Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2
• • • •
Lưu VIẾT THỦY
NGHIÊN CỨU TẠO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberỉs julỉane)
CHO MỤC TIÊU NUÔI CÁY SINH KHÓI DƯỢC LIỆU
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
• • •
Hà Nội, 2014
Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2
• • • •
Lưu VIẾT THỦY
NGHIÊN CỨU TAO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberis
juliane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI Dược LIỆU
•
•
• Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Hà
Nội, 2014
• Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng
dẫn, giúp đỡ tận tình đế tôi hoàn thành luận văn này:
• Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy của
tôi: PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học, người Thày đã định hướng nghiên cứu, đồng
thời cũng chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thảnh
luận văn này.
• Tôi xin được cảm ơn Cô giáo TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng
Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho
tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
• Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại trường. Tôi xin
chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Văn Đính - CN Khoa Sinh - KTNN, các
thầy, cô giáo đang công tác tại Khoa Sinh - KTNN đã tận tình dạy dỗ chúng tôi

•
•
•
•
LỜI CẢM ƠN
•
•
•
•
•
•
LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
I.
II
III. NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
IV. A.rhizogenes Agobacterium rhizogenes
V. A.tumefaciens Agobacterium tumefaciens
VI. AS Acetosyringone
VII. bp Base pair
VIII. DNA Desoxyribo nucleic acid
IX. Gus Escherichia coli - ß - D - glucoronidase gene
X. GusA ß-glucuronidase
XI. HLG1 Hoàng liên gai 1 (Berberis wallichiana DC.
XII. 1824)
XIII. HLG2 Hoàng liên gai 2 (.Berberis julianae Schneid.
XIV. 1913)7
XV. ITS Internal Transcribed Spacer
XVI. kp Kilobase pair
XVII. LB Lauria Broth

hầu hết các bộ phận của cây. Tuy nhiên ở mỗi bộ phận lại có hàm lượng thay đổi,
tùy theo mùa phát triển của cây. Vào tháng 9 -10, hàm lượng berberin ở thân rễ và
rễ nhánh cao, ừong khi đó, vào khoảng tháng 10, hàm lượng alkaỉoid ở lá già
trước khi rụng cũng thường cao. Trong số các họp chất alkaỉoid nói trên, berberỉn
được y học quan tâm đến nhiều nhất, sau đó là palmatin.
XXXIII. Hiện nay, số lượng cá thể Hoàng liên gai ngoài tự nhiên suy
giảm mạnh do bị khai thác quá mức. Hoàng liên gai được đưa vào danh sách các
loài thực vật đang nguy cấp ừong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá
"đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp,
quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của
Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại. Trước tinh
hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu các giá tri y dược của cây Hoàng liên gai ở
Việt Nam, cần đưa ra các phương pháp bảo tồn cũng như khai thác hiệu quả cây
Hoàng liên gai. Bên cạnh việc trồng bảo tồn ngoại vi (Ex sỉtu) tại vườn quốc gia
Hoàng liên, việc ứng dựng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào quá trình bảo tồn
8
và phát triển bền vững cây Hoàng liên gai theo hướng thu sinh khối tế bào thực
vật là một trong những yêu cầu cấp bách và cần thiết.
XXXIV. Cùng với xu hướng chung trên thế giới, hướng nghiên cứu
công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất những sản phẩm thứ cấp đang bắt
đầu được quan tâm phát triển trong nước. Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy
sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy rễ
bất định Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào ừong
thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều. Bên cạnh đó, sản lượng ổn
định do được nuôi cấy ừong điều kiện ỉn vitro, các yếu tố tác động đến quá trình
nuôi cấy đều được kiểm soát, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tự nhiên cũng
như dịch bệnh.
XXXV.Hiện nay, một số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào được áp dụng
ừên đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberỉn ứng dụng
trong y dược. Đinh Thị Thu Hiền và công sự (2003) đã đưa ra qui trình tái sinh

