ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)
ĐỀ TÀI
NGHIÊN C
ỨU ỨNG DỤNG DUNG DỊCH THỦY PHÂN
TỪ PHỤ PHẨM CÁ BẰNG ENZYM LÀM PHÂN BÓN
CHO MỘT SỐ LOẠI RAU TRONG NHÀ MÀNG
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên) Phạm Đình Dũng Trần Văn Lâm
CƠ QUAN QUẢN LÝ
(Ký tên, đóng dấu xác nhận)
CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên, đóng dấu xác nhận)
07 tháng 4 năm 2011)
8. Mục tiêu đề tài:
Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm phân bón lá mới có nguồn gốc từ phụ
phẩm cá Tra và tiến hành khảo nghiệm trên dưa leo và cải xanh trong nhà màng tại TP.
Hồ Chí Minh.
9. Nội dung nghiên cứu:
Nội dung 1: Khảo sát quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym
Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả thủy phân của một số loại enzym đến quá trình
thủy phân protein phụ phẩm cá Tra.
Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt độ của enzym Alcalase thủy phân phụ phẩm cá Tra
ii
Thí nghiệm 3: Xác định thời gian thủy phân protein cá Tra tối ưu nhất.
Thí nghiệm 4: Ổn định dung dịch thủy phân bằng Natribenzoat
Nội dung 2: Phối chế dung dịch thuỷ phân thành phân bón lá để dùng cho rau ăn lá và
rau ăn quả
Nội dung 3: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá từ cá Tra cho một số loại rau trong
nhà màng, ngoài đồng ruộng và công nhận phân bón mới.
Thí nghiệm 1: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng trong
điều kiện nhà màng.
Thí nghiệm 2: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho dưa leo trồng trong điều
kiện nhà màng.
Thí nghiệm 3: Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá (chế phẩm 1) cho cải xanh và
rau dền ngoài đồng ruộng
10. Sản phẩm của đề tài:
TT
Tên sản phẩm
Yêu cầu khoa học dự kiến đạt được
(tiêu chuẩn chất lượng)
1 2 3
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cho thấy: Sử dụng enzym Alcalase thủy phân
phụ phẩm cá Tra tối ưu trong điều kiện pH = 8, nhiệt độ 65
0
C và thời gian là 120 phút.
Để bảo quản dịch thủy phân thì bổ sung 0,5% natribenzoat cho hiệu quả cao nhất.
Dịch sau khi thủy phân phụ phẩm cá Tra có hàm lượng các chất: 1,2% N; 0,11%
P
2
O
5
; 0,12% K
2
O; 18 ppm Fe; 11 ppm Zn; 3,4 ppm Mn; 1 ppm Cu; 17 ppm Bo.
Từ dịch thủy phân phụ phẩm cá Tra đã phối trộn thành hai chế phẩm phân bón
lá có hàm lượng các chất như sau:
- Chế phẩm 1: dùng cho rau ăn lá: 5,06% N; 1,13% P
2
O
5
; 1,1% K
2
O; 252 ppm
Fe; 209 ppm Zn; 206 ppm Mn; 107 ppm Cu; 110 ppm Bo.
- Chế phẩm 2: dùng cho rau ăn quả: 3,25% N; 2,2% P
2
O
5
; 4,17% K
2
O; 323 ppm
ppm Fe; 11 ppm Zn; 3.4 ppm Mn; 1 ppm Cu; 17 ppm Bo.
From Protein hydrolysate were mixed into two kinds:
- The first kind is used for leaves vegetables: 5.06 % N; 1.13 % P
2
O
5
; 1.1 %
K
2
O; 252 ppm Fe; 209 ppm Zn; 206 ppm Mn; 107 ppm Cu; 110 ppm Bo .
- The second kind is used for fruits vegetables: 3.25 % N; 2.2 % P
2
O
5
; 4.17 %
K
2
O; 323 ppm Fe; 109 ppm Cu; 214 ppm Zn; 317 ppm Mn; 536 ppm Bo. Two kinds
contained high amino acid (3.19%).
When the first kind tested with a concentration of 0.5 % (5 ml / liter) brought on
the highest efficiency on B. juncea and the second one with a concentration of 0,5 % (5
ml / liter) have the highest efficiency on C. sativus in the greenhouse.
