BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ LỊCH
NGHIÊN CỨU Sự ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ BIÊN ĐẾN
THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT s ố TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA NGƯU TẤT
m
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999-2004)
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
NƠI THỰC HIỆN:
THỜI GIAN THƯC HIÊN:
TS. VŨ VĂN ĐIẾNs
TS. NGUYỄN THÁI AN
BỘ MÔN DƯỢC HỌC c ổ TRUYỀN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
3/2004-5/2004
HÀ NỘI, 05 - 2004
m
J l d i C jO L W L Ổ V L
rĩrotKỊ ha tháíiụ flute hiên Ulioá Luân tất ntịliiệịì tồi đã nhận
(tíìỢe sự giúp. ĩtõ' tản tình của oáo fit ắt/ eỗ cùng, cúc htut tvứnạ. hê
mồn. QlliAễL (lìp ft (tí/ tôi dtin (tiioe hỉiíị tẻ ỉòiUỊ l-únit tvotitị oil hièt
f)’tt ÍÁIL
J
a e tối của thà ụ cô:
rĩíS. a)ã (Vàn ^Đíềtt
CĩcS . QlạuụẪn Qhál cẦn
Qỉhữuạ tiạưồi (Tã tt'lie tìêp liiiíhiạ dẫn túi tVú ti tị iiiồt quá
tvìnli tliựe kiện đề tài.
xjêì eũnạ. xin gửi Lài t‘ảm ớn tâi cắc ihầỊỊ, eáe eô ỏ' hò Ittfhi
rOiì(íe 'ăùoe @ê- CĩruụềtL, mô ti ^ ũ iùỉe hị, (Dièti (Dưđn MiêiL,

30
2.2.6. Kiểm tra độ nhiễm khuẩn của sản phẩm chế37
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 41
3.1. Kết luận 41
3.2. Đề xuất 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHÚ GIẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
M,:
Mẫu sống
M2: Mẫu trích rượu.
M3:
Mẫu trích muối.
PT: Chỉ số của hệ đông máu ngoại sinh.
APTT:
Chỉ số của hệ đông máu nội sinh.
TT:
Chỉ số ức chế quá trình chuyển fibrinogen thành fibrin.
DD: Dung dịch
tb: Trung bình
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
STT:
Số thứ tự
CSB:
Chỉ số bọt
CSPH: Chỉ số phá huyết
tt:
Thuốc thử

thành củ hình trụ, dài 15- 30cm, đường kính 0,3-lcm. Đầu trên mang vết tích
của gốc thân, đầu dưới thuôn nhỏ. Mặt ngoài màu vàng nâu, có nhiều nếp
nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con [6].
Trồng bằng hạt vào tháng 10-11 (ở đồng bằng) hoặc tháng 2- 3(ở vùng núi)
[21].
1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
*Rễ có các saponin, khi thuỷ phân cho các sapogenin là acid oleanolic
C30H48 0 3 [4] và galactose, rhamnose, glucose [7], [21], [32]. Hàm lượng acid
oleanolic được xác định là 0,91 %-1,14% ở ngưu tất trồng [32].
Ngoài ra còn có các steron ecdysteron, inokosteron [4], [14], [21], [32],
chất
dính, muối kali [24], physcion và emodin [32].
2
Dịch chiết cồn của ngưu tất đã được chứng minh có terpenes, amino acid
[34].
Rễ cây cũng chứa các polisaccharide với lượng khoảng 42g/2.000g theo
khối lượng khô [32].
Betain chiếm khoảng 0,930-1,029% ở trong rễ và là một chất bền vững
trong quá trình chế biến thuốc [25], [32].
* Phần trên mặt đất của cây Achyranthes bidentata Blume trồng tại Việt
Nam có chứa 3 flavonoid, 6 saponin triterpenoid, 2 acid phenolic. Từ hỗn hợp
các polyphenol và saponin bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký chế hoá đã
phân lập và xác định cấu trúc 3 chất tinh khiết là: quercetin 3-0-rutinoid
(rutin), acid cafeic và beta-D-xylopyranosyl-beta-D-glucopyranosid của acid
oleanolic [18], [32].
1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ
Rễ ngưu tất có tác dụng hạ cholesterol máu và hạ huyết áp [4], [7], [15],
chống viêm, làm giảm áp lực mạch máu [32], chống đông máu [10], [20].
Saponin có tác dụng tăng co bóp tử cung [4], phá huyết và làm đông vón
albumin [14].