Berberis, một loài thảo dược quý hiếm được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc y
học cổ truyền. Thành phần chủ yếu của Hoàng liên gai là berberin, một hoạt chất
được ứng dụng trong điều ừị các bệnh về hệ tiêu hóa.
XL. Mau vật nghiên cứu bao gồm quả, lá của cây Hoàng liên gai phân
bố ừong tự nhiên được thu thập tại tại vườn quốc gia Hoàng liên, địa phận huyện
Sa Pa tỉnh Lào Cai.
3. Mục đích nghiên cứu
XLI. Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối
cây Hoàng liên gai làm nguyên liệu dược bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ.
4. Nội dung nghiên cứu
1
4.1. Thu thập và nhận dạng mẫu cây Hoàng liên gai bằng chỉ thị phân
tử.
- Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai phân bố tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên tại
địa phận tỉnh Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
- Nhận dạng các loài Hoàng liên gai thu thập được thông qua đặc điểm hình thái.
- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcoding nhằm nhận dạng các mẫu Hoàng liên gai.
- Bước đầu đưa ra các chỉ thị đặc hiệu cho việc nhận dạng cây Hoàng liên gai trong
tự nhiên bằng phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng kỹ thuật DNA Barcodỉng.
4.2. Đưa mẫu cây Hoàng liên gai vào nuôi cấy in vitro.
XLII. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai và kỹ
thuật nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển
gen tạo rễ tơ.
4.3. Nghiên cứu tối ưu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium
rhizogenes, bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây
Hoàng liên gai qua phương pháp biểu hiện tạm thời với gen chỉ thị GusA.
- Bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu ngoài thực địa: Đánh giá đặc điểm hình thái, phân bố, điều

nơi trồng thích hợp là khe núi, sườn dốc, đủ ánh sáng, thoát nước.
XLVIII. Hiện nay, Hoàng liên gai được ừồng giữ giống tại Trạm dược
liệu Sa Pa (Lào Cai) nhằm bảo vệ nguồn gen, nghiên cứu các hình thức nhân và
phát triển giống cây trồng.
1.1.2. Phân ỉoại Giới: Thực vật - Plantate Ngành: Ngọc Lan - Magnoliophyta
Lớp: Ngọc Lan - Magnoliopsida Bộ : Mao lương - Ranunculales Họ : Hoàng liên gai
- Berberidaceae Chi: Hoàng liên gai Berberis Loài: Hoàng Liên gai
XLIX. Berberis juỉỉanae Schneid. 1913
1
1.1.3. Hình thái và đăc điểm sinh thái
- Đặc điểm hình thái: Cây bụi, cao 2 - 3 m; thân và rễ có màu vàng đậm; phân cành
nhiều; có gai chia thành 3 nhánh, mọc dưới các túm lá. Lá mọc vòng 3-7 cái,
cuống lá ngắn; phiến lá cứng, thuôn, nhọn 2 đầu, hơi bóng ở mặt trên, kích thươc
lá khoảng 3 - 9 cm X 1,2 - 2,5 cm, mép lá có răng cưa nhỏ, đều và nhọn.
L. Hoa nhiều, gồm 10- 30 mọc ở giữa các túm lá. Hoa nhỏ, có cuống
dài 1- 1,3 cm, màu vàng, mẫu 3; tổng bao 3, hình mác rộng. Đài hoa, hình trứng
ngược xếp thành 2 vòng, những vòng ừong lớn hơn vòng ngoài. Cánh hoa, nhỏ
hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy. Nhị hoa, ngắn hơn cánh
hoa; bao phấn hình trứng. Bầu hình trụ, hơi phình ở giữa noãn[2]. Quả hình trứng
thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; khi chín màu tím đen, hơi có phấn trắng.
Hạt, gần hình trụ, màu nâu nhạt.
- Đặc điểm sinh thải.'Mùa hoa tháng 3-4 quả tháng 4-10 (11). Khối lượng 1.000 hạt:
20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian nảy mầm từ 38-60
ngày. Cây con nảy mầm từ hạt trong tự nhiên quan sát được vào tháng 4 và 5. Có
khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát. Cây ưa ẩm, chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa
sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt đới núi cao. Thường mọc rải rác ở
rừng cây bụi núi đá vôi, ở độ cao 1500 - 1600 m.
- Tình trạng: Phân bố hẹp, số lượng cá thể hiện có không nhiều; Điểm phân bố ở núi
Hàm Rồng đã bị tàn phá (còn vài cây); Điểm ở Ô Quí Hồ đang bị đe doạ (gàn nơi
khai thác đá). Đã từng bị khai thác thu mua, nguy cơ bị tuyệt chủng cao[2],[7],[8]

