3

2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa
2.1 Khái niệm về gốc tự do
Oxy đƣợc xem nhƣ một nguyên tố quan trọng giúp con ngƣời duy trì sự
sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lƣợng cung
cấp cho mọi hoạt động sống của con ngƣời.
Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng
oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy
tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn
gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và đƣợc gọi chung là các gốc dạng
oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species)
1,2
.
Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O
2
•–
), đây là gốc
tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde (O
2
•–
) nhiều gốc tự do và các
phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao đƣợc tạo ra nhƣ hydroxyl
(HO
●
), hydroperoxyl (HOO
●
), peroxyl (ROO
●
), alkoxyl (RO
●

bóp cơ thịt
2
.
2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con ngƣời
mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày.
Nếu không đƣợc kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa nhƣ:
ung thƣ, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm
trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở ngƣời cao niên, phá rách màng tế
bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát, tế bào không tăng trƣởng, tu bổ, rồi chết.
Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dƣới da khiến ta có những vết đồi mồi trên
mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp
các phân tử protein, đƣờng bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở
DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn
nheo, cơ khớp cứng nhắc
2,38
.
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau
đây: Trƣớc hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất
bã và tiếp nhận thực phẩm, dƣỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá
vỡ nguồn cung cấp năng lƣợng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy
yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trƣởng đƣợc
2,38
.
Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ
gây tử vong. Hóa già đƣợc coi nhƣ một tích tụ những đổi thay trong mô và tế
bào. Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân
gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên
ty lạp thể, gây tổn thƣơng các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu
trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lƣợng

thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu. Dƣới đây chúng tôi xin giới thiệu một
số phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa đơn giản, ổn định và đã đƣợc
sử dụng rộng rãi trong thực tế.
6

2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có
màu tím đậm, hầu nhƣ không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản
ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). DPPH
•

là một gốc tự do có màu tím giống nhƣ màu của dung dịch KMnO
4
, không tan
trong nƣớc, tan trong dung môi hữu cơ. Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại
bƣớc sóng 517nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine
(DPPH-H) thì có màu vàng cam
3,5,8,19,23,36,51
.
Ngày nay DPPH đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do.
Phƣơng pháp này rất hữu hiệu đƣợc dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và
dễ ổn định.
Nguyên tắc
Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách
cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch
phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa đƣợc minh họa
bằng phản ứng đƣợc mô tả bên dƣới:


mạch máu. Ngoài ra, khi lƣợng NO sản xuất quá nhiều thì chính nó sẽ trở thành
N
N
NO
2
O
2
N
NO
2
+
N
NH
NO
2
O
2
N
NO
2
+
AAH
DPPH
Chất kháng oxy hóa
hhoa
DPPHH
8

chất nội độc tố và khi đó NO còn phản ứng với các ROS gây hại cho cơ thể, ví dụ
gốc tự do ONOO

có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo
thành, ta tính đƣợc khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên %
ức chế)
5,8,33,39
.

Hình 2. Cơ chế phản ứng lên màu nitrite bằng thuốc thử Greiss
Thuốc thử Greiss là hỗn hợp của hai dung dịch: N-1-napthylethylene
diamine dihydrochloride (NED) và sulfanilamide trong môi trƣờng H
3
PO
4
. Cơ
chế của phản ứng tạo sản phẩm màu diazo hóa nhƣ trên.

N
H
2
H
2
N
O
2
S
N
2
+
H
2
N

2
S
N
N
H
C
H
2
C
H
2
N
H
2
N

9

2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA
MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy
hóa lipid màng tế bào nên đƣợc áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá
trình peroxy hóa lipid của màng tế bào.
Nguyên tắc
MDA đƣợc sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho
phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử
acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 532 nm, phản
ứng đƣợc thực hiện ở môi trƣờng pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100

SNO
H
CH
2
CHO
HOC
2
+
-2 H
2

t
o
10

2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating
activity)
Nguyên tắc:
Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Khi
cho ion Fe
2+
tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có cực đại hấp
thu tại bƣớc sóng  = 562nm
5,7,28
.
Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn tại ở
dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại.
Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ đƣợc thể hiện qua việc ngăn chặn
tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe
2+

sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát:
11

RH + H
2
O ROH + 2H
+
+ 2e
─

Phản ứng xảy ra tại tâm Mo, Mo bị khử từ Mo (VI) xuống Mo (IV), và
trong quá trình phản ứng, các electron tạo thành đƣợc chuyển tới các tâm nhận
electron trong enzyme
21
.
Với chất nền là xanthine, cơ chế phản ứng hydroxygen hóa dƣới sự hiện
diện của XO đƣợc các nhà khoa học đề nghị nhƣ sau
21
:

Hình 4. Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric.

2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO
Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy
hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O
2
●
. Acid uric
có bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Nếu mẫu thử có khả năng kháng
O

, e
MoS
S
O
O
S
N
N
N
N
O
O
H
H
H
HO
, H
e
Mo
OH
S
O
S
S
+
HN
NH
NH
N
O


enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm
giá trị mật độ quang.
Hình 5. Phản ứng tạo acid uric
Các phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng đƣợc sử
dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng nhƣ
kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này đƣợc gọi là các chất kháng
oxy hóa. Chúng có thể đƣợc sinh ra từ cơ thể nhƣ hệ thống kháng oxy hóa có
bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò
thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và
những chất kháng oxy hóa có phân tử lƣợng thấp nhƣ glutathinon, vitamin E,
vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả nhƣ
các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin
3,9
.

3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào
3.1 Nuôi cấy tế bào
Dòng tế bào ung thƣ ruột kết ngƣời DLD-1 đƣợc thu từ bộ sƣu tập tế bào
American Type và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng McCoy’5A có bổ sung các
thành phần dinh dƣỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trƣờng CO
2

5% tại 37

+
H
2 2