tích, tục
đoạn; nếu thấp mà thiên về nhiệt thì phối hợp với hoàng bá [2], [5].
4
- Chỉ huyết: Thường dùng trong các trường hợp hoả bốc lên gây nôn ra máu,
chảy máu cam; có thể dùng thêm thuốc tư âm giáng hoả và thuốc chỉ huyết
khác hoặc chảy máu do huyết ứ gây thoát quản [2], [5].
- Lợi niệu, trừ sỏi: Dùng trong các trường hợp tiểu tiện đau buốt, tiểu tiện ra
sỏi [2], [5].
- Giáng áp: Dùng trong các bệnh cao huyết áp, do có khả năng làm giảm
cholesterol máu [2].
- Giải độc, chống viêm: Dùng phòng bệnh bạch hầu [2], [5]
Cấm kỵ: Người có thai, người bị mộng hoạt tinh, người đang rong kinh
hoặc đang có chảy máu nhiều không nên dùng. Nếu dùng với tính chất để khí
vị đi xuống hạ tiêu, chữa các bộ phận phía dưới thì dùng không qua chế biến.
Khi sao rượu, trích nước muối hoặc tẩm rượu rồi chưng thì có tác dụng bổ [2],
[5].
1.5. CHÊ BIẾN, BÀO CHÊ c ổ TRUYỀN.
Chếbiến (sơchếsau khi thu hoach)
- Đào về, cắt bỏ cây sát đầu củ, phơi qua 1-2 ngày cho củ tái để đỡ bị giòn
gãy. Đem xông sinh 1 ngày, sau đó đem rửa sạch và sấy ở 40-50°C cho đến
độ ẩm khoảng 15-18%; sau đó phân loại, bó thành bó nhỏ để bảo quản [22].
Bào ch£_cổ_truỵềnỊm
Khi sử dụng làm thuốc thường phải qua khâu bào chế cổ truyền, thường có
các
phương pháp chế sau đây:
- Thái phiến hoặc cắt đoạn.
Ngưu tất được, ủ mềm, thái phiến, vát dàyl-3mm (nếu rễ to); cắt đoạn 3-
5mm (nếu rễ nhỏ), phơi khô hoặc sấy qua để dùng [16], [24].
5
- Sao cám.

-Máy phân tích máu tự động (CA 1000 của Nhật).
-Tủ sấy Memmert (Đức).
* Động vật thí nghiệm:
- Chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh, trọng lượng 18- 20g/con do Viện vệ sinh dịch
tễ cung cấp.
- Chuột cống trắng khoẻ mạnh, trọng lượng 120- 150g/con đạt tiêu chuẩn thí
nghiệm.
7
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm:
2.1.2.1 Bào chê ngưu tất:
Tiến hành bào chế theo phương pháp cổ truyền trích rượu, trích muối và
dùng sống theo các tài liệu [3], [16], [24].
2.1.2.2. Hoá học:
* Định tính một số nhóm chất trong ngưu tất: Định tính một số nhóm
chất trong các mẫu ngưu tất sống (Mj), ngưu tất trích rượu (M2), ngưu tất
trích muối (M3) bằng phản ứng hoá học sử dụng thuốc thử đặc trưng của
mỗi nhóm chất theo các tài liệu [4], [9], [17].
* Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng: Tiến hành định tính các mẫu
ngưu tất Mị, M2, M3 với bản mỏng Silicagel GF254-Merck tráng sẩn [4],
[6], [9].
Khai triển trên nhiều hệ dung môi và chọn hệ tách tốt nhất ghi lại kết quả.
* Xác định chỉ số bot:
Chỉ số bọt là số ml nước để hoà tan saponin trong lg nguyên liệu cho một
cột bọt cao lcm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện qui định) [4].
Chỉ số bọt (CSB) tính theo công thức (A):
CSB = kx (A)
a X n
Trong đó: V: thể tích dịch chiết đem xác định chỉ số bọt (ml).
a: khối lượng dược liệu (g).
n: số thứ tự của ống nghiệm có cột bọt cao lcm.

