ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
…………………….
KHOA HOÁ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên : Trần Thị Lệ
Lớp : 08SH
Ngành : Công nghệ sinh học
Khoá : 2008 – 2013
1. TÊN ĐỀ TÀI
Nghiên cứu tạo rễ tơ cây sâm dây (Đảng sâm- Condonopsis sp) thông qua vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
2. NỘI DUNG CÁC PHẦN CỦA ĐỒ ÁN
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Lời mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
3. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Họ và tên cán bộ hướng dẫn: TS.Phạm Bích Ngọc
4. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 12/12/2013
5. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 28/05/2013
Thông qua bộ môn:
Ngày … tháng … năm 2013
TỔ TRƯỞNG BỘ MÔN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SVTH: Trần Thị Lệ 3 08SH
Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC HÌNH
Trang
DANH MỤC BẢNG
Trang
SVTH: Trần Thị Lệ 4 08SH
Đồ án tốt nghiệp CBHD: TS.Phạm Bích Ngọc
SVTH: Trần Thị Lệ 5 08SH
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
SVTH: Trần Thị Lệ 6 08SH
2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid
A.rizogenes : Agrobacterium rhizogenes
BAP : 6-Benzylaminopurine
IBA : Indole-3-butyric
MS : Murashige và Skoog, 1962
NAA : Naphthalence acid
Ri plasmid : Root induction plasmid
Rol : Root locus
Sp : Species
Ss T-DNA : Single strain T-DNA
TDZ : Thidiazuron
UV : Ultra violet (tia cực tím)
YMB : Yeast Manitol Broth
SVTH: Trần Thị Lệ 7 08SH
LỜI MỞ ĐẦU
Sâm dây hay còn gọi là Đảng Sâm, là loài dây leo thảo, sống nhiều năm. Theo
sách đỏ Việt Nam thì đẳng sâm là nguồn gen quý và là cây thuốc quý, được sử dụng
rhizogenes
3) Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen.
SVTH: Trần Thị Lệ 9 08SH
Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây sâm dây
Cây sâm dây hay còn gọi là cây Đảng Sâm. Cây Đảng Sâm là một loài dây
leo, củ dùng làm thuốc bổ. Tại Kontum, dân địa phương thường gọi là cây “ Hồng
đảng sâm”. Cây còn có nhiều tên khác như “cây đùi gà”, “mằn ráy cáy” (dân tộc
Tày), “co nha đòi” (Thái), “ canh ho” (H’Mông).
Trong Đông y, vị thuốc đảng sâm được khai thác từ nhiều loài khác nhau,
cùng thuộc chi Codonopsis- thuộc họ hoa chuông (Campanulaceae).
Tại Việt Nam thường gặp loài có tên khoa học là Codonopsis javanica
(Blume) Hook. Loài này phân bố ở độ cao 900-2200m, có ở hầu hết các tỉnh miền
núi. Tập trung nhất ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang…ở phía Nam, có ở núi Ngọc
Linh và vùng Đà Lạt. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc
tương đối tập trung ở các vùng nương rẫy cũ, ven rừng, nhất là loại hình rừng núi đá
vôi sau khi đã bị khai phá để lấy đất canh tác [ 25].
1.1.1. Phân loại
Giới : Plantae
Phân giới : Tracheobionta
Nhóm lớn : Spermatophyta
Nhóm : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Phân lớp : Asteridae
Bộ : Campanulales
Họ : Campanulaceae
Giống :Codonopsis Wall.
Loài : Codonopsis sp
Hình 1.1. Cây sâm dây
pinen và các alkanloid . Trong rễ cây sâm dây chứa nhiều loại acid amin (khoảng
17 loại), tuy liều lượng không cao nhưng mang đầy đủ các loại acid amin cần thiết
cho cơ thể.
Bảng 0.1. Hoạt chất có trong đảng sâm việt nam
Stt Nhóm chất Kết quả stt Nhóm chất Kết quả
1 Đường khử + 6 Glycosid -
SVTH: Trần Thị Lệ 11 08SH
2 Chất béo + 7 Flavonoid -
3 Acid amin + 8 Tanin -
4 Saponin + 9 Coumarin -
5 Alkaloid -
Tác giả Hoàng Minh Giám đã thực hiện thu thập mẫu cây sâm dây – đảng sâm
tại Lào Cai. Trải qua các thí nghiệm, tác giả đã xác định được thành phần hợp chất
chủ yếu có trong rễ đảng sâm. trong rễ sâm gồm các thành phần như: đường khử,
chất béo, acid amin và đặc biệt là saponin.
