BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA CẦM
CỦA VI KHUẨN Bacillus megaterium VL2
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU TRẦN HỒNG THẢO
MSSV: 3102863
LỚP: CNSH K36 Cần Thơ, Tháng 5/2014
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Bùi Thị Minh Diệu Trần Hồng Thảo
phẩm - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ
đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài này.
Xin cảm ơn ba mẹ, anh chị và các bạn lớp công nghệ sinh học khóa 36, đã động
viên, khuyến khích, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin chân thành cám ơn!
Cần Thơ, ngày 4 tháng 5 năm 2014 Trần Hồng Thảo
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học TÓM LƢỢC
Lông gia cầm là phế phẩm được sinh ra từ hoạt động chăn nuôi và giết mổ. Là
một chất thải khó phân hủy bởi thành phần chính là keratin, lông gia cầm có ảnh
hưởng xấu tới môi trường. Sử dụng vi sinh vật để phân hủy keratin có trong lông gia
cầm là một hướng đi mới, không những giải quyết được vấn đề môi trường mà còn sử
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1
1.1.Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lƣợc về chất thải lông vũ 2
2.2. Keratine 4
2.3. Enzyme keratinase 5
2.4. Vi sinh vật phân giải keratin 6
2.4.1. Sơ lược vi sinh vật phân giải keratin 6
2.4.2. Vi khuẩn Bacillus megaterium 7
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của vi
sinh vật 8
2.5.1. Các yếu tố vật lý 8
2.5.2. Thành phần môi trường nuôi cấy 9
2.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 11
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 11
2.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. 11
CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 14
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14
4.4. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của
vi khuẩn. 29
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
5.1. Kết luận 31
5.2. Đề nghị 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học PHỤ LỤC 1
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học TỪ VIẾT TẮT
B. Bacillus
BSM Basal salt medium
CFU colony-forming unit
EDTA Ethylene Diamin Tetra Aceticacid
PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
PTN Phòng thí nghiệm
rpm Rotation per minute
rRNA Ribosomal ribonucleotide acid
w/v Weight/volum
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Chăn nuôi là một trong những ngành sản xuất chủ đạo của nước ta. Việc phát
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về chất thải lông vũ
Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông vũ, trong đó chủ yếu là β-keratin.
Mỗi năm trên thế giới có khoảng hàng tỷ tấn lông vũ được thải ra từ ngành chăn nuôi
và chế biến gia cầm, gây ra vấn đề môi trường đồng thời làm lãng phí nguồn protein
(Gousterova et al., 2005). Với thành phần chủ yếu là keratin khá tinh khiết đồng thời
được thải ra với một số lượng lớn, chất thải lông vũ là nguồn nguyên liệu thay thế tiềm
năng cho các thành phần dinh dưỡng đắt tiền trong thức ăn gia súc. Tuy nhiên, việc
sản xuất lông vũ làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc chưa được ứng dụng
rộng rãi do quy trình sản xuất theo phương pháp vật lý và hóa học còn nhiều hạn chế.
Không những tiêu tốn nhiều năng lượng và không thân thiện với môi trường, quy trình
sản xuất này phá hủy một số acid amin, làm cho sản phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn
về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons, 1997).
39,4
56,9
53,0
34,6
67,6
2,3
15,4
41,8
82,2
87,3
34,5
73,9
65,8
7,1
(Latshaw et al, 1994) Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học 2.2. Keratine
Keratin là một loại protein dạng sợi, có khả năng hình thành màng bảo vệ cho
toàn bộ động vật có xương sống. Là thành phần chính cấu tạo nên: da, lông, tóc, vuốt,
móng, sừng, vảy, mỏ. Cấu trúc cơ bản bậc hai của keratin được phân thành hai dạng α-
phân tử, keratin còn có một lượng lớn sulfur trong các amino acid cysteine, được liên
kết với nhau bởi những cầu nối disulfide. Nối disulfide nhiều tạo nên tính không hòa
tan của keratin, ngoại trừ các tác nhân phân hủy hay tác nhân khử như urea có thể hòa
tan keratin. Keratin của lông có ít cầu nối disulfide hơn keratin ở móng hay guốc của
động vật có vú. Do đó, móng, guốc cứng hơn so với lông. Trong trường hợp cấu hình
ß-sheet, keratin được liên kết bởi những liên kết hydrogen tự do trong không gian giữa
nhóm amino và nhóm carboxyl của những chuỗi peptide, tạo ra những liên kết dày đặc
và chắc chắn. Phân tử keratin dạng sợi có thể bện xung quanh nhau tạo thành dạng sợi
trung gian xoắn.
