BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
(CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN)
PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ
NƢỚC THẢI LÒ BÚN LỆ CHÂU, THÀNH PHỐ SÓC TRĂNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP CHẾ MINH NGỮ
MSSV: 3102760
Lớp: CNSH Tiên Tiến K36
Cần Thơ, tháng 12/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
NGƢỜI HƢỚNG DẪN SINH VIÊN
PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp Chế Minh Ngữ
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ
Trong quá trình học tập tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học-Đại học Cần Thơ,
tôi luôn nhận được sự quan tâm sâu sắc từ gia đình cũng như sự giúp đỡ to lớn từ thầy
cô và bạn bè. Những điều đó đã giúp tôi vượt qua những khó khăn trong hoạc tập và
hoàn thành tốt chương trình học cũng như luận văn của mình. Với lòng biết ơn sâu sắc
tôi xin gửi lời cảm tạ đến:
có khả năng sinh acid. Số dòng vi khuẩn có khả năng di động trên môi trường bán
lỏng là 19 dòng và số dòng vi khuẩn Gram (+) là 5 dòng. Tám trong số 24 dòng vi
khuẩn có khả năng tổng hợp amylase. Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp
amylase tốt là D2, D15 và D16.
Dòng D15 và D16 được chọn để khảo sát sự tăng
trưởng và giải trình tự vùng gen 16S rRNA. Kết quả giải trình tự được so sánh trên
ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy dòng D15 là Bacillus cereus với độ tương đồng 97%
và dòng D16 là Bacillus flexus với độ tương đồng 89%. Hai loài vi khuẩn này đều có
khả năng phân hủy tinh bột rất tốt và có thể được ứng dụng để xử lý nước thải chứa
tinh bột.
Từ khóa: Amylase, Bacillus cereus, Bacillus flexus, lò bún và tinh bột
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lƣợc về nƣớc thải công nghiệp 2
2.1.1. Nước thải công nghiệp và ảnh hưởng của nước thải công nghiệp 2
2.1.2. Đặc điểm của nước thải công nghiệp 2
2.2. Các phƣơng pháp xử lý nƣớc thải (Dƣơng Nguyên Khang, 2014) 2
2.8.5. Phương pháp thử Methyl red (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 16
2.9. Kỹ thuật PCR và phƣơng pháp giải trình tự 17
2.9.1. Kỹ thuật PCR 17
2.9.2. Giải trình tự 18
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 21
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu và tiến độ thực hiện 21
3.1.2. Vật liệu 21
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị 21
3.1.4. Hóa chất và môi trường 22
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 24
3.2.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu 24
3.2.2. Đo kích thước vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) 25
3.2.3. Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 26
3.2.4. Nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) 26
3.2.5. Kiểm tra catalase 27
3.2.6. Kiểm tra Methyl red 27
3.2.7. Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 27
3.2.8. Sự tăng trưởng của vi khuẩn theo thời gian 29
3.2.9. Khuếch đại vùng gene 16S rRNA 30
3.2.10. Giải trình tự 32
3.2.11. Xử lý kết quả thí nghiệm 32
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1. Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái 33
4.1.1. Kết quả phân lập 33
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
4.1.2. Đặc điểm hình thái 34
4.2. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 39
4.3. Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase 42
Bảng 9: Kết quả nhận diện vi khuẩn 46
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn 3
Hình 2: Chất ô nhiễm bị biến đổi trực tiếp 4
Hình 3: Chất ô nhiễm bị biến đổi gián tiếp 5
Hình 4: Quy trình sản xuất bún tươi từ gạo tẻ 6
Hình 5: Nước thải từ làng bún gây ô nhiễm kênh rạch xung quanh 7
Hình 6: Cấu trúc phân tử amylose (French, 1973) 8
Hình 7: Cấu trúc phân tử amylopectin (French, 1973) 9
Hình 8: Cơ chế phân hủy tinh bột (Marc et al., 2002) 11
Hình 9: Vi khuẩn Bacillus cereus 12
Hình 10: Vi khuẩn Lactobacillus amylovorus (Nakamura, 1981) 13
Hình 11: Sự chuyển hóa glucose bởi vi khuẩn 16
Hình 12: Khoảng đổi màu của Methyl red 16
Hình 13: Vị trí các giếng trên môi trường kiểm tra hoạt tính amylase 28
Hình 14: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được 33
Hình 15: Khả năng chuyển động của vi khuẩn trong môi trường bán lỏng 37
Hình 16: Hình nhuộm Gram vi khuẩn với độ phóng đại 1000 lần 38
Hình 17: Hoạt tính catalase của dòng D10 (+) 40
Hình 18: Hoạt tính catalase của dòng D8 (++) 40
Hình 19: Hoạt tính catalase của dòng D20 (+++) 40
Hình 20: Kết quả kiểm tra Methyl red 41
Hình 21: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15 42
Hình 22: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15 42
Hình 23: Mật số của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 ở các thời điểm 44
Hình 24: Đường tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 theo thời gian 45
Hình 25: Phổ điện di DNA của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 45
độc hại như metan, hydro sunfua, v.v Việc ô nhiễm này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến
sức khỏe con người và vật nuôi, hệ thủy sinh và mạch nước ngầm. Do đó, việc xử lý
nước thải ở các cơ sở sản xuất bún rất bức thiết.
Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải nhưng khi xét về cơ sở khoa học
thì gồm có phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Vì
nước thải của các cơ sở sản xuất bún chứa nhiều tinh bột (chất hữu cơ dễ phân hủy)
nên sử dụng phương pháp sinh học-vi sinh (bioremediation) để xử lý là phù hợp nhất.
Phương pháp vi sinh có các ưu điểm như thân thiện với môi trường, rẻ tiền và hiệu quả
xử lý cao. Để có thể ứng dụng phương pháp vi sinh vào xử lý nước thải ở cơ sở sản
xuất bún thì bước đầu tiên là phân lập những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh
bột mạnh từ chính nước thải đó. Vì vậy đề tài “Phân lập và nhận diện một số dòng vi
khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nước thải lò bún Lệ Châu, Thành phố Sóc
Trăng” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu
Phân lập và nhận diện được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột
từ nước thải lò bún Lệ Châu, TP. Sóc Trăng.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về nƣớc thải công nghiệp
2.1.1. Nƣớc thải công nghiệp và ảnh hƣởng của nƣớc thải công nghiệp
Nước thải công nghiệp là nước được thải ra sau khi đã sử dụng hoặc được tạo ra
trong một quá trình công nghệ và không còn giá trị trực tiếp đối với quá trình đó hay
nước thải công nghiệp là nước được thải ra từ các hoạt động sản xuất công nghiệp.
Nước thải công nghiệp là một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường
nước.
Phương pháp sinh học gồm có phương pháp vi sinh hiếu khí (bioremediation),
phương pháp thực vật (phytoremediation) và phương pháp ủ kỵ khí metan
(bioconversion). Trong đó phương pháp vi sinh hiếu khí liên quan mật thiết với đề tài
đang nghiên cứu. Mục đích của phương pháp vi sinh hiếu là lên men phân hủy các chất
hữu cơ nhờ hoạt động của vi sinh vật hiếu khí. Sản phẩm cuối cùng là là chất khí (CO
2
,
N
2
,CH
2
, v.v.), các chất vô cơ và tế bào mới. Phương pháp này khi áp dụng sẽ cho hiệu
quả cao, tận dụng được các sản phẩm phụ làm phân bón (bùn hoạt tính) và thân thiện
với môi trường.
2.2.2. Phƣơng pháp vi sinh hiếu khí (Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)
Hình 1: Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn
(Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)
Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn cần có nguồn dinh dưỡng và nguồn năng
lượng từ môi trường chúng sống. Nguồn năng lượng của vi khuẩn thường là các chất
cho điện tử (e
-
) và nguồn dinh dưỡng là những chất cung cấp các nguyên tố thiết yếu
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
như C, O, N, P và những nguyên tố vi lượng. Sau khi tham gia vào quá trình sinh tổng
hợp, những chất này được chuyển hóa thành chất nhận điện tử.
Một số quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn gây ô nhiễm khi chất nhận điện tử là
các chất gây ô nhiễm.
Vi khuẩn được dùng để xứ lý nước thải khi chúng sử dụng các chất có trong nước
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.3.2. Quy trình sản xuất bún tƣơi
Hình 4: Quy trình sản xuất bún tƣơi từ gạo tẻ
(Tống Thành Trung, 2010)
Quá trình ngâm nhằm làm mềm hạt gạo để quá trình nghiền bột được dễ dàng
hơn. Quá trình ngâm còn là giai đoạn để vi khuẩn lactic lên men sinh acid.