1.1.3.2. Tác dụng dược lý
Theo lương y Vũ Quốc Trung, củ sâm đất có tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng,
làm long đờm , nhưng với liều cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi. Dân
gian thường lấy củ sâm đất ngâm rượu uống; lá nấu canh ăn giúp giải nhiệt cơ thể,
làm mát gan. Canh rau sâm đất ăn có vị ngọt, hơi chua giống như rau mồng tơi,
nhưng không có nhớt. Sâm đất có các tác dụng trị liệu, như trong chứng viêm khớp
nó giúp giảm viêm sưng và giảm đau.
Sâm đất còn giúp giảm táo bón. Dùng sâm đất giúp giảm cơn ho và suyễn;
dùng cho một số trường hợp nam giới bất lực. Sâm đất được dùng nhiều trong
những bệnh về da như ghẻ; dùng làm bài thuốc trị giun sán; dùng trong bệnh sỏi
thận, viêm thận; giải độc cho gan.
Còn theo lương y Như Tá, bộ phận dùng toàn cây (phần thân trên mặt đất) và rễ. Lá
có vị hơi đắng, cay; tính lạnh, có ít độc (gây nôn nếu dùng liều cao). Rễ có vị ngọt,
cay, tính mát. Công dụng: thanh nhiệt (hạ sốt), lợi niệu, giải độc. Chủ trị, toàn cây
chữa tiểu đường dạng 2. Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao
SVTH: Trần Thị Lệ 13 08SH
Bên cạnh đó còn rất nhiều nghiên cứu về xác định thành phần hóa học và công
dụng của chúng, các phương pháp chiết xuất hợp chất trong các loài Codonopsis sp
ứng dụng trong lĩnh vực y dược.
1.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
Gottlieb Haberlandt lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế
bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi
tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ thông tin di truyền của
cơ thể đó và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận
lợi. Ðó chính là tính toàn thể của tế bào.
Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, người ta đã hoàn toàn
chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ.
1.2.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Cơ thể sinh vật trưởng thành gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau
được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó
đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu. Ở giai đoạn đầu, tế bào phân chia thành nhiều
tế bào phân sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó, từ các tế
bào phân sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc
hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phân sinh thành các tế bào mô
chuyên hoá, đảm nhiệm các chức năng khác nhau. Tuy nhiên khi tế bào đã phân hoá
thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng
biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể
trở về dạng tế bào phân sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là quá trình
phản phân hoá tế bào, ngược lại với quá trình phân hoá tế bào.
SVTH: Trần Thị Lệ 14 08SH
Như vậy, quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là
bào có khả năng chuyển hóa thành những vùng mô phân sinh.
Vùng mô phân sinh được phát hiện trong khối mô sẹo khi nó được phát sinh
trực tiếp bằng cách phân bào là những cụm nhỏ có cấu trúc chặt, có hai cực, tế bào
có màng mỏng với nhân điển hình, tế bào chất đậm đặc và có không bào nhỏ.
Nhu mô đỉnh sinh trưởng và phôi chưa chín thuần thục có chứa nhiều tế bào
với hình dạng tương tự và những loài này có khả năng phản ứng với môi trường
nuôi cấy có hormone.
Sự phát sinh cơ quan
Phát sinh cơ quan là quá trình các tế bào và mô tạo ra cấu trúc một cực, cực
chồi hoặc cực rễ. Đây là một quá trình liên quan đến sự tăng sinh và sự phân hóa tế
bào, phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng của các chất điều hòa tăng trưởng thực
vật khác nhau. Phát sinh cơ quan có thể xảy ra theo hai con đường: phát sinh trực
tiếp hoặc gián tiếp.
1.2.2.1. Phát sinh cơ quan trực tiếp
Phát sinh cơ quan trực tiếp bao gồm sự hình thành chồi và rễ trực tiếp từ mẫu
cấy mà không thông qua giai đoạn tạo mô sẹo.
a. Sự hình thành chồi bất định
Chồi bất định xuất hiện không chỉ từ mô phân sinh chóp mà còn xuất hiện
gần vết thương, gần vết cắt, gần vùng phát sinh libe-mộc hoặc ngoài biểu bì, vì vậy
chồi có thể có nguồn gốc nội sinh hoặc ngoại sinh do một sự phản biệt hóa các tế
bào trưởng thành. Chúng cũng khởi sự bằng những phân chia tế bào và sắp xếp tế
bào giống như mô phân sinh chóp và có mạch gắn liền với mạch của thân.