The first kind used with concentration of 1% (10 ml / liter) for B. juncea and
Amaranthus mangostanus got the highest productivity and economic efficiency in the field.
v
2.2. Nội dung nghiên cứu 25
2.3. Phương pháp nghiên cứu 25
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Hoàn thiện quy trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzym 37
3.1.1. Khảo nghiệm hiệu quả thủy phân protein của một số enzym 37
3.1.2. Xác định hoạt độ enzym Alcalase đến khả năng thủy phân protein cá Tra 38
3.1.3. Xác định thời gian thủy phân protein phụ phẩm cá Tra bằng enzym Alcalase 39
3.1.4. Ổn định dung dịch thủy phân 39
3.2. Phối chế dung dịch thuỷ phân thành phân bón lá để dùng cho rau 42
3.3. Khảo nghiệm 2 chế phẩm phân bón từ dịch thủy phân cá Tra cho một số loại rau
trong nhà màng 48
3.3.1. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng trong nhà màng 48
3.3.2. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho dưa leo trồng trong nhà màng 51
3.3.3. Khảo nghiệm phân sinh học cá trên rau cải trồng ngoài đồng ruộng 54
3.3.4. Khảo nghiệm phân sinh học cá trên rau dền trồng ngoài đồng ruộng 55
3.3.5. Hiệu quả kinh tế khi sử dụng phân sinh học cá 56
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58
4.1. Kết luận 58
4.2. Đề nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2.1 Hoạt tính enzym tiến hành thí nghiệm 25
2.2
Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong phân sinh học
cá
33
2.3
Kết quả phân tích kim loại nặng và vi sinh vật hại trong phân
sinh học cá
34
3.1 Hiệu quả thủy phân protein phụ phẩm cá của một số enzym 37
3.2
Ảnh hưởng của hoạt độ enzym Alcalase đến quá trình thủy phân
protein cá
38
3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein cá Tra 39
3.4 Ổn định dịch thủy phân bằng natribenzoat 40
3.5 Hàm lượng các chất trong dịch thủy phân trước phối trộn 42
3.6 Hàm lượng hóa chất phối trộn trong dịch thủy phân 42
3.7 Hàm lượng các chất trong dịch thủy phân sau khi phối trộn 43
3.8 Hàm lượng các axit amin trong chế phẩm phân bón lá 44
ix
3.9 Chi phí sản xuất chế phẩm 1 từ dịch thủy phân cá Tra 45
3.10
Chi phí sản xuất chế phẩm 2 từ dịch thủy phân cá Tra 46
3.11
Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến chiều cao cây rau cải 47
3.12
3.19
Ảnh hưởng của phân sinh học cá đến năng suất rau dền 54
3.20
Hiệu quả kinh tế của rau cải 55
3.21
Hiệu quả kinh tế của rau dền 56
x
DANH SÁCH HÌNH
SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG
2.1. Phụ phẩm cá Tra sau khi xay nhuyễn 26
3.1. Phân sinh học cá 47
3.2 Rau cải sau trồng 10 và 14 ngày 48
3.3 Rau cải giai đoạn thu hoạch 50
3.4 Năng suất lí thuyết và năng suất thực thu dưa leo 53
thể thiếu được trong bữa ăn hàng ngày. Theo Hiệp hội rau quả Việt Nam, kim ngạch
xuất khẩu rau hoa quả năm 2012 đạt 829 triệu USD, tăng 33,1% so với năm 2011. Như
vậy, có thể thấy vị trí quan trọng của cây rau trong đời sống và đối với nền kinh tế. Tuy
nhiên, năng suất rau của nước ta còn thấp, chỉ bằng 87% so với trung bình của thế giới.
Chất lượng rau chưa đảm bảo tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề bức
xúc của xã hội. Sản xuất rau an toàn hiện nay đang là vấn đề được hầu hết các địa
phương quan tâm. Các tỉnh đều đã xây dựng chương trình sản xuất rau an toàn. Tuy
2
nhiên, tình hình ngộ độc thức ăn do rau gây ra vẫn thường xuyên xảy ra và là mối lo ngại
cho người tiêu dùng.
Một trong những hướng đi quan trọng để giải quyết vấn đề trên là sản xuất rau
trong nhà màng, sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc hữu cơ hướng tới việc tạo ra
những sản phẩm an toàn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường. Trồng cây
không sử dụng đất là kiểu canh tác tiên tiến và phổ biến trong điều kiện nhà màng cho
phép nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc ứng dụng các phụ phẩm của
ngành chế biến thủy sản để sản xuất phân bón lá phục vụ cho sản xuất nông nghiệp là
việc làm cần thiết hiện nay. Nó vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường do nguồn phụ
phẩm thủy sản gây ra vừa góp phần thúc đẩy trồng trọt phát triển tạo ra sản phẩm an
toàn cho người sử dụng. Điều này là hoàn toàn phù hợp với định hướng hiện nay, đó là
ưu tiên phát triển nền nông nghiệp theo hướng hữu cơ nhằm tạo ra những sản phẩm
sạch cho thị trường.
