những việc tạo
năng lượng bị ảnh hưởng mà các sản phẩm phục vụ cho các chức năng tế bào
chuyên biệt cũng bị ảnh hưởng (Hernandez-Resendiz et al., 2013).
1.1.3. Hệ gen ty thể
Như đã giới thiệu, ty thể có mang chất liệu di truyền (mtDNA) trong
“khoang chứa chất nền”. Phần lớn các động vật có xương sống có hệ gen ty
thể gồm 1000 – 5000 phân tử mtDNA dạng vòng (Goldstein và Shmookler
Reis, 1984). mtDNA tập trung trong “khoang chứa chất nền” và thường gắn
kết với các protein và lipid. Ở người, hệ gen ty thể là một phân tử mtDNA sợi
kép, cấu trúc vòng với kích thước 16.569 bp, mã hóa cho 13 polypeptide
(Hình 1.3).
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu Hình 1.3. Cấu trúc hệ gen ty thể
Tất cả 13 polypeptide này đều là thành phần cấu trúc của phức hệ
phosphoryl hóa oxi hóa phức tạp (OXPHOS), bao gồm 7 tiểu đơn vị của phức

ở vùng D-loop và được bảo tồn ở rất nhiều loài động vật có xương sống nên
chúng được cho rằng có vai trò quan trọng trong quá trình nhân đôi của
mtDNA. Ví dụ, CSB I có vị trí ngay gần vùng khởi đầu của quá trình nhân
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

đôi chuỗi nặng (Walberg and Clayton, 1981). Thêm nữa, vùng D-loop còn
chứa các vùng siêu biến. Những vùng này có tần suất đột biến cao hơn đáng
kể so với các vùng khác của hệ gen ty thể (Greenberg et al., 1983). Có một số
điểm trong vùng này được coi là điểm nóng (hot spot) của đột biến
(Stoneking, 2000). Hai vùng siêu biến HV1 (vị trí 16024-16383) và vùng
HV2 (vị trí 57-372) được biết đến như là nơi tập trung các điểm nóng đột
biến. Hai vùng siêu biến HV1 và HV2 đã được sử dụng trong rất nhiều trong
nghiên cứu pháp y (Ginther et al., 1992). Quan trọng hơn, những vùng siêu
biến cũng như toàn bộ vùng D-loop gần đây đã được phát hiện có nhiều liên
quan tới ung thư, các bệnh tim mạch và bệnh của khu thần kinh trung ương
(Miyazono et al., 2002). Chức năng và đột biến gen ty thể liên quan tới bệnh
học sẽ được thảo luận chi tiết hơn ở những phần tiếp theo.
1.1.4. Sự phân chia ty thể và quá trình sao chép gen ty thể
Ty thể tái bản nhiều lần như các tế bào vi khuẩn. Đầu tiên ty thể phải
tái bản DNA của chúng, sau đó chúng to lên gấp đôi, trải qua sự sinh sản nhân
đôi và lớp gấp nếp bên trong sẽ co lại ở chính giữa kéo theo màng ngoài co
lại, cuối cùng chúng tách hẳn thành 2 ty thể mới hoàn toàn giống ty thể mẹ
(Berger and Yaffe, 1996).
Gen ty thể có khả năng tự sao chép và không phụ thuộc vào sự phân
chia của tế bào (Clayton, 2003). Tuy nhiên, sự biểu hiện gen và bảo trì
mtDNA cũng phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố được mã hóa bởi gen nhân.
Những yếu tố này được tổng hợp trong tế bào chất sau đó được vận chuyển
vào ty thể qua các kênh vận chuyển chuyên biệt (Attardi and Schatz, 1988).

