Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2
• • • •
Lưu VIẾT THỦY
NGHIÊN CỨU TẠO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI
(Berberỉs julỉane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CÁY SINH KHÓI
DƯỢC LIỆU
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
• • •
Hà Nội, 2014
Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2
• • • •
Lưu VIẾT THỦY
NGHIÊN CỨU TAO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI
(Berberis juliane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI
Dược LIỆU
•
•
• Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Chu
Hoàng Hà Hà Nội, 2014
• Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng
dẫn, giúp đỡ tận tình đế tôi hoàn thành luận văn này:
• Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy của
tôi: PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học, người Thày đã định hướng nghiên cứu, đồng
thời cũng chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thảnh
luận văn này.
• Tôi xin được cảm ơn Cô giáo TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng
Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho
tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
• Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại trường. Tôi xin

VI. AS Acetosyringone
VII. bp Base pair
VIII. DNA Desoxyribo nucleic acid
IX. Gus Escherichia coli - ß - D - glucoronidase gene
X. GusA ß-glucuronidase
XI. HLG1 Hoàng liên gai 1 (Berberis wallichiana DC.
XII. 1824)
XIII. HLG2 Hoàng liên gai 2 (.Berberis julianae Schneid.
XIV. 1913)7
XV. ITS Internal Transcribed Spacer
XVI. kp Kilobase pair
XVII. LB Lauria Broth
XVIII. MS Murashige and Skoog
XIX. Ri-plasmidRoot inducing plasmid
XX. Rol Root locus
XXI. sp Species
XXII. T- DNA Transfer DNA)
XXIII. TDZ Thidiazuron
XXIV. Vir Virulence genes
XXV. YMB Yeast Malnitol Broth
XXVI.DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU
1. Danh mục các hình
ảnh ■
XXVII
XXVIII
2. Danh mục bảng biểu
XXIX.Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh
học 21
XXX
XXXI

XXXIV. Cùng với xu hướng chung trên thế giới, hướng nghiên cứu
công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất những sản phẩm thứ cấp đang bắt
đầu được quan tâm phát triển trong nước. Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy
sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy rễ
bất định Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào ừong
thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều. Bên cạnh đó, sản lượng ổn
định do được nuôi cấy ừong điều kiện ỉn vitro, các yếu tố tác động đến quá trình
nuôi cấy đều được kiểm soát, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tự nhiên cũng
như dịch bệnh.
XXXV. Hiện nay, một số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào được
áp dụng ừên đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberỉn ứng
dụng trong y dược. Đinh Thị Thu Hiền và công sự (2003) đã đưa ra qui trình tái
sinh cây Hoàng liên gai ỉn vitro tò hạt. Cây Hoàng liên gai in vitro được sử dụng
làm nguyên liệu cho quá trình tạo và nuôi cấy sinh khối mô sẹo Hoàng liên gai tạo
họp chất berberỉn với hàm lượng cao [1]. Lại Đức Lưu và công sự (2013) ứng
dụng kỹ thuật khí canh ừong nghiên cứu nhân giống và thu sinh khối rễ cây
Hoàng liên gai. Nhóm tác giả đã thực hiện thu thập, đánh giá hàm lượng berberin
và tìm ra chế độ nuôi cấy cũng như môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sinh khối
rễ Hoàng liên gai phát triển[4].
XXXVI. Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật
nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. vấn đề này là một trong
những trở ngại lớn do tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế
bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng. Tuy
8
nhiên, kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ tơ ra đời giúp giải quyết các vấn đề khó khăn
của hướng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật hiện tại.
XXXVII. Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra quá trình tương tác
giữa vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ. Rễ tơ có có khả năng
sinh trưởng nhanh, phát triển tốt trên môi trường không bổ sung chất điều hòa

- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcoding nhằm nhận dạng các mẫu Hoàng liên
gai.
- Bước đầu đưa ra các chỉ thị đặc hiệu cho việc nhận dạng cây Hoàng liên
gai trong tự nhiên bằng phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng kỹ thuật
DNA Barcodỉng.
4.2. Đưa mẫu cây Hoàng liên gai vào nuôi cấy in vitro.
XLII. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai và kỹ
thuật nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển
gen tạo rễ tơ.
4.3. Nghiên cứu tối ưu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium
rhizogenes, bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen tạo rễ
tơ ở cây Hoàng liên gai qua phương pháp biểu hiện tạm thời với gen chỉ thị
GusA.
- Bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.
5. Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu ngoài thực địa: Đánh giá đặc điểm hình thái, phân bố, điều
kiện sinh sống của cây Hoàng liên gai tại địa phận Sa Pa - Lào Cai.
- Nghiên cứu trong phòng thỉ nghiệm: Thực hiện các thí nghiệm trọng điều
kiện in vitro tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
1
0
6. Ý nghĩa khoa học
XLIII. Việc xác định được chỉ thị phân tử đặc hiệu cho loài Hoàng liên gai
sẽ đưa ra cơ sở khoa học vững chắc cho việc nhận dạng loài Hoàng liên gai trong
tự nhiên cũng như các loài khác nhau trong chi Berberis.
XLIV. Hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua
vi khuẩn Agrobacterium rhizogenese cung cấp cơ sở khoa học cho quá trình
chuyển gen tạo rễ tơ trên các đối tượng loài khác thuộc chi Hoàng liên (Berberis')

1
2
1.1.3. Hình thái và đăc điểm sinh thái
- Đặc điểm hình thái: Cây bụi, cao 2 - 3 m; thân và rễ có màu vàng đậm;
phân cành nhiều; có gai chia thành 3 nhánh, mọc dưới các túm lá. Lá mọc
vòng 3-7 cái, cuống lá ngắn; phiến lá cứng, thuôn, nhọn 2 đầu, hơi bóng ở
mặt trên, kích thươc lá khoảng 3 - 9 cm X 1,2 - 2,5 cm, mép lá có răng cưa
nhỏ, đều và nhọn.
L. Hoa nhiều, gồm 10-30 mọc ở giữa các túm lá. Hoa nhỏ, có cuống
dài 1- 1,3 cm, màu vàng, mẫu 3; tổng bao 3, hình mác rộng. Đài hoa, hình trứng
ngược xếp thành 2 vòng, những vòng ừong lớn hơn vòng ngoài. Cánh hoa, nhỏ
hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy. Nhị hoa, ngắn hơn cánh
hoa; bao phấn hình trứng. Bầu hình trụ, hơi phình ở giữa noãn[2]. Quả hình trứng
thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; khi chín màu tím đen, hơi có phấn trắng.
Hạt, gần hình trụ, màu nâu nhạt.
- Đặc điểm sinh thải.'Mùa hoa tháng 3-4 quả tháng 4-10 (11). Khối lượng
1.000 hạt: 20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian nảy
mầm từ 38-60 ngày. Cây con nảy mầm từ hạt trong tự nhiên quan sát được
vào tháng 4 và 5. Có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát. Cây ưa ẩm,
chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt
đới núi cao. Thường mọc rải rác ở rừng cây bụi núi đá vôi, ở độ cao 1500 -
1600 m.
- Tình trạng: Phân bố hẹp, số lượng cá thể hiện có không nhiều; Điểm phân
bố ở núi Hàm Rồng đã bị tàn phá (còn vài cây); Điểm ở Ô Quí Hồ đang bị
đe doạ (gàn nơi khai thác đá). Đã từng bị khai thác thu mua, nguy cơ bị
tuyệt chủng cao[2],[7],[8]
1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai.
LI. Theo Đông y, Hoàng liên gai vị đắng, lạnh; có tác dụng tả hóa giải
độc, thanh tâm nhiệt, táo tỳ thấp, trị tiêu hoá không tốt, viêm ruột, hạ lỵ, đau bụng
1