2.3. Enzyme keratinase
Keratinase là loại enzyme có khả phân hủy cơ chất chứa keratine có trong tự
nhiên và được phân loại là protease với mã số là EC 3.4.21/24/99.11 ( Rani Gupta,
Priya Rammani). Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (-S-S-) của cơ
chất khi tiến hành phân hủy chúng (Bokle et al., 1995). Enzyme này có nhiều đặc
trưng bề mặt như chúng có thể phân giải protein có sợ như fibrin, elastin, collagen và
các protein không có sợ như casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin… (Noval và
Nickerson, 1959; Mukhapadhaya và Chandra, 1990; Dozie et al, 1994; Lin et al, 1995;
Letourneau et al, 1998 và Bressollier et al., 1999).
Keratine từ vi sinh vật có pH nằm trong khoảng từ trung tính đến kiềm (6,0-9,0),
và nhiệt độ tối ưu từ khoảng 30 - 80, có khi đạt tới 100 như chủng vi khuẩn
Fervidobacterium islandium AW-1(Nam et al., 2002). Keratinase được kích thích
trong môi trường có chứa nhiều ion như Ca
2+
, Mg
2+
và Mn
2+
và bị ức chế bởi Cu
2+
,
là các vi khuẩn Gram dương Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp.
(Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Hầu hết các dòng vi khuẩn
này có thể phân hủy lông gia cầm trong vòng 48 giờ. Những enzyme keratinase giúp
cho vi khuẩn dự trữ carbon, lưu huỳnh và năng lượng nhằm duy trì sự sinh sản và phát
triển từ việc phân hủy β-keratin.
Hoạt tính keratinase giúp phân giải keratin trong nước còn được biểu hiện ở một
số loài vi khuẩn chịu nhiệt như Fervidobacterium pennavorans (Friedrich và
Antranikian, 1996), Thermoanaerobacter keratinophilus (Riessen và Antranikian,
2001), Fervidobacterium islandcum (Nam et al., 2002) và các dòng vi khuẩn ưa kiềm
như Nesternkonia sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp. TOA-1
(Shinju Mitsuiki et al., 2004). Hai dòng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và
Microbispora aerata IMBAS-11A, được phân lập từ các mẫu đất ở Nam cực cũng cho
thấy khả năng tạo keratinase trong quá trình phát triển trên chất thải lông cừu
(Gousterova et al., 2005).
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Khả năng thủy phân keratin ở các vi khuẩn Streptomyces có thể liên quan đến
việc các dòng vi khuẩn này tổng hợp được các protease phổ rộng như pronase, đã được
sản xuất thương mại từ vi khuẩn S.griseus (Jurasek et al., 1974). Bên cạnh đó.
S.pactum có thể làm giảm lượng cầu nối disulfide khi phát triển trên cơ chất lông vũ
(Bokle và Muller, 1997), cho thấy loài vi khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide
reductase để phục vụ sự thủy phân keratin.