phẩm cuối cùng là DNA hoàn chỉnh (Yang et al., 2002). Khác với mô hình
SD, mô hình LLSC đề xuất rằng quá trình sao chép sợi nặng và sợi nhẹ diễn
11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

ra đồng thời (Hình 1.5C). Việc khởi đầu sao chép diễn ra trên diện rộng tại
vùng chứa trình tự khởi đầu sao chép, sau đó quá trình sao chép diễn ra đồng
thời nhưng theo hai chiều đối ngược nhau. Sao chép mtDNA chỉ dừng lại tại
vùng D-loop (Bowmaker et al., 2003). Ở cả ba mô hình, quá trình sao chép
mtDNA cần rất ít protein chức năng bao gồm các tiểu đơn vị DNA
polymerase γ, mtDNA helicase Twinkle, sợi đơn mtDNA có trình tự gắn kết
protein, và mtRNA polymerase (với chức năng chính là mtDNA primase).
Đột biến gen mã hóa cho các protein này liên quan tới các bệnh ở người và
quá trình lão hóa sớm.

Hình 1.5. Cơ chế sao chép mtDNA
1.2. Di truyền gen ty thể và đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học
1.2.1. Di truyền gen ty thể
Trong nhiều thập niên nghiên cứu, các nhà khoa học cho mtDNA chủ
yếu được di truyền từ mẹ (99,99% mtDNA). mtDNA trong tinh trùng của
người cha được coi là bị phân hủy ngay lập tức sau khi trứng được thụ tinh
(Berger and Yaffe, 1996). Các nghiên cứu về cây phả hệ cũng chỉ rõ mối liên
12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

quan của các bệnh ty thể và di truyền theo dòng mẹ (Chen and Butow, 2005).
(Hình 1.6).


gây độc của nó. Nếu tồn tại được thì đột biến đứt đoạn cần có sự bổ trợ của
yếu tố khác (ví dụ: gen nhân). Rất nhiều đột biến thay thế trong mtDNA liên
quan đến bệnh, chẳng hạn như các đột biến liên quan đến các bệnh về cơ, não,
đột quỵ, nhiễm acid lactic (MELAS). MELAS có thể xem như là sự sai khác
mtDNA thường gặp nhất, đây là loại đột biến điểm A => G ở vị trí 3243 trong
gen mã hoá cho tRNALeu (Goto và cs., 1990). Nhiều trường hợp tái sắp xếp
của mtDNA cũng đã được xác định (Mitomap, 2001) bao gồm sự đứt đoạn,
nhân đôi đoạn, thêm đoạn, tổ hợp của tất cả các loại đột biến này (Poulton và
Holt., 1994 ; Kajander và cs. 2000). Những đột biến này tạo ra sự đa dạng về
các triệu chứng ảnh hưởng đến hệ cơ bắp, tim, hệ thần kinh trung ương và các
mô khác (Zeviani và cs., 1998). Đột biến đứt đoạn đầu tiên được tìm thấy
trong cơ bắp của bệnh nhân mắc bệnh về cơ do ty thể gây ra đã được Holt và
cs phát hiện, công bố năm 1988, và sau đó các loại đột biến trên đã được xác
định trong bệnh nhân mắc bệnh (Keams – Sayre, KSS), liệt mắt tăng dần mãn
tính (Chronic Progressive ophthalmoplegia, CPEO), bệnh tiểu đường mellitus
di truyền theo dòng mẹ, bệnh cận thị.
Rất khó có thể xác định chính xác tần suất bệnh liên quan đến đột biến
ty thể vì sự đa dạng trong biểu hiện bệnh và sự đa dạng trong các tác nhân gây
đột biến. Tuy nhiên, có những nghiên cứu tập trung vào đột biến điểm và chỉ
ra được tần suất bệnh ty thể. Ví dụ, nghiên cứu đột biến điểm (3243 A>G) ở
Phần Lan chỉ ra rằng 1/6000 cá thể mang bệnh liên quan đột biến này trong
khi đó tần suất này ở Anh cao hơn nhiều (1/3500) (Majamaa et al., 1998).
14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Ngày càng có nhiều bằng chứng ở cả nghiên cứu trên động vật (Trifunovic et
al., 2004) và trên người (Muller-Hocker, 1990) về đột biến mtDNA và rối
loạn chức năng ty thể có tham gia vào quá trình lão hóa và các bệnh lão hóa
(ví dụ, tiểu đường) và ung thư và cs, 2003; Taylor and Turnbull, 2005). Tới