Pt: Lượng bột dược liệu đã cân (g).
Pc: Lượng acid Oleanolic đã cân (g).
b: Độ ẩm của dược liệu (%).
9
'x% = Dtx Q’025 x Ỉ(M X100 (D)
Dc X p X (100 - b)
x%: Hàm lượng đường tự do tính theo Glucose.
Dt: Mật độ quang của ống thử.
Dc: Mật độ quang của ống chuẩn.
P: Lượng bột dược liệu đã đem cân (g).
b: Độ ẩm của dược liệu (%).
2.1.2.3 Thử một sô tác dụng sinh học:
> Thử tác dụng chông đông máu:
Được tiến hành trên máy phân tích máu tự động (CA 1000 của Nhật) tại
trung tâm nghiên cứu phòng chống ung thư.
- Để thăm dò tác dụng ức chế đông máu ngoại sinh chúng tôi chọn thời
gian Quick (PT).
-Để thăm dò tác dụng chống đông máu nội sinh chúng tôi chọn Active
Partial Thromboplastin Time (APTT).
-Để thăm dò thời gian chuyển từ fibrinogen thành fibrin chúng tôi chọn
thời gian Thrombin (TT) [19].
> Thử tác dụng giảm đau theo phương pháp của Koster và Turner:
Nguyên tắc: Cho chuột uống chế phẩm thử trước khi gây đau 1 giờ, gây
đau bằng cách tiêm 0,2ml dung dịch acid acetic 1% vào màng bụng, đếm số
lần quặn đau sau những khoảng thời gian nhất định. Kết quả giảm đau thể
hiện qua sự giảm số lần quặn đau của lô thử so với lô chứng.
Đau được biểu hiện bằng chuột choãi hai chân sau, bụng sát xuống sàn,
mình xoắn vặn. Mỗi lần như vậy được tính là 1 cơn quặn đau [28], [36].
> Thử tác dụng lợi tiểu theo phương pháp của Dobrescu cải tiến:
10

2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM:
2.2.1. Bào chê ngưu tất:
*Ngưu tất dùng sống (M|):
Ngưu tất khô rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày l-3mm, sau đó sấy ở
50-60°C và bảo quản để nghiên cứu.
*Ngưu tất trích rượu (M2):
Ngưu tất khô rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày l-3mm; sấy khô qua,
lkg trích với 200ml rượu trắng 40°, ủ 1 giờ cho ngấm rượu sau đó đem sao
khô tới khi có mùi thơm nhẹ, màu vàng nhạt là được.
*Ngưu tất trích muối (M3):
Ngưu tất khô rửa sạch, làm mềm, thái phiến, vát dàyl-3mm; sấy khô qua,
lkg trích với 180ml dung dịch muối 5%, ủ 1 giờ cho thấm đều, sao khô đến
khi có mùi thơm nhẹ, màu vàng nhạt là được.
2.2.2. Định tính một sô nhóm chất trong ngưu tất:
Phản ứng định tính được tiến hành đồng thời với các mẫu Mj, M2, M3, mỗi
thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.2.1. Định tính alcaloid:
* Chuẩn bị dịch thử:
Cho lg dược liệu đã tán nhỏ vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml dung
dịch acid sulfuric 2%, lắc đều. Đun trên nồi cách thuỷ sôi trong 10 phút. Để
nguội, lọc vào bình gạn. Kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến
pH kiềm (thử bằng chỉ thị màu vạn năng), chiết alcaloid bằng chloroform (3
lần X 5ml). Dịch chloroform được lắc vài lần với dung dịch acid sulfuric 2%,
dung dịch acid được dùng để định tính.
12
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff,
lắc nhẹ, không thấy xuất hiện tủa da cam (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat,

Sơ bộ kết luận: Không có glycogid tim trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.3. Định tính flavonoid:
* Chuẩn bị dịch thử:
Lấy lOg bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 50ml cồn 90° đun sôi cách
thuỷ trong 10 phút, lọc nóng thu lấy dịch lọc để làm phản ứng.
- Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ lml dịch chiết. Thêm vào
một ít bột Mg kim loại. Giỏ từng giọt acid HC1 đậm đặc (3-5 giọt), lắc đều rồi
đun nóng cách thuỷ một vài phút. Không thấy dung dịch chuyển màu (phản
ứng âm tính).
- Phản ứng với kiềm:
+ Giỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ
amoniac đặc đã mở nút không thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên
(phản ứng âm tính).
+ Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết thêm vài giọt dung dịch NaOH
10% thấy xuất hiện kết tủa màu vàng (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Không có ílavonoid trong cả 3 mẫu thử.
14
2.2.2.4. Định tính coumarin:
Tiến hành chiết như ở mục 2.2.2.3, dịch chiết làm các phản ứng sau:
- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống lml
dịch chiết, ống thứ nhất thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống thứ hai để
nguyên.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát:
Ống 1: Có kết tủa màu đỏ.
Ống 2: Trong suốt.
Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, quan sát thấy:
Ống 1: Tủa đục màu đỏ.
Ống 2: Trong.
Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng Diazo hoá: trong ống nghiệm nhỏ cho lml dịch chiết. Thêm