LV. Thông thường, khi nhắc đến berberin, hầu hết chúng ta đều nghĩ
ngay đến tác dụng hữu hiệu của nó trên đường tiêu hóa. Nhưng nhiều nghiên cứu
gần đây cho thấy, hoạt chất này còn đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm
1
cholesterol, ngăn ngừa bệnh mạch vành và cải thiện chức năng tim. Các nhà khoa
học phát hiện hoạt chất berberỉn có vai trò tích cực ừong việc bảo vệ thảnh mạch,
ngăn ngừa hình thành mảng xơ vữa. Do nó tác động lên lớp nội mạc mạch máu
(lóp lót ừong lòng mạch máu) và lớp tế bào cơ trơn thành mạch nên làm tăng độ
đàn hổi và dẻo dai cho thành mạch; ngăn chặn phản ứng viêm, chống lại việc hình
thành mảng xơ vữa từ những giai đoạn đàu tiên.
LVI. Berberin tạo được mối quan tâm với các nhà dược học trong chuyển
hóa lipid thông qua quá trình ức chế tổng họp Cholesterol và Triglycerid tại gan.
Thực tế, từ năm 2004, nhiều nước phương Tây đã ứng dụng berberỉn ừong điều trị
tăng lipid máu (mỡ ừong máu). Các nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của hoạt
chất này tương đương với statin - một nhóm thuốc hạ mỡ máu phổ biến hiện nay.
Đồng thời, việc kết hợp berberin với simvastatin trong điều trị mỡ máu giúp giảm
đáng kể nồng độ LDL-C máu, Cholesterol toàn phàn cũng như Trỉgicerỉd, hơn hẳn
so với việc sử dụng Simvastatin đơn độc.
LVII. Bên cạnh những tác dụng trên mạch máu, nhiều nghiên cứu đã
chứng minh vai trò của berberỉn trong việc tăng cường sự dẻo dai của trái tim.
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Quốc đã mở ra hy vọng mới cho những
người bệnh mắc chứng phì đại cơ tim và suy tim mạn tính bởi hoạt chất này có
khả năng ức chế phì đại cơ tim, cải thiện các chỉ số về sức co bóp, khả năng giãn
nở của cơ tim và điều chỉnh hoạt động của thần kỉnh giao cảm tại tim.
LVIII. Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc trên bệnh nhân suy tim sung
huyết hoặc thiếu máu cơ tim vô căn cho thấy, việc bổ sung hoạt chất này vào
phác đồ điều trị chuẩn có sự cải thiện đáng kể chức năng thất ừái, tăng khả năng
hoạt động thể lực, biểu hiện khó thở, mệt mỏi cũng cải thiện rõ rệt.
LIX. Từ những kết quả khả quan bước đầu, hiện berberỉn vẫn là đích đến
của nhiều nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch trong

giảm tỉ lệ tử vong.
LXV. + Tác dụng hạ áp: Chích hoặc uống dịch chiết berberin cho mèo, chó
và thỏ đã được gây mê và chuột không gây mê thấy huyết áp giảm. Liều lượng
bình thường, hiệu quả không kéo dài, liều lập lại cho kết quả không cao hơn. Hiệu
quả này xẩy ra dù tác dụng trợ tim ảnh hưởng đến lượng máu tim gây nên bởi liều
thuốc này. Huyết áp giảm dường như liên hệ với việc tăng dãn mạch, cũng như có
sự gia tăng đồng bộ ở lách, thận và tay chân.
LXVI. + Tác dụng nội tiết: Berberỉn cũng có tác dụng kháng Adrenaline. Thí
dụ: đang khi berberin làm hạ áp thì phản xạ tăng - hạ của Adrenalin giảm rất nhiều
nhưng phụ hồi lại nhanh. Berberỉn cũng dung hòa sự rối loạn của Adrenaline và các
hợp chất liên hệ.
LXVII. + Tác dụng đối với hệ mật: Berberỉn có tác dụng lợi mật và có
thể làm tăng việc tạo nên mật cũng như làm giảm độ dính của mật. Dùng berberỉn
rất hiệu quả đối với những bệnh nhân viêm mật mạn tính.
LXVIII. + Tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương: Berberỉn dùng liều
nhỏ có tác dụng kích thích vỏ não, trong khi đó, liều lớn lại tăng sự ức chế hoạt
động của vỏ não.
LXIX. + Tác dụng kháng viêm: Lịch sử nghiên cứu chất Granulomas gây ra
bởi dầu cotton ừên chuột nhắt cho thấy chất berberin làm gia tăng đáp ứng kháng
viêm của thể. Chất Ethanol chiết xuất của Hoàng liên có tác dụng kháng viêm khi
cho vào tại chỗ, nó làm cho chất Granulomas co lại. Hiệu quả này giống như tác
dụng của thuốc Butazolidin. (http://thuocdongduoc.vn/cay- thuoc-vi-thuoc/278-cay-
thuoc-vi-thuoc/934-hoang-lien.hừnl)
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây
Hoàng liên gai
1
LXX. Hoàng liên gai có nhiều đặc tính quý hiếm, các hợp chất chiết xuất
tò Hoàng liên gai có khả năng ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược. Mặt
khác, số lượng cá thể Hoàng liên gai ừong tự nhiên đang suy giảm mạnh. Bên
cạnh đó, đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm, khó nuôi trồng khiến cho việc

