TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
*
LÊ VƢƠNG CẢNH PHÂN LẬP VI KHUẨN CLOSTRIDIUM SPP.
TRÊN VỊT CÓ TRIỆU CHỨNG LIỆT CHÂN,
LIỆT CÁNH, LIỆT CỔ, TIÊU CHẢY TẠI
MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU
LONG VÀ KIỂM TRA TÍNH NHẠY CẢM
CỦA VI KHUẨN VỚI MỘT SỐ LOẠI
KHÁNG SINH Luận văn tốt nghiệp
Ngành Thú Y Cần Thơ, 11/2014
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
*
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
TRANG DUYỆT
Đề tài: “Phân lập vi khuẩn Clostridium spp. trên vịt có triệu chứng liệt chân,
liệt cánh, liệt cổ, tiêu chảy tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và
kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh”.
Do sinh viên: Lê Vƣơng Cảnh, mã số sinh viên: 3102932, thực hiện tại phòng Vi
Trùng và Miễn Dịch của bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng
Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 07/2014 đến 11/2014.
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 20… Cần Thơ, ngày… tháng… năm 20…
Duyệt của Bộ môn Duyệt của Cán bộ hƣớng dẫn
ThS. Nguyễn Thu Tâm
Cần Thơ, ngày…… tháng… năm 20….
Duyệt của Khoa Nông Nghiệp & SHƢD
rằng: bên cạnh tôi luôn có gia đình, thầy cô, bạn bè và tất cả mọi ngƣời sẵn sàng
giúp đỡ và động viên tôi để tôi có thể vƣợt qua tất cả. Đến giây phút này đây, tôi
đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp và kết thúc khóa học chuyên ngành Thú Y của
mình, thật hạnh phúc và vô cùng sung sƣớng. Tôi không biết nói gì hơn ngoài
việc bày tỏ lòng biết ơn của mình đến những ngƣời đã bên tôi, quan tâm, chăm
sóc, giúp đỡ, động viên, luôn đặt niềm tin và hy vọng vào tôi trong suốt khoảng
thời gian vừa qua.
Đầu tiên, con xin kính gửi lòng biết ơn đến với bà kính yêu và cha mẹ.
Công ơn dƣỡng dục, sinh thành, dạy bảo con, luôn đặt niềm tin và hy vọng vào
con. Mọi ngƣời đã lao động miệt mài để tạo mọi điều kiện cho con ăn - học thành
tài, đó luôn là nguồn động lực, động viên lớn nhất để con sống và học tập đến
hôm nay.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Lê Hoàng Sĩ, thầy là cố vấn học
tập của tôi, ngƣời luôn quan tâm, hƣớng dẫn và chỉ bảo tôi trong 5 năm học đại
học. Cô Nguyễn Thu Tâm, ngƣời đã luôn giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi tìm
tòi, học hỏi và nghiên cứu trong khoảng thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp của
mình, em vô cùng biết ơn và cám ơn Cô.
Tôi xin gửi đến quý thầy cô Bộ môn Thú Y, thầy cô Khoa Nông Nghiệp và
Sinh học Ứng Dụng nói riêng cùng toàn thể thầy cô, ban giám hiệu trƣờng Đại
Học Cần Thơ nói chung lời cám ơn tha thiết nhất. Quý thầy cô đã tận tình giảng
dạy, truyền đạt kiến thức quý báo cũng nhƣ tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và
phát triển trên giảng đƣờng đại học.
Cám ơn các bạn lớp Thú Y khóa 36 đã đồng hành cùng tôi trong khoảng
thời gian 5 năm này, cùng tất cả những ngƣời bạn của tôi đã luôn bên cạnh - sát
vai cùng tôi học tập và khôn lớn.
Xin cám ơn quý công ty Vemedim đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và
nghiên cứu. Cám ơn các anh, chị phòng vi sinh đã luôn hƣớng dẫn - giúp đỡ tôi.