ngay đến tác dụng hữu hiệu của nó trên đường tiêu hóa. Nhưng nhiều nghiên cứu
gần đây cho thấy, hoạt chất này còn đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm
cholesterol, ngăn ngừa bệnh mạch vành và cải thiện chức năng tim. Các nhà khoa
học phát hiện hoạt chất berberỉn có vai trò tích cực ừong việc bảo vệ thảnh mạch,
ngăn ngừa hình thành mảng xơ vữa. Do nó tác động lên lớp nội mạc mạch máu
(lóp lót ừong lòng mạch máu) và lớp tế bào cơ trơn thành mạch nên làm tăng độ
đàn hổi và dẻo dai cho thành mạch; ngăn chặn phản ứng viêm, chống lại việc hình
thành mảng xơ vữa từ những giai đoạn đàu tiên.
LVI. Berberin tạo được mối quan tâm với các nhà dược học trong chuyển
hóa lipid thông qua quá trình ức chế tổng họp Cholesterol và Triglycerid tại gan.
Thực tế, từ năm 2004, nhiều nước phương Tây đã ứng dụng berberỉn ừong điều
trị tăng lipid máu (mỡ ừong máu). Các nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của hoạt
chất này tương đương với statin - một nhóm thuốc hạ mỡ máu phổ biến hiện nay.
Đồng thời, việc kết hợp berberin với simvastatin trong điều trị mỡ máu giúp giảm
đáng kể nồng độ LDL-C máu, Cholesterol toàn phàn cũng như Trỉgicerỉd, hơn
hẳn so với việc sử dụng Simvastatin đơn độc.
LVII. Bên cạnh những tác dụng trên mạch máu, nhiều nghiên cứu đã
chứng minh vai trò của berberỉn trong việc tăng cường sự dẻo dai của trái tim.
Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Quốc đã mở ra hy vọng mới cho những
người bệnh mắc chứng phì đại cơ tim và suy tim mạn tính bởi hoạt chất này có
khả năng ức chế phì đại cơ tim, cải thiện các chỉ số về sức co bóp, khả năng giãn
nở của cơ tim và điều chỉnh hoạt động của thần kỉnh giao cảm tại tim.
LVIII. Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc trên bệnh nhân suy tim sung
huyết hoặc thiếu máu cơ tim vô căn cho thấy, việc bổ sung hoạt chất này vào
phác đồ điều trị chuẩn có sự cải thiện đáng kể chức năng thất ừái, tăng khả năng
hoạt động thể lực, biểu hiện khó thở, mệt mỏi cũng cải thiện rõ rệt.
LIX. Từ những kết quả khả quan bước đầu, hiện berberỉn vẫn là đích đến
1
5
của nhiều nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch trong

Tuy nhiên, nghiên cứu khác trên heo Hà Lan, cho uống Hoàng liên thì lại không
làm giảm tỉ lệ tử vong.
LXV. + Tác dụng hạ áp: Chích hoặc uống dịch chiết berberin cho mèo,
chó và thỏ đã được gây mê và chuột không gây mê thấy huyết áp giảm. Liều
lượng bình thường, hiệu quả không kéo dài, liều lập lại cho kết quả không cao
hơn. Hiệu quả này xẩy ra dù tác dụng trợ tim ảnh hưởng đến lượng máu tim gây
nên bởi liều thuốc này. Huyết áp giảm dường như liên hệ với việc tăng dãn mạch,
cũng như có sự gia tăng đồng bộ ở lách, thận và tay chân.
LXVI. + Tác dụng nội tiết: Berberỉn cũng có tác dụng kháng Adrenaline.
Thí dụ: đang khi berberin làm hạ áp thì phản xạ tăng - hạ của Adrenalin giảm rất
nhiều nhưng phụ hồi lại nhanh. Berberỉn cũng dung hòa sự rối loạn của
Adrenaline và các hợp chất liên hệ.
LXVII. + Tác dụng đối với hệ mật: Berberỉn có tác dụng lợi mật và
có thể làm tăng việc tạo nên mật cũng như làm giảm độ dính của mật. Dùng
berberỉn rất hiệu quả đối với những bệnh nhân viêm mật mạn tính.
LXVIII. + Tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương: Berberỉn dùng
liều nhỏ có tác dụng kích thích vỏ não, trong khi đó, liều lớn lại tăng sự ức chế
hoạt động của vỏ não.
LXIX. + Tác dụng kháng viêm: Lịch sử nghiên cứu chất Granulomas gây
ra bởi dầu cotton ừên chuột nhắt cho thấy chất berberin làm gia tăng đáp ứng
kháng viêm của thể. Chất Ethanol chiết xuất của Hoàng liên có tác dụng kháng
viêm khi cho vào tại chỗ, nó làm cho chất Granulomas co lại. Hiệu quả này giống
như tác dụng của thuốc Butazolidin. (http://thuocdongduoc.vn/cay-
1
7
thuoc-vi-thuoc/278-cay-thuoc-vi-thuoc/934-hoang-lien.hừnl)
1.1.5. Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây
Hoàng liên gai
LXX. Hoàng liên gai có nhiều đặc tính quý hiếm, các hợp chất chiết xuất
tò Hoàng liên gai có khả năng ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược. Mặt