độ lão hóa cao như hiện nay, Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế
(International Agency for Research on Cancer – IARC) dự báo đến năm 2020
sẽ có khoảng 16 triệu trường hợp ung thư mới (IARC, 2013).
1.3.1.2. Cơ chế và nguyên nhân gây ung thƣ

Hình 1.7. Cơ chế phát triển ung thư
Hầu hết các tế bào ung thư đều bằng cách này hay cách khác có được những chức năng
liên quan tới phát triển bệnh: (1) Nhạy cảm với tín hiệu sinh trưởng; (2) Không nhạy cảm
với tin hiệu ức chế sinh trưởng; (3) có khả năng di chuyển và di căn, (4) khả năng nhân tế
bào không giới hạn, (5) có khả năng tạo mạch bền vững, và (6) có khả năng trốn tránh sự
chết tế bào theo chương trình.
Quan điểm hiện nay về nguyên nhân gây ra khối u ác tính là do có đột
biến của vật liệu di truyền trong các tế bào, dẫn đến sự nhân đôi tế bào không
kiểm soát. Ở những điều kiện đặc biệt, những tế bào ung thư di chuyển, xâm
nhập vào hệ tuần hoàn, và được phát tán tới các mô và cơ quan khác; và kết
quả là các khối u (lành tính hoặc ác tính) được hình thành. Hầu hết (nếu như
không muốn nói là tất cả) các tế bào ung thư đều bằng cách này hay cách
khác có được khả năng liên quan tới phát triển bệnh như: có khả năng sinh
16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

trưởng không giới hạn; có chức năng di căn, tạo mạch máu và duy trì độ bền
vững của mạch máu; và có khả năng trốn tránh sự chết tế bào theo chương
trình (Hình 1.7).
Một mặt, các tế bào ung thư rất nhạy cảm với các tín hiệu sinh trưởng.
Bình thường các tế bào cần có tín hiệu sinh trưởng (growth signals – GS)
trước khi chúng chuyển từ giai đoạn nghỉ sang giai đoạn phân chia tế bào.
Những tín hiệu này được truyền vào tế bào bằng các thụ thể xuyên màng có
khả năng tương tác với các phân tử truyền tín hiệu bao gồm: các phân tử sinh

sinh học và là một quá trình quan trọng giúp cân bằng giữa phân chia tế bào
và sự chết của tế bào nhằm bảo toàn số lượng tế bào cho cơ thể (Cheng et al.,
2004). Quá trình chết theo chương trình diễn ra qua hai con đường: qua các
thụ thể chết (lộ trình bên ngoài) và qua ty thể (lộ trình bên trong). Hình 1.8. Quá trình chết theo chương trình của tế bào
Quá trình chết của tế bào theo chương trình diễn ra theo thứ tự và
không tác động và lan truyền bừa bãi tới các tế bào xung quanh ( Hình 1.8). Ở
cấp độ tế bào, quá trình này đặc trưng bởi một sự khởi phát làm thủng các tế
bào và sau đó phá vỡ những mối liên hệ tế bào với tế bào. Các tế bào co tròn
lại, màng nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất. Các
Chết tế bào theo chƣơng trình
Tế bào bình thƣờng
Màng tế bào bị vỡ
Tế bào bị kéo dãn và nhân bị cô đặc
Hình thành quả thể
apoptotic
Phân hủy
quả thể
apoptotic
Nhân bị phá hủy và
tiếp tục quá trình vỡ
tế bào

Trích đoạn Kết quả nhân gen PCR

---