Bên cạnh đó là lời cám ơn đến các cán bộ Thú y và các chủ hộ chăn nuôi tại
An Giang và một số Tỉnh Khác đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình lấy mẫu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến quý thầy cô trong Hội
2.2.6 Khả năng gây bệnh trên ngƣời và động vật của vi khuẩn
Clostridium spp. 16
2.3 Đặc điểm sinh học của vịt 18
2.3.1 Nguồn gốc, đặc điểm thích nghi của vịt 18
2.3.2 Đặc điểm tiêu hóa, hấp thu thức ăn của vịt 18
Chƣơng 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
3.1 Nội dung nghiên cứu 21
3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 21
3.2.1 Thời gian, đối tƣợng và địa điểm 21
3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị 21
3.2.3 Hóa chất và môi trƣờng 21
3.3 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 22
3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 22
3.3.2 Phƣơng pháp nuôi cấy phân lập 23
3.3.3 Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Clostridium spp. 25
v
3.3.4 Phƣơng pháp kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn Clostridium
spp. phân lập đƣợc với kháng sinh 26
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1 Tổng quang về địa điểm lấy mẫu 28
4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Clostridium spp 30
4.2.1 Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. 30
4.2.2 Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm các chủng vi khuẩn Clostridium 31
4.2.3 Tỷ lệ vịt bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium spp. theo địa điểm 34
4.3 Kết quả kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh 37
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
5.1 Kết Luận 41
Hình 1: Quy trình giòi phân hủy xác của bệnh ngộ độc thịt gia cầm 6
Hình 2: Sơ đồ vai trò C. botulinum trong một hệ sinh thái nƣớc ngọt 7
Hình 3: Thu thập các mẫu vịt bị bệnh “cúm cần” 22
Hình 4: Mẫu ruột đƣợc bảo quản túi nilong và đuổi khí oxy 23
Hình 5: Mẫu ruột đƣợc chuẩn bị nuôi cấy phân lập 23
Hình 6: Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị để phân lập vi khuẩn 23
Hình 7: Tủ ấm CO
2
để nuôi cấy các vi khuẩn yếm khí 23
Hình 8: Khuẩn lạc vi khuẩn dung huyết trên thạc máu 24
Hình 9: Khuẩn lạc vi khuẩn trên thạch máu 24
Hình 10: Môi trƣờng CMM để giữ giống vi khuẩn 24
Hình 11: Vi khuẩn Clostridium spp. dƣới kính hiển vi quang học
ở vật kính 100 25
Hình 12: Bào tử vi khuẩn đƣợc xem dƣới kính hiểm vi quang học
ở vật kính 100 25
Hình 13: Vi khuẩn Clostridium spp. sinh catalates 25
Hình 14:
Kết quả sinh hóa trong bộ kit API 20A
26
Hình 15: Địa điểm lấy mẫu tại một số tỉnh ĐBSCL 28
Hình 16: Kết quả phân lập các chủng Clostridium bằng phản ứng sinh hóa 32
Hình 17: Tỷ lệ mẫu ruột vịt bệnh nhiễm các chủng vi khuẩn Clostridium theo
địa điểm lấy mẫu 35
Hình 18: Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Clostridium spp. với một số
loại kháng sinh 37
Hình 19: Kết quả kháng sinh đồ của vi khuẩn Clostridium spp. phân lập đƣợc 38
viii
(1/46).
1
Chƣơng 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chăn nuôi vịt chạy đồng là hình thức chăn nuôi chính và có truyền thống
lâu đời của ngƣời dân ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Đây là hoạt động chăn
nuôi rất có ý nghĩa trong nông nghiệp và chiếm một vị trí quan trọng trong chăn
nuôi nhƣ: tận dụng đƣợc nguồn lúa rơi vãi sau khi thu hoạch, tiêu diệt các sinh
vật có hại, cải thiện môi trƣờng và cung cấp nguồn thức ăn phong phú cho vịt.
Tuy nhiên, hình thức chăn nuôi này còn chứa nhiều rủi ro do dịch bệnh và
mầm bệnh nguy hiểm. Đƣợc sự quan tâm của nhà nƣớc, quản lý của cán bộ thú y
về tiêm phòng - quản lý dịch bệnh, cùng với kiến thức - kinh nghiệm của hộ chăn
nuôi mà tình hình dịch bệnh đã đƣợc kiểm soát. Nhƣng hiện nay vẫn còn tồn tại
một số bệnh gây thiệt hại lớn cho hộ chăn nuôi nhƣ bệnh “cúm cần”, đƣợc ngƣời
dân thƣờng gọi khi vịt bệnh có các triệu chứng: liệt chân, liệt cánh, liệt cổ (Locke
và Friend, 1989; Rocke và Friend, 1998; Nguyễn Đức Hiền, 2012). Khi bệnh
đƣợc phát hiện, tiến hành điều trị bằng nhiều loại kháng sinh nhƣng không mang
lại hiệu quả.