và hợp chất glycosỉd. Các loại vật liệu được nuôi cấy có thể là: tế bào đơn, mô
sẹo, protoplast hoặc nuôi cấy rễ.
LXXIV. Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá
trị kinh tế cao là sản phẩm của nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật: Các hoạt chất
dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica
[26], betalain từ mô sẹo của cải đường, berberine từ cây Coptis Japonica (loài
cây này phải trồng tò 4 - 6 năm mới thu được hàm lượng berberỉne đáng kể trong
rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy bằng sinh khối tế
bào thực vật) [27].
LXXV. Các hoạt chất dùng trong thực phẩm: các chất tạo màu
(anthocyanỉn, crocỉn), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi). Một số chất
khác như: shikonin (chất có khả năng diệt khuẩn), paclỉtaxel (sản phẩm của nuôi
cấy sinh khối tế bào thông đỏ), nuôi cấy sinh khối tế bào bằng hệ thống bioreactor
10.000 lít trong sản xuất reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng
chữa bệnh cao huyết áp và rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3.500 kg
resperin trong thời gian 30 ngày nuôi cấy.
LXXVI. Đinh Thị Thu Hiền và cộng sự (2003) đã nghiên cứu thành
công quy trình nhân nhanh sinh khối mô sẹo của cây Hoàng liên gai nhằm sản
xuất nguồn dược liệu berberỉne, thay thế nguồn tự nhiên đang ngày càng khan
hiếm. Với quy trình này, sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng liên
1
9
gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban đầu[l].
LXXVII. Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực
vật các chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy. Việc làm này sẽ
dẫn tới có sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi
cấy gây ảnh hưởng đến ức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản phẩm. Tuy
nhiên, vấn đề này có thể khắc phục được thông qua nuôi cấy sinh khối tò rễ tơ,
bởi rễ tơ có khả năng sinh trưởng cao và đặc biệt có thể sinh trưởng, phát triển tốt

(pỉasmid root induction) ở Agrobacterium rhizogenes.
2
1
LXXXVIII. Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium
rhizogenes, là một loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong
bộ Rhizobiales cổ định đạm. Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín
hiệu từ các tế bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó [12],[36].
1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vừng T - ĐNA vào tế bào thực vật
LXXXIX. Khi các vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhiễm vào viết
thương của thực vật thì chúng sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị
trí đó. Các gen được chuyển từ Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen của tế bào
thực vật được gọi tên là T- DNA {transfer DNA). T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ
được gắn ổn định vào bộ gen của thực vật. Tuy nhiên các gen mã hóa T-DNA có
nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có
thể biểu hiện được trong tế bào thực vật. Vùng T-DNA này ừong một plasmid lởn
của Agrobacterium rhizogenes và plasmid này được đặt tên là Rỉ-plasmid (root
inducing plasmid) do Â.rhizogenes có khả năng cảm úng tạo rễ bất định [23].
XC. Ori
gin of
(«plKition
XCI.
2
2
I.
II. Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid
XCII. Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine và
mannopine, vi khuẩn A.rhỉzogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử
dụng chủ yếu cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ.
Ri- plasmid được chia thành nhiều vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir-
vỉrulence)), vùng chuyển gen (T-DNA), vùng orì (vùng mã hóa chức năng tái bản

xâm nhiễm. Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất
nhiều so với rễ bình thường. Trong 3 gen rol ừên, gen roiB đóng vai trò quan
trọng hơn cả, khi gen roỉB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo
kiểu hình rễ tơ, trong khi đó bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ
[11].
2
4
r 7
>
Hình 1.4: Cơ chê chuyên gen của Agrobacterium sp (nguôn : www.zbook.vn)
III.
XCVI.
1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ.
XCVII. Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ bất định được sản sinh ra
mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn A.rhizogenes. T-DNA từ A.rhizogenes sau
khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gen của thực vật, từ đó
tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gen roỉ và gen awe ( tổng hợp ra các
IAA) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn
thương ở mô thực vật đó. số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển
thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [36].
XCVIII.
1. Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar
2. Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hỵpogaea)
3. Rễ tơ ơ. glabra nuôi trong môi trường lỏng
4. Nuôi cấy rễ tơ G.ệỉabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch sinh khối rễ
sau 30 ngày nuôi cay (b,c)
2
5
IV.
V. Hình 1.5. Các hệ rễ tơ được nuôi cấy