Mô phân sinh ngọn chồi có thể hình thành từ tế bào biểu bì, mô giậu, mô
khuyết hay mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi biệt hóa để hình thành tầng
phát sinh mới của chồi, tế bào đã biệt hóa phải trải qua quá trình phản biệt hóa. Sự
SVTH: Trần Thị Lệ 16 08SH
phản biệt hóa này có thể được cảm ứng trên cây bằng cách kìm hãm các hiệu ứng
cản tương quan (gỡ ưu tính ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn) hay trên mô cấy nhờ
các môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất điều hòa thích hợp. Có hai giai đoạn
xảy ra trong quá trình tái sinh: giai đoạn phản biệt hóa và giai đoạn tái biệt hóa.
Rễ bất định thường được khởi sinh ở vùng lân cận của các mô mạch dẫn
đang phân hóa của cơ quan đã tạo ra chúng. Nếu cơ quan này còn non, sơ khởi rễ
bất định được khởi sinh bằng một nhóm tế bào gần ngoại vi của hệ thống mạch dẫn.
Nếu cơ quan đó già hơn, vị trí khởi sinh nằm sâu hơn, gần với tầng sinh mạch. Ở
các thân non, các tế bào tạo ra sơ khởi rễ thường được hình thành từ mô mềm giữa
các bó mạch dẫn.
Ở những thân già hơn, chúng hình thành từ một tia mạch. Đôi khi rễ bất
định được khởi sinh bằng cách phân chia trong vùng tầng phát sinh. Rễ bất định
xuất phát từ vùng giữa các tia mạch hoặc ở tầng phát sinh làm cho rễ gần với libe-
mộc của cơ quan mẹ. Điều này thuận lợi cho việc thiết lập đường nối mạch giữa hai
cơ quan này.
1.2.2.2. Phát sinh cơ quan gián tiếp
Phát sinh cơ quan gián tiếp bao gồm sự hình thành mô sẹo, mô sẹo tăng sinh
và sau đó hình thành chồi hoặc rễ từ mô sẹo này.
a. Sự tạo mô sẹo
Mô sẹo là khối tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường
được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ.
Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô
sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro dưới tác động của một auxin mạnh được áp
dụng riêng lẻ hay phối hợp với cytokinin.
Sự tạo mô sẹo, nhờ auxin, thuộc một trong ba quá trình:
- Sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô.
SVTH: Trần Thị Lệ 18 08SH
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ). Quá trình này
được ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không có các tượng tầng
điển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân hóa (so với cây hai lá mầm).
Tuy nhiên, mô sẹo cũng có thể được hình thành từ sự phân chia của các tế
bào biểu bì như ở cây Trạng nguyên Euphorbia pulcherrima Willd.
Sự tạo mô sẹo cần phải chú ý đến tình trạng sinh lý của mô cấy, sử dụng
1.3.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Hình 0.2. Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes (tên cũ Phytomonas rhizogenes) được định danh
lần đầu tiên cách đây hơn 70 năm. Vi khuẩn A.rhizogenes là tác nhân gây bệnh ở
thực vật: hội chứng tạo rễ tơ hay bệnh rễ nhày. A.rhizogenes là vi khuẩn đất hình
que, gram âm, thuộc chi Agrobacterium.
Vi khuẩn đất gram âm A.rhizogenes, gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm.
Giống như vi khuẩn A.tumefaciens mang Ti-Plasmid, A.rhizogenes mang Ri (root-
inducing) plasmid và plasmid này đã được xác định là tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các
mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra polyphenol
hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển một đoạn T-DNA (tranfer DNA) từ Ri-
plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và
SVTH: Trần Thị Lệ 20 08SH
cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của hai vi
khuẩn này được chứng minh là tương tự nhau. Tuy nhiên sự hình thành khối u ở vi
khuẩn A.tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định. Trong khi đó,
các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn A.rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong
quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật.
1.3.1.2. Cấu trúc của Ri-plasmid và T-DNA
Hình 1.3.Cấu trúc Ri-plasmid
Giống như T-plasmid, Ri-plamid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có
trọng lượng phân tử lớn từ 200-800kb gồm hai vùng chính là T-DNA và vir
(virulence). Dựa vào khả năng sinh tổng hợp các opine ở rễ tơ, Ri-Plasmid được
chia làm hai nhóm chính: agropine và manopine, và một số nhóm phụ được tìm
thấy và phân loại này như cucumopine và mikimopine. Trong đó các chủng thuộc
nhóm agropine ( A
4
, 15834, LBA9042) được chứng minh là độc hơn so với chủng
thuộc nhóm mannopine (8196, TR
hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ.