Quá trình nghiền ướt làm cho hạt gạo nhuyễn hơn và tinh bột không bị biến tính.
Làm ráo là để tách bớt nước chuẩn bị cho quá trình hồ hóa.
Quá trình hồ hóa sơ bộ nhằm hồ hoá một phần tinh bột nhằm tạo cho khối bột
một độ đặc nhất định khi tiến hành nhào.
Nhào nhằm phá vỡ khối hạt, tạo điều kiện cho hạt tinh bột liên kết với nước làm
cho khối bột trở nên đặc và chắc hơn.
Quá trình ép đùn nhằm định hình cho bún, đồng thời làm chín một phần bún do
tác động của nhiệt độ sau khi ra khỏi khuôn ép.
Quá trình luộc nhằm làm bún chín hoàn toàn.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Quá trình làm nguội nhằm làm các sợi tinh bột sắp xếp lại và ổn định chất lượng
tạo sợi của chúng.
Quy trình làm bún khô cũng tương tự như làm bún tươi nhưng có thêm giai đoạn
tái hấp, sấy khô và đóng gói.
2.3.3. Nƣớc thải từ cơ sở sản xuất bún
Từ quy trình sản xuất, ta thấy rằng nước thải từ việc sản xuất bún sẽ chứa phần
lớn chất hữu cơ là tinh bột hòa tan. Nếu không được xử lý trước khi thải ra môi trường
thì sẽ gây ô nhiễm do tinh bột hòa tan bị lên men yếm khí. Hiện nay, một số làng nghề,
(mg/l) (20
o
C)
1655,4
50
COD (mg/l)
2287,2
150
- COD là lượng oxy cần để oxy hoá toàn bộ các chất hoá học trong nước
- BOD là lượng oxy cần thiết để oxy hoá các hợp chất hữu cơ dễ phân huỷ bởi vi sinh vật)
(Nguồn: Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường Tp. Sóc Trăng, 14/4/2014)
2.4. Sơ lƣợc về tinh bột
2.4.1.Tính chất vật lý và trạng thái tự nhiên
Tinh bột là chất rắn vô định hình, màu trắng, không tan trong nước nguội.
Trong nước nóng từ 65
o
C trở lên tinh bột chuyển thành hồ tinh bột. Tinh bột có nhiều
trong các loại hạt (gạo, mì, ngô, v.v.), củ (khoai, sắn, v.v.) và quả (táo, chuối, v.v.).
2.4.2. Cấu trúc phân tử của tinh bột
Hình 6: Cấu trúc phân tử amylose (French, 1973)
a) Các gốc α-glucose nối với nhau bởi lien kết α-1,4-glycoside
b) Mô hình phân tử amylose
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Tinh bột là hỗn hợp của hai polisaccarit: amylose và amylopectin. Cả hai đều có
công thức phân tử là (C
6
H
10
Amylase có nhiều trong thực vật, động vật và vi sinh vật (Vidyalakshmi et al.,
2009). Theo Das et al. (2011), amylase là enzyme đầu tiên được phát hiện và đã được
chiết tách bởi Anselme năm 1833. Enzyme đầu tiên được sản xuất theo quy mô công
nghiệp vào năm 1894 cũng là một loại amylase có nguồn gốc từ nấm và được sử dụng
trong y học như một loại thuốc chữa rối loạn tiêu hóa. Biodin và Effront là những
người đầu tiên dùng B. subtilis và B. mesentericus cho việc sản xuất α-amylase cho
mục đích kinh tế bằng việc sử dụng những sinh vật lên men lớn và LSF (Liquid State
Fermentation – sự lên men trong trạng thái lỏng).
Amylase được ứng dụng rộng rãi trong đời sống. Trong ngành công nghiệp thực
phẩm, amylase được sử dụng trong sản xuất bánh mì, tương, mạch nha, bột ngọt, v.v
Trong ngành dệt, các chế phẩm amylase được dùng để tẩy lớp hồ bột trên mặt vải làm
cho vãi mềm, mịn. Trong sản xuất rượu bia, amylase được dùng trong giai đoạn đường
hóa tinh bột. Ngoài ra amylase còn được dùng trong chế biến dược phẩm.