Vi khuẩn có khả năng phân giải keratin được nghiên cứu nhiều nhất trên các loại
Bacillus spp., được mô tả có khả năng phân hủy lông gia cầm (Kim et al., 2001; Lin et
al., 1999). Một số dòng B.licheniformis và B.subtilis cùng một số loài khác như
B.pumilus và B.cereus đều có khả năng tạo ra keratinase (Brandelli, 2007). Gene kerA
tạo ra kháng sinh quần hợp với quy trình tạo bào tử của chúng. Vì có rất nhiều loại vi
sinh vật tạo bào tử có thể có hiệu quả làm giáng hóa nhiều hợp chất polyme sinh học
như protein, tinh bột, pectin chúng có vai trò đác kể trong chu trình sinh học của
carbon và nitrogen. Chính nhờ đặc tính này mà hiện nay B.megaterium là một trong
những loại vi khuẩn được dùng khá phổ biến trong lĩnh vực môi trường. Tuy được coi
là vi khuẩn không gây bệnh nhưng chúng đóng vai trò lớn trong việc gây nhiễm các
môi trường vô khuẩn thông qua việc tiếp xúc trực tiếp hay các hạt bụi và chúng có thể
là tác nhân gây nên phân hủy, thối rữa. Trong công nghệ sinh học, nhờ kích thước lớn
của vi khuẩn đã cho phép sử dụng B. megaterium trong nghiên cứu về protein cũng
như các nghiên cứu về màng tế bào thành công. Chủng đơn được sử dụng cho nhiều
nghiên cứu trên lĩnh vực sinh lý bào từ và cấu trúc màng tế bào, một số các ứng dụng
của nó trong xử lý môi trường và công nghiệp như sản xuất enzyme, vitamin, và rất
nhiều ứng dụng khác kể cả công nghệ gen và DNA tái tổ hợp
(www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/MOB/BMEG02.pdf ngày 28/12/2013)
2.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase
của vi sinh vật
2.5.1. Các yếu tố vật lý
Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải keratin của vi sinh vật bị ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố. Giá trị pH khoảng từ 6 – 9 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase
và sự phân hủy lông vũ ở hầu hết các vi khuẩn giá trị pH kiềm được cho là kích thích
sự phân hủy keratin do làm biến đổi các cysyine thành lathionine khiến cho keratinase
dễ dàng tiếp cận cơ chất. Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng
từ 30-50
0
C ở hầu hết các vi khuẩn. Năm 2006 Geun-Tae Park et al phát hiện vi khuẩn
Bacillus megaterium F7-1 phát triển tối ưu cũng như hoạt tính keratinase cao nhất ở
nhiệt độ 25-40
0
C và pH 7,0 – 11,0. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi
khuẩn thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là
là các nguồn dinh dưỡng đối với nhóm vi sinh vật tự
dưỡng amin. Chúng có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ ở dạng các hợp chất vô cơ
như trên, từ đó tổng hợp nên các acid amin của cơ thể. Trong các hợp chất đó, dễ hấp
thụ nhất đối với vi khuẩn là NH
3
, NH
4
+
, các dạng hợp chất này dễ dàng thâm nhập vào
tế bào và tạo nên các nhóm amin (Nguyễn Như Thanh, 1990). Dạng nitơ hữu cơ như
protein, polypeptit, acid amin là nguồn dinh dưỡng đối với nhóm vi sinh vật dị dưỡng
amin, chúng không có khả năng tự tổng hợp các acid amin của tế bào từ các hợp chất
nitơ vô cơ. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp phân tử protein mà phải
phân hủy chúng thành các polypeptit nhờ men protease. Thường chỉ những polypeptit
không quá 5 acid amin mới được vi sinh vật hấp thụ. Có những loài vi sinh vật đòi hỏi
phải có sẳn những acid amin nhất định trong môi trường nuôi cấy, các acid amin cần
thiết đó khác nhau tùy theo loài vi sinh vật. Các dạng nitơ hữu cơ không những là
nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh dưỡng carbon cho vi sinh vật. Ngoài ra,
nguồn dinh dưỡng khoáng và các chất sinh trưởng cũng rất cần thiết đối với vi sinh vật
(Trần Cẩm Vân, 2001).
Nguồn cacbon
Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO
2
,
NaHCO
3
, CaCO
3
) hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các
nguồn thức ăn cacbon khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố : một là thành phần hoá học
C sau đó đun sôi rồi mới đưa đi khử trùng ở nồi hấp áp lực.
Cellulose được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân
giải xenlulozơ dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các loại bột cellulose (cellulose
powder, avicel, )
Khi sử dụng lipit, parafin, dầu mỏ, để làm nguồn cacbon nuôi cấy một số
loại vi sinh vật phải thông khí mạnh để cho từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc được với
thành tế bào từng vi sinh vật.
Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường
không giống nhau. Với vi khuẩn, xạ khuẩn người ta thường dùng 0,05 - 0,2% đường
còn đối với nấm men, nấm sợi lại thường dùng 3 - 10% đường Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học 2.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Các nghiên cứu trong nước về vi sinh vật có khả năng phân hủy keratine còn
hạn chế. Những năm gần đây mới có một vài nghiên cứu về một số loại vi sinh vật có
khả năng phân giải keratin. Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Hương (2001) đã
tiến hành phân lập được từ đất cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng vi
khuẩn Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng
Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh.
Nguyễn Huy Hoàng et al. (2010) cũng đã tiến hành phân lập các chủng vi
khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… có khả năng phân hủy keratine ứng dụng vào
chế biến thức ăn thủy sản. Điều kiện cho các chủng vi khuẩn này là ở nhiệt độ từ 30-
40 thì khả năng phân hủy lông gia cầm từ 75%- 90% sau một tuần nuôi cấy.
enzyme hoạt động là 55
o
C, pH = 8. Dòng kr2 được xác định là thuộc họ Vibrionaceae.
Gupta và Ramnani (2006) cũng đã tổng hợp các đặc điểm của các dòng vi khuẩn
có khả năng phân hủy keratin được phân lập từ các bài nghiên cứu trước đó. Kết quả
cho thấy, các dòng vi khuẩn phân hủy keratin có dòng Gram âm và có dòng Gram
dương. Các dòng vi khuẩn Gram dương đã được phân lập phần lớn thuộc chi Bacillus:
Bacillus licheniformis PWD-1 (Williams et al., 1990), Bacillus subtilis S14 (Macedo et
al., 2005), Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, và Bacillus cereus (Kim et al.,
2001), hoặc chi Streptomyces như: Streptomyces flavus (Antarctic soil Gushterova et
al., 2005), Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995), Streptomyces
albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999), Streptomyces thermoviolaceus (Chitte et
al., 1999) và một vài trường hợp khác là các dòng Fervidobacterium pennavoran
(Friedrich, Antranikian, 1996), Microbacterium sp. kr10 (Thys et al., 2004),
Terrabacter terrae (Barrientos et al, 2005) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Các
dòng Gram âm chủ yếu thuộc các chi Vibrio (Sangals, Brandelli, 2000) và chi
Chryseobacterium (Riffel et al., 2003),…
Park và Son (2009) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường
đến sự phân giải lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn Bacillus megaterium F7-
1. Vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng 7 ngày. Nhiệt độ 25
o
C - 40
o
C,
và pH 7,0 – 11,0 là tối ưu cho sự phát triển cũng như hoạt tính keratinase của dòng vi
khuẩn này. Hoạt tính keratinase tạo ra trong môi trường chứa 0,6% sữa không béo là
468 U/ml, cao gấp 9,4 lần so với hoạt tính tạo ra trong môi trường không bổ sung sữa.
Lượng keratinase tạo ra phụ thuộc vào hàm lượng lông vũ.
Savitha et al. (2010) đã phân lập 2 dòng vi khuẩn phân hủy keratin từ đất:
(KI8101 và KI8102) và nhận diện 2 dòng này là Bacillus subtilis và B. licheniformis.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2013-04/2014 tại PTN Sinh học phân tử Thực
vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần
Thơ.
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm
Mẫu lông gia cầm thu ở một số cơ sở giết mổ gia cầm thuộc tỉnh Vĩnh Long,
chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 được cung cấp bởi PTN Sinh học phân tử
Thực vật do Huỳnh Kim Yến phân lập năm 2013
3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn phân hủy keratin
a. Môi trường tăng sinh khối (Riffle et al, 2003)
Bảng 2: Thành phần môi trƣờng tăng sinh khối
Hóa chất
Nồng độ (g/l)
NaCl
Chuyên ngành Công nghệ Sinh Học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học b. Môi trường lỏng (Bo Xu et al., 2009): đánh giá khả năng phân hủy keratin và
sự hoạt động của enzyme keratinase.
Bảng 3: Thành phần môi trƣờng lỏng
Hóa chất
Nồng độ (g/l)
NaCl
0,5
K
2
HPO
4
0,3
KH
2
PO
4
0,4
MgCl
2
.6H
2
O
0,1
0,4
MgCl
2
.6H
2
O
0,1
Bột lông vũ
10
Agar
15
Chỉnh pH về mức 7,5 ở 37
0
C
Copyright: Tài liệu đại học ©