Xuất phát từ những thực tế đó, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng
dung dịch thủy phân từ phụ phẩm cá bằng enzym làm phân bón cho một số loại rau
trong nhà màng” là cần thiết.
2
ngoài ra còn có CaCO
3
, Ca(OH)
2
,…
Thành phần hóa học của bong bóng cá: chủ yếu là collagen, dùng để nấu keo
hoặc phơi khô làm dược phẩm (Viện Cisdoma, 2005).
4
Theo Trương Công Phát, thành phần các chất trong cá Tra gồm:
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng trong cá tra (trên trọng lượng khô)
Chỉ tiêu Kết quả
Protein thô (%) 46
N (%) 7,36
Đạm amin (%) 0,56
K
2
O (%) 1,07
P
2
O
5
(%) 6,33
khác nhau. Đối với cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE
(Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy phân của bromelin yếu hơn papain.
* Giới thiệu enzym papain
Papain là một endoprotease có trong nhựa cây đu đủ (Carica papaya L.) chứa
16,1% N và 1,2% S. Theo kết quả phân tích bằng tia X thì phân tử Papain là một chuỗi
polypeptide gồm 212 amino acid, trọng lượng phân tử là 23.350 Da, phân tử là một
mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo
thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học,
chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.
- Cấu trúc không gian
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị
gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của
khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159
nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng
pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là
casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp
là 50 – 57
0
vậy ta sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng
thái hoạt động. do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là
các chất có tính khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là
chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi
và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn
7
hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn
EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Bất hoạt:
Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O
2
, O
3
,
H
2
O
2
, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với
nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. Các ion
kim loại như Cd
+
, Cu
2+
, Zn
2+
, Hg
2+
Đây là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao, ở dạng nhựa khô papain không
bị biến tính ở 100
0
C trong 3 giờ. Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút
ở 82,5
0
C. Nên lấy nhựa ở những quả còn xanh, khoảng 10 tuần tuổi là tốt nhất và lấy
vào lúc sáng sớm. Dùng dao inox rạch vài đường dọc theo quả, hứng nhựa cho vào lọ
thủy tinh có nắp kín, giữ trong tối và bảo quản ở 4
0
C (Monti và cộng sự, 2000).
* Giới thiệu enzym Bromelin
- Đặc điểm enzym Bromelin
Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chưa nhóm sulfhydryl, có
khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa.
Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và
hoạt động tốt ở pH từ 6 – 8. Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương
tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây họ Sung.
và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và
trong y học. Có thể thu nhận protease từ nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc. Hiện
nay trên thế giới sản xuất khoảng trên 600 tấn protease tinh khiết từ vi sinh vật, trong
10
đó có 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Nhịp độ sản xuất enzym vi sinh vật ở
qui mô công nghiệp ở các nước phát triển tăng trung bình hàng năm từ 5% - 15% và
doanh thu sản xuất hàng năm ở các nước này khoảng 1,5 tỉ USD. Những nước có công
nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến nhất trên thế giới hiện nay là: Nhật Bản,
Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung quốc, Đan Mạch, Đức, Áo…Các nước này đầu tư thích
đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các chế phẩm protease của vi sinh
vật. Nguồn nguyên liệu rất dồi dào để sản xuất enzym nói chung và protease nói riêng.
Người ta sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu
giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da …. Dùng protease để thủy phân protein thường ít bị
hao hụt acidamin như khi dùng phương pháp hóa học. Thủy phân protein bằng acid
thường mất 10-25% các acidamin như tryptophan, tyrosin, cystein, arginin, histidin,
serin, treonin. Vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại enzym endopeptidase và
exopeptidase, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả
năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Các chủng vi khuẩn có
khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus
thermorpoteoliticus và một số loài thuộc Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng
tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động
thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt
động ở khoảng pH hẹp (pH 5 - 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính
tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá
trị dinh dưỡng. Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng Aspergillus oryzae, A. terricola,
A. fumigatus, A. satoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng
tổng hợp cả ba loại protease acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc có bào tử đen tổng hợp
chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 - 3.
phân phụ phẩm cá thì kết quả cho thấy: sử dụng Alcalase tạo ra lượng protein nhiều
hơn (82,66%) so với 73,5% khi dùng Flavourzyme. Bên cạnh đó thì độ tan, độ tạo bọt
của sản phẩm thủy phân khi dùng Alcalase cũng tốt hơn khi dùng Flavourzyme.
1.2.2. Nghiên cứu trong nước
Theo Nguyễn Thị Nếp (2005), tỷ lệ enzym protease từ B. subtilis S5 sử dụng để
thủy phân với cơ chất là phụ phẩm đầu xương cá tra đạt hiệu quả cao là 2,5 ÷ 3 %,
nhiệt độ thủy phân thích hợp là 50
0
C, pH = 8,0 và trong thời gian là 10 giờ, hiệu suất
thủy phân cao nhất là 25,68 %.