Bệnh trên là do vi khuẩn Clostridium spp. gây nên, với tác nhân chính là vi
khuẩn C. botulinum sản sinh ra độc tố botulin (Rocke, 2005; Nguyễn Đức Hiền
và Phạm Mạnh Hùng, 2012). Hiện tại, trên thế giới đã ghi nhận nhiều công trình
nghiên cứu về bệnh và trên nhiều đối tƣớng; Riêng tại Việt Nam, các công trình
nghiên cứu còn khiêm tốn, dựa trên nghiên cứu của Nguyễn Đức Hiền (2012) đã
mở ra nhiều hƣớng nghiên cứu mới về vấn đề này.
Từ những vấn đề trên, giúp tôi có định hƣớng và tiến hành nghiên cứu về vi
khuẩn Clostridium spp. trong đề tài “Phân lập vi khuẩn Clostridium spp. trên
vịt có biểu hiện liệt chân, liệt cánh, liệt cổ, tiêu chảy tại một số tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long và kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn với một số loại
khuẩn C. perfringens.
Tiếp theo, vào năm 2009, tại Hà Nội và các vùng phụ cận, Huỳnh Thị Mỹ
Lệ và ctv đã nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens và kết luận: tần suất phân lập
đƣợc C. perfringens từ phân lợn bị tiêu chảy là 55.6%, số lƣợng vi khuẩn tăng
lên rõ rệt từ 110,34-145,49 lần giữa lợn bị tiêu chảy so với lợn ở trạng thái khỏe
mạnh. Tiếp tục đi vào nghiên cứu chuyên sâu về vấn đề này, đến năm 2012,
Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv công bố kết quả phân lập C. perfringens từ bò bị tiêu
chảy thuộc ba typ với tỷ lệ lần lƣợt là typ A (57,34%), typ D (41,33%) và typ C
(1,33%); trong đó các chủng phân lập đƣợc từ bò khỏe mạnh, lợn khỏe mạnh và
lợn bị tiêu chảy đều thuộc typ A.
Năm 2011, đã có ba công trình nghiên cứu khoa học đƣợc công bố:
Lê Văn Sơn và ctv đã xác định 2 gen độc tố (toxinotype) của C. perfringens
phân lập từ dê, cừu ở duyên hải Nam Trug Bộ bằng phƣơng pháp multiplex PCR
với tần số 76,28% typ A và 23,72% typ D. Bên cạnh đó còn xác định kiểu gen
liên quan đến 2 loại độc tố này.
Riêng Lê Văn Sơn cũng đã hoàn thành luận án Tiến Sĩ và có những đóng
góp riêng của mình trong luận án: “Nghiên cứu một số đặc tính của Clostridium
perfringens gây viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu tại một số tỉnh Nam Trung bộ và
3
biện pháp phòng trị”. Kết quả bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu tại một số tỉnh
Nam Trung bộ là do vi khuẩn C. perfringens thuộc hai typ: A (76,28%) và D
(23,72%). Đặc biệt, typ D ở gia súc bệnh cao hơn so với gia súc khỏe.
Cũng trong thời gian đó, Trần Đức Hạnh và ctv củng đã công bố kết quả
nghiên cứu về vi khuẩn C. perfringens tại tỉnh phía Bắc với nhiều nội dung: tỷ lệ
phân lập vi khuẩn C. perfringens ở lợn tiêu chảy là 59,82% và ở lợn con bình
thƣờng là 26,78%; thử nghiệm độc lực trên chuột ghi nhận 100% chuột chết
trong khoảng thời gian từ 24-48 giờ; và kết quả kiểm tra kháng sinh.
Đến năm 2012, đã có thêm hai công trình nghiên cứu đƣợc đăng tải trong
tim (15%) và phổi
(10%).
Và nghiên cứu gần đây nhất đƣợc ghi nhận là của Trần Đức Hạnh (2013),
tiến hành nghiên cứu trên lợn tiêu chảy tại các tỉnh miền núi phía Bắc và biện
pháp phòng trị trong luận án Tiến Sĩ Nông nghiệp. Kết quả nghiên cứu cho thấy
tỷ lệ lợn tiêu chảy nhiễm vi khuẩn C. perfringens lên đến 59,82% (134/224).
