TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẨN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ BÍCH PHƢƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN
TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA ( ĐẦU CÁ) BẰNG
ENZYME BROMELAIN

Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẨN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THƢC PHẨM

Tên đề tài
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN
TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA ( ĐẦU CÁ) BẰNG
ENZYME BROMELAIN

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân. Các thông tin
về số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và
chưa từng được công bố trong bất kì luận văn nào trước đây.

LỜI CẢM TẠ

bromelain” Sử dụng enzyme bromealin thương mại chiết xuất từ thân khóm (EC
3.4.22.32) trong thủy phân phụ phẩm cá tra- phế liệu của ngành chế biến thủy sản.
Quá trình thủy phân được thực hiện ở pH 6,5, nhiệt độ 55
0
Cđiều kiện thủy phân tối
ưu của enzyme bromealin trên cơ chất thịt cá. Nhằm tìm ra giá trị nồng độ cơ chất,
nồng độ enzyme và thời gian thủy phân cho hiệu suất tối ưu. Qua quá trình khảo sát
cho thấy hàm lượng protein trung bình trong thịt cá thu được là 17,363g/100g
nguyên liệu, đây là nguồn nguyên liệu có thành phần dinh dưỡng cao. Kết quả thủy
phân xác định cặp tỉ lệ 1,5mg E/ 1,042g protein cho hiệu suất tương đối cao và ổn
định, sau 120 phút hiệu suất thủy phân đạt được 22,75% (tính theo lượng tyrosin
sinh ra). MỤC LỤC

3.1.4 Nguyên liệu 13
3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.2.1 Quy trình chuẩn bị nguyên liệu 14
3.2.2 Phương pháp phân tích 14
3.2.3 Xử lí số liệu 15
3.3 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ 15
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 19
4.1 Thành phần hóa học trong nguyên liệu 19
4.2 Thông số động học của enzyme bromelain 19
4.3 Tỉ lệ nồng độ E/S 20
4.4 Thời gian thủy phân tối ƣu 21
4.5 Mức độ thủy phân của enzyme 23
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25
5.1 KẾT LUẬN 25
5.2 ĐỀ NGHỊ 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 27
PHỤ LỤC A ix
PHỤ LỤC B x
PHỤ LỤC C xvii
DANH SÁCH HÌNH



DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của thịt cá tra fillet 3
Bẳng 2.2 Thành phần dinh dưỡng trong 100g thịt cá 4
Bảng 4.1 Hàm lượng các thành phần hóa học trong nguyên liệu 19
Bảng 4.2 Vận tốc phản ứng cực đại và hằng số tốc độ phản ứng của enzyme
bromelain 20
Bảng 4.3 Hàm lượng đạm amin và tyrosin sinh ra sau thủy phân 20

CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1. TỔNG QUAN
Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường bờ biển dài, nên rất thuận lợi
phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản.Trong đó,ngành nuôi cá tra,
basa của Việt Nam phát triển mạnh trong những năm qua do nhu cầu lớn từ các thị
trường xuất khẩu.Với điều kiện thiên nhiên thuận lợi và chế độ nuôi dễ dàng, cũng
như giá trị xuất khẩu cao, nên xuất khẩu cá tra, basa chiếm tỷ trọng chủ yếu trong
xuất khẩu cá da trơn. Sản lượng cá tra nguyên liệu 2012 đạt 1190 tấn, cung cấp trên
87% sản lượng cá tra chế biến của cả nước.
Tuy nhiên, sự phát triển của ngành thủy sản vẫn còn có những vấn đề bắt cặp, đó là
lượng phụ phẩm sau phi lê bao gồm: thịt vụn, đầu, xương, vây,… tăng tỷ lệ thuận
với lượng cá fillet xuất khẩu.Trung bình sản xuất 1kg thành phẩm cá fillet đông
lạnh cần khoảng 2,6 kg cá nguyên liệu. Như vậy, lượng phụ phẩm từ công nghiệp
chế biến cá tra fillet đông lạnh khoảng 450.000- 480.000 tấn phụ phẩm/năm (ông
Trần Hữu Thích giám đốc công ty STECG, 2006).Nguồn phụ phẩm hiện nay rất
lớn, nếu không có biện pháp xử lý triệt để nguồn phụ phẩm này sẽ gây ô nhiễm môi
Hình2.1 Cá tra nguyên con
(Nguồn: http://phuongdongseafood.com.vn)
 Nguồn gốc và phân bố
Cá tra có nguồn gốc từ vùng Thượng Lào và di cư về Campuchia, vào mùa sinh sản
cá tra bơi ngược vào Biển Hồ để bắt cặp và sinh sản. Trứng trôi về hạ lưu sông Tiền
và sông Hậu Việt Nam sinh sôi.
Cá tra phân bố ở khu vực sông MeKong, có mặt ở cả bốn nước Lào, Việt Nam,
Campuchia và Thái Lan. Ở Thái Lan còn gặp cá tra ở lưu vực sông MeKong và
Chao Phraya. Ở nước ta, những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá
bột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy
trong ao nuôi, rất ít gặp trong tự nhiên ở địa phận Việt Nam, do tập tính di cư ngược
dòng sông MeKong để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên.
Năm 1970, cá tra bắt đầu được nuôi bằng bè tre tại Châu Đốc, sau đó được thay
bằng các hầm dọc theo sông Tiền và sông Hậu vào năm 1985. Đến năm 1996, cá tra
được xuất khẩu qua Mỹ và trở thành một trong những mặt hàng xuất khẩu chính của
Việt Nam cho đến nay.
(Nguồn:http:// www.anvifish.com)
 Hình thái, sinh lý
Cá tra là cá da trơn không vảy, thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng,
đôi râu dài. Cá tra sống chủ yếu ở nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ
(nồng độ muối từ 7- 10), có thể chịu được nước phèn với pH>5, không sống được ở
nhiệt độ thấp dưới 15
0
C, nhưng chịu nóng tới 39
0
C.Cá tra có số lượng hồng cầu
nhiều hơn các loài cá khác. Có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng
khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan.

Cá tra là một trong những loài cá có giá trị xuất khẩu cao. Cá tra của Việt Nam
được nhiều thị trường ưa chuộng vì màu sắc cơ thịt trắng, có vị thơm ngon so với
các loài cá da trơn khác. Thành phần dinh dưỡng trong 100g cơ thịt cá bao gồm:

Bảng 2.2 Thành phần dinh dƣỡng trong 100g thịt cá
Tổng năng
lượng cung
cấp (calori)
Chất đạm (g)
Chất béo (g)
Chất béo
chưa bão hòa
(DHA, EPA)
(g)
Cholesterol
(%)
Natri (mg)
124.52
23.42
2.42
1.78
0.025
70.6
(Nguồn: http://www.saomaiag.vn)
2.1.2 Giới thiệu về phụ phẩm cá tra
Phụ phẩm cá tra được định nghĩa là những thứ phẩm không có giá trị thương
mại (như: thịt vụn sau fillet cá, xương, đầu, mỡ, da, máu,…) nhưng có thể tái chế

dầu: loại nhẹ có thể trích ly DHA (omega 3) sử dụng trong công nghệ dược phẩm,
thực phẩm; loại nặng sản xuất dầu biodiesel sử dụng cho động cơ.
 Đầu, xương sống, ruột,…chế biến thành thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi
sau khi đã nấu lấy mỡ.
 Bong bóng cá bán cho những đại lý chuyên thu mua sấy khô cung cấp cho các
nhà hàng nấu súp. Bao tử cá làm sạch bán cho các quán ăn đặc sản.
 Phế liệu cá Tra còn được chế biến thành sản phẩm bổ sung đạm động vật, gọi là
bột cá. Là một sản phẩm làm từ cá nguyên con, xương và phụ phẩm từ cá sau chế
biến.
2.2 GIỚI THIÊU VỀ ENZYME
2.2.1 Khái quát về enzyme
Enzyme là những chất xúc tác sinh học và là các phân tử protein trong tự
nhiên.Bản chất của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học, là một loại
protein được sinh vật sống tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học
(Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011).
Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Có khả năng xúc tác
đặc hiệu các phản ứng hóa học theo chiều hướng nhất định. Khả năng xúc tác của
enzyme là do cấu trúc protein đặc biệt của nó. Một phản ứng hóa học cụ thể được
xúc tác tại một phần nhỏ trên bề mặt của một loại enzyme, tại đó được gọi là trung
tâm hoạt động của enzyme.
Enzyme được cấu tạo từ các L- α- acid amin kết hợp với nhau qua liên kết
peptide. Khi nghiên cứu chi tiết về enzyme cho thấy enzyme có thể là protein hoặc
proteit (cấu từ enzyme liên kết với cấu tử phi protein tạo thành proteit). Trên cơ sở
đó thường phân enzyme thành 2 nhóm:
 Nhóm enzyme một cấu tử như pepsin, amylase…trong phân tử chỉ
chứa cấu tử protein. Do vậy trung tâm hoạt động của của nó là sự phối hợp giữa các
nhóm chức tự do của acid amin. Các nhóm chức thường gặp của acid amin trong
trung tâm hoạt động của enzyme là: nhóm –SH (sunfihydryl) của Cuys, nhóm –OH
(hydroxyl) của Ser, nhóm –COOH (carboxyl) của Asp hay Glu. Những enzyme này
thường xúc tác cho phản ứng thủy phân.