kinh tế cao là sản phẩm của nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật: Các hoạt chất
dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica [26],
betalain từ mô sẹo của cải đường, berberine từ cây Coptis Japonica (loài cây này
phải trồng tò 4 - 6 năm mới thu được hàm lượng berberỉne đáng kể trong rễ, trong
khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy bằng sinh khối tế bào thực
vật) [27].
LXXV.Các hoạt chất dùng trong thực phẩm: các chất tạo màu (anthocyanỉn,
crocỉn), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi). Một số chất khác như:
shikonin (chất có khả năng diệt khuẩn), paclỉtaxel (sản phẩm của nuôi cấy sinh khối
tế bào thông đỏ), nuôi cấy sinh khối tế bào bằng hệ thống bioreactor 10.000 lít
trong sản xuất reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng chữa bệnh
cao huyết áp và rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3.500 kg resperin
trong thời gian 30 ngày nuôi cấy.
LXXVI. Đinh Thị Thu Hiền và cộng sự (2003) đã nghiên cứu thành
công quy trình nhân nhanh sinh khối mô sẹo của cây Hoàng liên gai nhằm sản
xuất nguồn dược liệu berberỉne, thay thế nguồn tự nhiên đang ngày càng khan
hiếm. Với quy trình này, sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng liên
gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban đầu[l].
LXXVII. Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực
vật các chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
2
nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy. Việc làm này sẽ
dẫn tới có sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi
cấy gây ảnh hưởng đến ức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản phẩm. Tuy
nhiên, vấn đề này có thể khắc phục được thông qua nuôi cấy sinh khối tò rễ tơ,
bởi rễ tơ có khả năng sinh trưởng cao và đặc biệt có thể sinh trưởng, phát triển tốt
trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng [17].
LXXVIII. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes -
Phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật
LXXIX.

các tế bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó [12],[36].
1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vừng T - ĐNA vào tế bào thực vật
LXXXIX. Khi các vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhiễm vào viết
thương của thực vật thì chúng sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị
trí đó. Các gen được chuyển từ Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen của tế bào thực
vật được gọi tên là T- DNA {transfer DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ được
gắn ổn định vào bộ gen của thực vật. Tuy nhiên các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc
từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu
hiện được trong tế bào thực vật. Vùng T-DNA này ừong một plasmid lởn của
Agrobacterium rhizogenes và plasmid này được đặt tên là Rỉ-plasmid (root inducing
plasmid) do Â.rhizogenes có khả năng cảm úng tạo rễ bất định [23].
XC. O
rigin of
(«plKition
XCI.
2
I.
II. Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid
XCII. Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine và mannopine,
vi khuẩn A.rhỉzogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ yếu
cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ. Ri- plasmid
được chia thành nhiều vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir- vỉrulence)),
vùng chuyển gen (T-DNA), vùng orì (vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi
điểm tái bản), vùng phiên mã chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được
chuyển vào bộ gen của thực vật và sự chuyển gen này thông qua sự hỗ ừợ bởi các
đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid. Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri-
plasmid và mã hóa 6 locus phiên mã cho các proteỉn (vir A, B, c, D, F, G ), có chức
năng quan trọng trong quá trình chuyển gen [30]. Sự phiên mã của vùng vir được
cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenoỉ, điển hình là acetosyringone - họp
chất liên quan được xác định là có vai trò làm tăng tần số của quá trình chuyển

Hình 1.4: Cơ chê chuyên gen của Agrobacterium sp (nguôn : www.zbook.vn)
III.