Theo Đặng Thị Mộng Quyên (2006) và Trần Thị Xô (2006), để thủy phân cá
phèn, cá ngân dạng cá phế liệu thu được sau công đoạn fillet bằng phương pháp thủy
phân kết hợp, thủy phân bằng enzym trước, thủy phân bằng acid sau. Trong đó, sử
dụng chế phẩm enzym protease từ vi khuẩn B. subtilis C
10
. Kết quả với điều kiện thủy
phân bằng enzym: tỷ lệ muối 3%, tỷ lệ dịch chiết enzym 20 % (dạng lỏng), tỷ lệ nước
12
30 %, nhiệt độ 50
0
C, điều kiện thủy phân bằng acid: tỷ lệ muối 3 %, nhiệt độ thủy
phân 90
0
C, thể tích HCl 7N là 20 %, trung hòa bằng Na
2
CO
3
20 % cho hiệu quả thủy
phân cao. Dịch đạm thu được có hàm lượng đạm tổng số 39 g/l, đạm amin 21,6 g/l,
vùng xa xôi có thể áp dụng dễ dàng. Việc có thêm các chế phẩm sinh học mới có giá thành
rẻ góp phần làm cho ngành chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và trồng trọt phát triển tốt hơn.
Hiện nay, để xử lý các loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt thì có các
chế phẩm như BIMA (Trichoderma), Active cleaner (xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm
Trichoderma sp., vi khuẩn Bacillus sp.) được sử dụng để ủ phân gia súc, chất thải hũu
cơ như rơm, rạ, rác thải sinh hoạt hữu cơ (đã tách riêng rác vô cơ). Việc sử dụng chế
phẩm có thể giúp rút ngắn thời gian ủ hoai phân chuồng, phân xanh, rác từ 2 - 3 lần so
với cách ủ thông thường.
Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo 4 loại phân bón:
Bio trùn quế 01; Bio trùn quế 02; Bio trùn quế 03 và Bio trùn quế 04 có thành phần chủ
yếu là dịch chiết từ trùn quế tươi với hàm lượng axit amin cao (Aspartic acid – 2.000
ppm; Leucine – 1.200 ppm; Alanine – 1.000 ppm; Glutamic acid – 1.000 ppm; Valine
– 800 ppm). Ngoài ra còn chứa một số nguyên tố đa lượng và vi lượng cần thiết. Đa
lượng: N – 5.0 %; P – 1.0 %; K – 3.0 %. Vi lượng: B – 200 ppm; Zn – 200 ppm; Mg –
120 ppm; Ca – 120 ppm; Fe – 100 ppm. Chúng có tác dụng kích thích tăng trưởng, ra
hoa và tăng tỷ lệ đậu trái.
Nguyễn Xuân Trình (2008), khi nghiên cứu công nghệ sản xuất bột cá, dịch đạm
từ phụ phẩm cá Da trơn và cá Basa. Kết quả cho thấy các tác giả đã xác định được 180
phút là thời gian thủy phân để lượng protein hòa tan và acid amin tạo thành đạt cao
nhất. Tỷ lệ enzym trên cơ chất cũng có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu suất thủy phân,
tỷ lệ enzym : cơ chất 0,2% ở nhiệt độ 60
0
C và pH = 5 cho hiệu quả thủy phân cao nhất.
Khi so sánh hoạt tính giữa enzym dịch dứa, enzym tủa từ dịch dứa và enzym Alcalase
(là enzym thủy phân có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus lischenifermic), kết quả cho
thấy mẫu thủy phân bằng Alcalase có hàm lượng protein hòa tan và acid amin cao nhất,
kế đến là enzym dịch dứa, mẫu có enzym tủa có hàm lượng protein và acid amin thấp
nhất có thể là do hoạt tính enzym bị mất đi trong quá trình tủa.
Trần Thanh Nhãn (2009), khi sử dụng alcalase để sản xuất Gelatin từ da cá basa
S, NH
3
, CO
2
, ….(Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng,1990).
1.3.1. Các hệ enzym tham gia phân giải
Hệ enzym Metalo-protease còn gọi là aminopeptidase hay apase tồn tại nhiều
trong nội tạng cá, chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu đã hoạt động rất mạnh,
sau tháng thứ hai thì giảm dần cho tới tháng thứ ba, sau đó tác dụng kém dần đến cuối
quá trình. Apase có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại
peptid, loại này đại diện cho nhóm enzym thủy phân trung tính, môi trường tối thích
khoảng pH = 5,0 ÷ 7,0.
Enzym
Enzym
Copyright: Tài liệu đại học ©