phản ứng sau:
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho lml dịch chiết vào ống nghiệm,
thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không thấy xuất hiện tủa bông trắng
(phản ứng âm tính).
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5 %: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch
chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, không thấy xuất hiện màu xanh đen
(phản ứng âm tính).
16
Sơ bộ kết luận: Không có tanin trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.7. Định tính anthraglycosid:
- Phản ứng Borntraeger: Lấy lOg bột dược liệu, cho vào bình nón 250ml,
thêm 100ml acid sulfuric 10%. Đun cách thuỷ 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc
vào bình gạn, lắc với 10ml ether ethylic để phân thành hai lớp. Gạn lấy dịch
chiết ether ethylic, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, lắc đều. Quan sát thấy
lớp nước không có màu đỏ sẫm (phản ứng âm tính).
- Vi thăng hoa: Đặt một ít bột dược liệu trong một nắp nhồm. Hơ nhẹ trên
đèn cồn cho đến khi bay hơi hết nước trong dược liệu. Đặt lên miệng lắp nhôm
một tấm kính, trên tấm kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh. Để nắp
nhôm trực tiếp trên nguồn nhiệt. Sau 5- 10 phút lấy tấm kính, để nguội quan
sát trên kính hiển vi. Không thấy có tinh thể (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Không có anthraglycosid trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.8. Định tính đường khử tự do:
Cho vào ống nghiệm khoảng 2ml dịch chiết nước dược liệu, thêm 0,5ml
thuốc
thử Fehling A và 0,5ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thuỷ vài phút. Xuất
hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Có đường khử tự do trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.9. Định tính chất béo:
Giỏ 1 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên tờ giấy lọc, hơ khô không để lại vết
mờ trên giấy lọc (phản ứng âm tính).

++
- Phản úng Baljet
-
Không
✓
- Phản ứng Legal
-
có
- Phản ứng Keller-Kiliani
-
3
Flavonoid - Phản ứng Cyanidin
-
- Phản ứng với NH4OH
-
Không
- Phản ứng với kiềm
+
có
4 Saponin
- Hiện tượng tạo bọt
- Phản ứng Salkowski
- Phản ứng Liebermann
+++
++
++
Có
5 Coumarin
- Với thuốc thử Diazo
-

- Phản ứng với bột Na2C03
+
Có
11
Acid amin - Phản ứng với thuốc thử
Ninhydrin 3%
+
Có
Ghi chú: phản ứng âm tính. +: phản ứng dương tính.
++: phản ứng rõ. +++: phản ứng rất rõ.
19
Sơ bộ kết luận: Trong rễ ngưu tất có saponin, đường khử, acid hữu cơ,
acid amin.
Qua các phản ứng định tính các nhóm chất như trên chúng tôi nhận thấy
giữa mẫu sống và mẫu chế, giữa các mẫu chế khác nhau thì kết quả không có
sự khác nhau.
2.2.3. Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng:
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cân 2g bột dược liệu, thêm 20ml ethanol (tt),
đun nóng cách thuỷ hồi lưu trong vòng 40 phút, để yên.
Lấy lOml dung dịch ở phía trên, thêm lml dung dịch HC1 đậm đặc (tt), đun
hồi lưu trong vòng 1 giờ, cô đặc dịch chiết chỉ còn 5ml, rồi thêm 10ml nước,
chiết với 20ml ether dầu hoả. Bốc hơi dịch chiết ether dầu hoả đến cắn, hoà
cắn vào 2ml ethanol làm dung dịch chấm sắc ký.
- Triển khai sắc ký
+ Dùng bản mỏng Silicagel GF254- Merck đã tráng sẵn, đã được hoạt hoá ở
110°c trong vòng 1 giờ.
+ Khai triển trên một số hệ dung môi:
1. n- Buthanol bão hoà nước
2. n- Buthanol - acid acetic - nước (4:1:1)
3. Chloroform - methanol - nước (65:35:10)

0,61 0,62
0,61
Xanh rêu
4
0,68
0,69
0,68
Tím
Hình 1: Ảnh sắc ký đồ saponin trong ngưu tất. Ml M2 M3
21