k
1
ES= k
1
(E
0
 - ES)S (2)
Với E
0
: nồng độ enzyme ban đầu.
ES: nồng độ phức trung gian enzyme- cơ chất
E: nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt đến cân bằng
Do đó: E=E
0
- ES
Nồng độ cơ chất ban đầu cũng được xem là nồng độ cơ chất lúc phản ứng đạt đến
cân bằng, vì nồng độ cơ chất trong phản ứng luôn lớn hơn nhiều lần nồng độ
enzyme, do đó có thể bỏ qua lượng S trong phức chất ES; khi nghiên cứu động
k
3
k
1

k
2
(1)
học phản ứng enzyme thường xác định vận tốc ban đầu, lượng cơ chất bị chuyển
hóa chưa đáng kể so với nồng độ ban đầu của nó.
 Vận tốc phân ly phức hợp ES là tổng vận tốc của hai phản ứng:
 Phản ứng phân ly phức hợp ES để tạo E và S (ngược lại với phản ứng kết

kK
m


(K
m
gọi là hằng số Michalis Menten)
Từ (4) ta suy ra:
][
][
][][
0
SK
S
EES
m


(5)
Qua đây cho thấy, khi ES càng lớn thì vận tốc phản ứng càng lớn.Khi nồng độ cơ
chất đủ lớn, thì tất cả các phân tử enzyme có trong phản ứng đều tham gia tạo phức
ES, vận tốc phản ứng sẽ đạt cực đại (V
max
). Từ đó có thể thiết lập tỉ lệ sau:
][
][
0max
E
ES
V

][
][
max
SK
S
VV
m


(7)
Phương trình (7) được gọi là phương trình Michaelis- Menten.
K
m
gọi là hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzyme. K
m
đặc trưng cho ái lực
enzyme với cơ chất, K
m
có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng
lớn, nghĩa là vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn. (Nguyễn Thị Thu Thủy,
2006).

al.,2001).
Bromelain hiện diện trong tất cả các phần của cây dứa (thân, chồi, quả). Tuy nhiên,
chúng chiếm trên 50% protein trong quả dứa. Do đó enzyme bromelain còn được
gọi là “enzyme dứa”. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác
nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.Hoạt động tốt ở pH 6-8 (Nguyễn Đức Lượng,
2004).Nó có trọng lượng phân tử 23.000Da(H.R.Maurer, 2001).Phạm vi nhiệt độ
hoạt động 40- 65
0
C, điều kiện hoạt động tốt là 55
0
C.
Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được dùng làm nguyên liệu chính để sản
xuất ra enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt
là sau mùa thu hoach trái.
Enzyme Bromelain thân (EC 3.4.22.32)
- Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain.
- Tên khoa học và y học: sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease.
- Tên thương mại: Bromanase (Kramer- Novis), bromelain 2400 Maximum
Strength ( vitalize Corp).
2.3.2 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme Bromelain
a. Cấu tạo
Enzyme bromelain là một protease- thiol.Trong trung tâm hoạt động của
bromelain có chứa cysteine,đây là một acid amin có nhóm hóa học hoạt động mạnh
là –SH (sulfuhydryl) thủy phân protein, và hai sợi polypeptide liên kết với nhau
bằng cầu nối -S – S Phân tử bromelain có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức
tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra trong bromelain còn
có sự hiện diện của ion Zn
2+
đóng vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
Bromelain thân là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 monose, 2

độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử,
làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí không
gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất.Nhiệt
độ quá cao hoặc quá thấp sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính
của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999).
Ở dịch chiết quả (pH 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60
o
C thì bromelain vẫn còn hoạt
tính nhưng bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 5
o
C, pH 4-10 thì enzyme
giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24 giờ. Ở 55
o
C, pH 6.1 thì enzyme bị mất 50%
hoạt tính trong vòng 20 phút ( Nguyễn Đức Lượng, 2004).

 Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của
enzyme.Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định
gọi là pH tối thích.
Bromelain có biên độ pH hoạt động khá rộng, từ pH 3- 10. Vùng pH tối thích cho
enzyme bromelain không ổn định, mà phụ thuộc vào bản chất và nồng độ cơ chất,
độ tinh sạch enzyme, nhiệt độ và bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của các
chất hoạt hóa cũng như thời gian phản ứng. Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của
enzyme bromelain lại là pH 5-8. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
 Ảnh hưởng bởi cơ chất
Tùy theo cơ chất xúc tác mà enzyme bromelain thể hiện hoạt tính khác nhau. Nếu
cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4
lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này tương đương
nhau.Đối với cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của bromelain yếu hơn

rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của trung tâm hoạt
động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối
trí bổ sung với các nhóm chức khác của phân tử protein như amin, carbocyl,…)
enzyme-SH + Zn
2+
=> enzyme-S-Zn + H
+
. Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động
đã bị ester hóa bởi cơ chất, nhưng cấu trúc không gian được bảo vệ nhất định.
Bromelain là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng
thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid. Hình 2.4: Phản ứng xúc tác thủy phân protein của enzyme bromelain
(Lê Kim Thanh, 2007)
2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, nồng độ
enzyme và thời gian lên hoạt tính xúc tác thủy phân của enzyme bromelain trên cơ
chất thịt cá.
Phần thí nghiệm bao gồm các nội dung sau:
 Khảo sát nguyên liệu ban đầu, xác định các thành phần: protein tổng, Nitơ tổng
số, béo và ẩm.
 Xác định các thông số động học V
max
(vận tốc phản ứng cực đại), K
m
(hằng số

2
SO
4
:CuSO
4
:Se).
- H
2
SO
4
đậm đặc, H
2
SO
4
0,1N, H
3
BO
3
2%, Ether dầu hỏa 30- 60.
- Dung dịch đệm phosphate (Na
2
HPO
4
- KH
2
PO
4
0,1M), HCl 0,2N, NaOH
0,5N.
- Acid tricloacetic (TCA).

 Xác định hàm lượng đạm tổng số trong thịt cá tra nguyên liệu bằng phương
pháp Kjeldahl.
 Xác định hàm lượng béo trong thịt cá nguyên liệu bằng phương pháp
Soxleht.
 Khảo sát thông số động học của enzyme bromelain trên cơ chất thịt cá
nguyên liệu dựa vào hàm lượng tyrosin sinh ra theo phương pháp Anson.
 Xác định hàm lượng đạm amin sinh ra sau thủy phân theo phương pháp
OPA.
 Xác định hàm lượng tyrosin tổng bằng cách thủy phân hoàn toàn protein
bằng phương pháp hóa học.
3.2.3 Xử lý số liệu
Thí nghiệm được khảo sát với 3 lần lặp lại trên cùng một nguyên liệu. Kết quả được
xư lý bằng phần mềm ứng dụng MS. Excel 2010. Tính toán thống kê, phân tích
phương sai, kiểm định LSD bằng phần mềm Stagraphic 16.1.18. Xác định các thông
số động học V
max
, K
m
bằng phần mềm SAS 9.1.3 portable.exe.

3.3 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định thông số động học enzyme bromelain (V
max
, K
m
)
trên cơ chất phụ phẩm cá tra (đầu cá)
 Mục đích: Xác định độ nhạy và tốc độ cực đại của enzyme bromelain trên cơ
chất thịt nạc cá.
 Bố trí thí nghiệm:

11
: 4g A
12
: 4,5g
A
13
: 5g A
14
: 5,5g A
15
:6g
A
16
: 6,5g A
17
: 7g A
18
:7,5g
Tổng số nghiệm thức: 18x 1=18 nghiệm thức
Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Tổng số mẫu thí nghiệm:18x1x3=54 (mẫu)
 Cách tiến hành
Cân nguyên liệu thịt đầu cá và enzyme cho vào bình tam giác, bổ sung thêm dịch
đệm phosphate. Ủ ở 55
0
C trong 30 phút, hút enzyme vào dịch cơ chất, tiếp tục thủy
phân trong 30 phút. Sau đó đem lọc để tiến hành phương pháp đo quang phổ.