1.3.1.3. Cơ chế của quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật
Hình 1.4. Mô hình chuyển gen nhờ Agrobacterium
(1)_ Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ; (2)_ Tổ hợp tín hiệu
VirA/VirG của Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật đặc trưng; (3)_ Sự
hoạt hóa vùng gen Vir; (4)_ T-DNA được tách ra khỏi Ri-plasmid nhờ phức hợp
protein VirD
1
/D
2
; (5)_ Sự tạo thành phức hợp VirD
2
-DNA ( phức hợp -T chưa
thành thục), cùng một vài protein Vir khác đi vào nguyên sinh chất tế bào chủ;
(6)_Sự kết hợp của VirE
2
với sợi -T tạo thành phức hợp -T thành thục xuyên qua
nguyên sinh chất tế bào chủ; (7)_Phức hợp -T thành thục chủ động đi vào nhân tế
SVTH: Trần Thị Lệ 22 08SH
bào chủ; (8)_T-DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9)_T-DNA tách khỏi các
protein bảo vệ; (10)_T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ.
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A.rhizogenes sang tế bào cây chủ
được thực hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F, trong đó virC và
virE có tác dụng làm tăng tần số biến nạp. Các gen này có vai trò quan trọng trong
việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hoá học
acetosyringone(AS). Tín hiệu hoá học được nhận biết đầu tiên bởi virA. Gen virA
sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất
của vết thương trên cây. Protein virA tự photphoryl hoá đồng thời làm cho protein
virG được photphoryl hoá và kích hoạt sao mã của các gen virB, C, E, F, G. Tiếp
đó các protein được mã hoá bởi virD, virE thực hiện chức năng giải phóng sợi T-
. Nhưng phức hợp được bao bởi số
SVTH: Trần Thị Lệ 23 08SH
lượng lớn phân tử VirE
2
và mỗi phức này có hai tín hiệu định vị trong nhân. Hai tín
hiệu này của VirE
2
đóng vai trò quan trọng đối với việc nhận liên tục phức T-DNA
của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân. Khả năng nhận phức của nhân
được điều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu định vị trong nhân, protein này được
tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật.
Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T-DNA là sự tương tác trong
genome tế bào thực vật. Các phản ứng trong sự tương tác T-DNA không có tính
điển hình. Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật. Theo
cách nhìn nhận này việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, được cần đến đối
với bước lặp lại giữa cặp vận chuyển T-DNA với VirD
2
và DNA thực vật. Sự tương
đồng này rất thấp và cung cấp đặc trưng nhỏ nhất đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự
xác định vị trí của VirD
2
để gắn kết. Ở trình tự gần kề hay đầu 3’ của T-DNA tìm
thấy một vài sự tương đồng nhỏ với DNA thực vật, kết quả ở sự tương tác đầu tiên
giữa sợi T-DNA và DNA thực vật là tạo lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của DNA thực vật. Sau
đó DNA thực vật được cắt ở vị trí đầu 3’của lỗ hổng bởi sợi endonuclease và
nucleotide của đầu 5’ bắt cặp với VirD
2
bới một nucleotide trong đầu sợi (5’-3’)
DNA thực vật. Phần 3’ nhô ra của T-DNA cũng như DNA thực vật thay thế bị phân
hủy bởi endonuclease hay 3’-5’ exonuclease. Đầu 5’ của T-DNA gắn với VirD
vào mô, rễ hình thành và phát triển từ vị trí bị thương, được cắt ra, và sau đó chuyển
sang môi trường lỏng lắc để tăng sinh khối. Rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển
tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, vì thế loại bỏ
được dư lượng các hợp chất này trong sản phẩm tạo ra. Hơn nữa rễ tơ có khả năng
sinh trưởng nhanh, phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy và chuyển gen dễ dàng và có
thể được nuôi cấy và tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền
sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Rễ tơ có thể
sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và rễ tơ là cơ quan biệt hóa nên có sự
di truyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù và mô sẹo.
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ tơ: độ tuổi cây, loại mô, loại cây,
chủng vi sinh vật, nồng độ khuẩn gây lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian
ngâm mẫu.
1.3.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy rễ tơ
Từ những ngày đầu được phát hiện cho đến nay, công nghệ nuôi cấy rễ tơ đã
và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào những ưu điểm của
mình. Rễ chuyển gen có đặc tính là tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn
định. Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn hoạt chất thứ cấp hay hàng loạt hợp chất
có liên quan tới thực vật.
a) Sản xuất hợp chất thứ cấp.
SVTH: Trần Thị Lệ 25 08SH
Copyright: Tài liệu đại học ©