Tiếp tục tiến hành chạy PCR để xác định type vi khuẩn thu đƣợc kết quả: trong
45 chủng của vi khuẩn đƣợc định type thì vi khuẩn sinh độc tố type A chiếm
55,56% (25/45), type C chiểm 40% (18/5) và type D chiếm 4,44% (2/45). Còn về
thực hiện phác đồ điều trị cho thấy: phác đồ III là có tỷ lệ khỏi bệnh là cao nhất
với tỷ lệ 87,5 (49/56), so với phác đồ I và II.
4
2.1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Clostridium spp. trên thế giới
Theo kết quả ghi nhận mới nhất của Markey và ctv (2013) về vi khuẩn
Clostridium spp. có hơn 200 loài đƣợc phát hiện, với khoảng 14 loài có khả năng
sinh một hay nhiều loại độc tố. Trong đó, có các loài ảnh hƣởng cho ngƣời và
động vật đáng chú ý đó là: Clostridium botulinum, Clostridium perfringen,
Clostridium difficile, Clostridium colinum.
Một số nghiên cứu và ghi nhận về sự ảnh hưởng của Clostridium botulinum
trên gia súc, gia cầm
Trên thế giới, các công trình nghiên cứu khoa học về vi khuẩn C. botulinum
rất đa dạng và phong phú. Qua nghiên cứu tài liệu, độc tố của vi khuẩn không chỉ
ảnh hƣởng nguy hiểm đến sức khỏe của con ngƣời mà còn nguy hại đến các loài
động vật khác, đặc biệt là các loài động vật quý hiếm khác đã đƣợc liệt kê vào
“Sách Đỏ”, đƣợc bảo vệ trong các khu bảo tồn của thế giới. Sau đây là một số ghi
nhận và các nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum.
Ở ngƣời đƣợc ghi nhận ở Trung Quốc: vào những năm 1989, tại 15 tỉnh,
gây ra cái chết của khoảng 20.000 con chim từ hơn 50 loài, bao gồm cả vịt đầu
trắng (Oxyura leucoceophala ) nguy cơ tuyệt chủng trên toàn cầu. Các nghiên
cứu cho thấy có một mối liên kết quan trọng giữa số lƣợng chim chết đƣợc ghi
trong mỗi dịch bệnh ngộ độc và nhiệt độ trung bình vào tháng bảy (luôn >26
0
C).
Kết quả đƣợc ghi nhận ở 75 mẫu ruột của loài chim đã chết đƣợc tìm thấy trong
vụ ngộ độc đã đƣợc phân tích, với sự hiện diện của vi khuẩn C. botulinum là
38,7% (
Vidal
và ctv,
2013)
.
Ngày 08/08/2011, ở Miền Bắc nƣớc Ý đã bùng phát vụ ngộ độc ở các loài
chim hoang dã và các động vật khác tại bờ suối Crostolo, ở vùng Emilia
Romagna, Ý. Nhóm đã tiến hành ghi nhận 20/28 mẫu dạ dày của vịt trời chết có
giòi (ấu trùng ruồi xanh giai đoạn 3). Nhóm tiến hành nghiên cứu và xác định:
nguyên nhân gây chết là do độc tố C. botulinum type C gây ra, độc tố đƣợc xác
định bằng một thử nghiệm trên chuột và khẳng định: độc tố trong huyết thanh và
ở ấu trùng ruồi xanh trong dạ dày của vịt chết (Defilippo và ctv, 2013).
Những nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum trong môi trƣờng
Trong những năm 1975-1976, ở nhiều vùng của Vƣơng quốc Anh và
Ireland đã tiến hành nghiên cứu về vi khuẩn C. botulinum. Mẫu đất đƣợc lấy từ
các ao, hồ, đầm lầy, bãi bùn, suối, sông ngòi, kênh rạch và mẫu tại nơi cƣ trú và
khu bảo tồn của các loài chim. Tỷ lệ vi khuẩn C. botulinum hiện diện trong các
mẫu đất thu thập đƣợc là 35,0% (194/554), trong đó cao nhất là type B (30,1%),
tiếp theo là type C (3,4%), type E (2,7%) và thấp nhất là type D (1.1%). Với tỷ lệ
nhiễmm ghép hơn một type là 2,3% (
Smith
và ctv
Giòi mang độc tố đƣợc
ăn vào dạ dày
Những xác chết đƣợc thêm vào
sản xuất, hình thành độc tố và
giòi mang độc tố truyền cho
những con chim khác ăn phải
Quá trình chết đi diễn ra nhanh
chóng
7
Và gần đây nhất là một công trình nghiên cứu của Espelund và Klaveness
(2014) về vai trò của C. botulinum trong hệ sinh thái nƣớc ngọt đã tạo ra một
“Vòng sinh thái” khép kín. Trong đó, mỗi yếu tố, mỗi vai trò đều đã đƣợc nghiên
cứu và trình bài trong nhiều báo cáo khoa học.
Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Clostridium perfringens
Trong khoảng từ 05/2005 đến 11/2006, Svobodová và ctv (2007) tiến hành
nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens trên gà khỏe mạnh tại 23 trang trại khác nhau
của Cộng Hòa Séc, trong tổng số 609 mẫu thu đƣợc có đến 112 (18,39%) mẫu
dƣơng tính với C. perfringens. Còn tỷ lệ dƣơng tính với C. perfringens đƣợc
phân lập từ manh tràng tại 23 trại là 74%, dao động khoảng 104 cfu/g.
Tại Ai Cập, Osman và ctv (2012) tiến hành nghiên cứu phân lập C.
perfringens trên mẫu ruột của gà thịt thƣơng phẩm và gà mái thịt giống bố mẹ. Vi
khuẩn C. perfringens đƣợc phân lập trong ruột cao nhất là ở tá tràng của gà thịt
thƣơng phẩm là 41,7% và gà mái thịt giống bố mẹ là 58,4%, và thấp nhất ở hồi
tràng lần lƣợt là: 15,6% và 27,1%. Và tiếp tục tiến hành chạy multiplex PCR để
kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh đã đƣợc ghi nhận.
Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Clostridium diffcile
Tại Slovenia, để đánh giá sự hiện diện của vi khuẩn C. difficile trong chăn
nuôi gia cầm, Pirš Tina và ctv (2012) đã tiến hành nghiên cứu trên 880 mẫu phân
và môi trƣờng trong 7 trang trại khác nhau. Kết quả kiểm tra cho thấy có đến
21,5% (189/880) mẫu dƣơng tính với vi khuẩn C. difficile, với tỷ lệ nhiễm ở các
trang trại là 85,7% (6/7), riêng trại F là hoàn toàn sạch bệnh.
Một nghiên cứu lớn về sự phân bố của vi khuẩn C. difficile trong môi
trƣờng đã đƣợc tiến hành tại khu vực Cardiff của Nam Wales. Trong tổng số
2.580 mẫu kiểm tra cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn C. difficile chiếm tỷ lệ
7,1% (184/2.580). Sự phân bố của C. difficile trong môi trƣờng rất đa dạng, đáng
chú ý nhất ở các mẫu: phân của các loại động vật chiếm tỷ lệ 2,2% (16/724), mẫu
đất chiếm tỷ lệ 21,0% (22/104) và cao nhất ở các mẫu môi trƣờng nƣớc: nƣớc ở
các sông (87,1%), tại các hồ (46,7%), tại các biển (44,0%). Ngoài ra, một số mẫu
khác củng đã đƣợc kiểm tra và ghi nhận (Salf và Brazier, 1996).
Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Clostridium colinum
Tại Nhật Bản, vào tháng hai và tháng ba năm 1987, đã xảy ra dịch bệnh
viêm loét ruột ở gà ở 5 trại gia cầm của quận Kagoshima, đây là báo cáo đầu tiên
về bệnh xảy ra trên gà ở Nhật Bản, ƣớc tính tỉ lệ chết từ 1-5% trong đàn gà bệnh.
Khi tiến hành mổ khám và nghiên cứu ghi nhận đƣợc các gà thịt đều bị viêm loét
trong ruột, hoại tử ở gan và lách, vi khuẩn C. colinum đƣợc xác định sau đó bằng
các kiểm tra đặc tính sinh hóa và sắc ký khí-lỏng. Bên cạnh đó còn tiến hành
kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh(Kondo và ctv, 1988).
Một nghiên cứu cắt ngang đƣợc tiến hành từ tháng 5 đến tháng 9 năm
2008, nhằm để xác định tỷ lệ nhiễm cấp vi khuẩn C. colinum trong các đàn gà
thịt ở phía Nam và Bắc của Jordan. Trong 170 đàn gà thịt khảo sát, các mẫu
bệnh phẩm ruột đã đƣợc thu thập và kiểm tra bằng PCR, kết quả cho thấy có đến
20 đàn gà trong cả hai khu vực (11,8%, 95% với độ tin cậy: 10-22%) dƣơng tính
với C. colinum. Riêng tỷ lệ nhiễm C. colinum tại khu vực phía Nam là 4,7% và
phía Bắc là 7,1%, kết quả này có ý nghĩa thống kê (χ
nhung, riêng C. perfringens là loài duy nhất không di động.