2.5.3. Phân loại enzyme amylase (Marc et al., 2002)
Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào hai nhóm: endoamylase và exoamylase.
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử
nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase và khử gián tiếp là
oligo-1,6-glucosidase và transglucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên
trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là
những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
2.5.4. Tính chất của emzyme amylase
*Tính đặc hiệu: enzyme amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside và α-1,6-
glycoside trong quá trình phân hủy tinh bột hoặc glycogen (dạng dự trữ của tinh bột ở
động vật). Amylase chỉ xúc tác phân hủy tinh bột và glycogen mà không thủy phân các
cơ chất khác kể cả cellulose (cũng có liên kết 1,4-glycoside).
*Tính chất vật lý và hóa học: enzyme amylase dễ tan trong nước, trong dung
dịch muối và rượu loãng. Các amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
acid khác nhau, mỗi loại amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. Hoạt động
Transglucosidase có tác dụng thủy phân maltose thành glucose. Ngoài ra
transglucosidase còn có thể tổng hợp izomaltose, izomaltosetriose và panose (tức
chuyển gốc glucose gắn vào phân tử glucose khác hoặc phân tử maltose bằng liên kết
α-1,6-glycoside để tạo thành panose và izomaltose).
Oligo-1,6-glucosidase phân cắt liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose, panose
và các dextrin thành các phân tử đường có thể lên men được.
2.6. Một số chi vi khuẩn phân hủy tinh bột
Trong môi trường tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột
thuộc các chi như như Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, v.v (Nguyễn Hữu Hiệp
và Nguyễn Thị Hải Lý, 2012). Những loài vi khuẩn này tiết ra các loại enzyme trong
hệ enzyme amylase để phân hủy tinh bột thành những hợp chất đơn giản hơn (như
glucose) để đáp ứng quá trình sinh tổng hợp của chúng.
2.6.1. Vi khuẩn Bacillus sp.
Hình 9: Vi khuẩn Bacillus cereus
(
Hầu hết các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đều có khả năng sinh nội bào tử hiếu
khí, Gram dương và hình dạng que dài. Ví dụ như Bacillus cereus (Hình 9) là một loại
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Công nghệ Sinh học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vi khuẩn có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng có khả năng phân hủy tinh bột
tốt (Sanjoy et al., 2009. Một số loài vi khuẩn khác thuộc chi này cũng có khả năng
phân hủy tinh bột như Bacillus subtilis (Konsula et al., 2003), Bacillus megaterium
(Mary et al., 1980) và Bacillus flexus (Jian et al., 2009) .
2.6.2. Vi khuẩn Lactobacillus sp.
Lactobacillus sp. là những loài vi khuẩn Gram dương, kỵ khí không bắt buộc
hoặc vi hiếu khí, hình que, di chuyển thụ động và không tạo bào tử. Lactobacillus sp.
có mặt trong các thực phẩm lên men (như sữa chua, phó-mat, dưa cải, v.v.), trong dạ
dày, đường sinh dục của người và động vật có vú…Ngoài khả năng lên men lactic,
một số loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng phân hủy tinh bột mạnh.
với môi trường.
2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Việc xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh đã và đang được các nhà khoa
học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Hầu hết những nghiên cứu đều có điểm
chung trong việc phân lập là tìm kiếm những dòng vi sinh vật có khả năng phân hủy
các chất hữu cơ từ chính nguồn nước thải chứa nhiều chất hữu cơ đó. Những nghiên
cứu đó cũng cho kết quả rất khả quan vì đa phần đã tìm được những vi sinh vật mong
muốn.
2.7.1. Trong nƣớc
Năm 2012, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý đã thực hiện thành công
trong nghiên cứu phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tại làng
nghề sản xuất bột gạo tại thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp. Nghiên cứu cho kết quả 4
dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh trong đó dòng 9
35
và VD2 có khả năng xử lý
đến 97% lượng tinh bột có trong nước thải chỉ sau 24 giờ.
Năm 2010, Vũ Thị Hương Lan phân được 6 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột
mạnh từ nước thải sản xuất nui. Các dòng này đều xử lý tốt nước thải từ nhà máy sản
xuất nuôi. Sau khi xử lý, giá trị COD của nước thải sản suất nuôi giảm từ 76-88% so
với giá trị ban đầu.
Copyright: Tài liệu đại học ©