2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Clostridium spp.
Khi nuôi cấy vi khuẩn Clostridum spp. phải đảm bảo mọi điều kiện về yếm
khí nghiêm ngặc, nhƣng yêu cầu điều kiện yếm khí của các loài cũng có sự khác
nhau: Một số loài yếm khí triệt để và không thể phát triển đƣợc nếu nhƣ có sự
hiện diện của O
2
(C. novyia và C. haemolyticum là loài khắc khe nhất về điều
kiện yếm khí); Một số loài tƣơng đối tùy tiện (C. histolyticum, C. tertium, C.
carnis) có thể phát triển đƣợc trong điều kiện hỗn hợp khí 5% O
2
+ 10% CO
2
+
85% N
2
hoặc thậm chí trong môi trƣờng bình thƣờng. Hầu hết các loài của
Clostridium gây bệnh cho động vật đều chỉ phát triển trong điều kiện yếm khí
tuyệt đối, riêng C. perfringens có thể sinh trƣởng trong điều kiện yếm khí không
triệt để.
Các môi trƣờng thạch đƣợc sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Clostridium spp.
nhƣ: thạch glucose, thạch huyết thanh có glucose, thạch máu glucose, thạch
tryptis soy (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv, 2001). Đây không phải là các môi trƣờng
chuyên biệt để phân lập cho vi khuẩn Clostridium spp., nhƣng vi khuẩn đã đƣợc
nghiên cứu, ghi nhận sự phát triển, các yếu tố nhận dạng khuẩn lạc của vi khuẩn.
Việc bảo quản các đĩa thạch trong điều kiện yếm khí hoặc trƣớc khi cấy vài giờ
để trong điều kiện yếm khí sẽ làm tăng khả năng phân lập vi khuẩn Clostridium
spp. (Public Health England, 2014).
10
Bảng 1: Một số phản ứng sinh hóa của các vi khuẩn Clostridium
Loài Clostridium
Thạch lòng
đỏ trứng gà
Thủy phân Gelain
Tiêu hóa Casein
Sản sinh Indol
Sinh axít
Lecithinase
Lipase
Glucose
Lactose
Sucrose
Maltose
C. tetani
-
-
+
-
V
-
-
-
-
C. botulinum I
-
+
+
+
-
-
.
-
.
C. chauvoei
-
-
+
-
-
+
+
+
+
C. septicum
-
-
+
+
-
+
+
-
+
C. novyi A
+
+
+
-
-
+
-
-
-
C. sordellii
+
-
+
+
+
+
-
-
+
C. colinum
-
-
-
-
-
+
-
+
+
C. perfringens
+
-
+
+
-
2.2.4 Khả năng đề kháng, đặc điểm tồn tại và phân bố của vi khuẩn Clostridium
spp. trong tự nhiên
Khả năng đề kháng và thích nghi trong môi trƣờng tự nhiên của loài
Clostridium là rất tốt. Khi gặp điều kiện thuận lợi vi khuẩn phát triển, sinh sản và
sản xuất ra độc tố gây bệnh. Còn khi gặp bất lợi về: nhiệt độ, ẩm độ, pH hay dinh
dƣỡng thì các loài Clostridium sẽ thay đổi sinh trƣởng bằng cách hình thành một
thể nghỉ bên trong tế bào có dạng hình cầu hay hình bầu dục gọi là nội bào tử
(endospore), nha bào hay gọi chung là bào tử (spore). Bào tử có tính kháng nhiệt,
kháng bức xạ, kháng hóa chất, chịu áp suất thẩm thấu cao và có khả năng tồn tại
lâu trong môi trƣờng. Bào tử đƣợc hình thành từ trong tế bào vi khuẩn qua nhiều
giai đoạn và mỗi tế bào chỉ sinh ra một bào tử. Các tế bào có khả năng hình thành
bào tử gọi là tế bào sinh dƣỡng. Trong tế bào này, nha bào dần dần đƣợc hình
thành đồng thời tế bào sinh dƣỡng cũng bị triệt tiêu, cuối cùng chỉ còn lại nha
bào tự do, khi gặp điều kiện thuận lợi lại tiếp tục phát triển.
Trong tự nhiên vi khuẩn hay bào tử vi khuẩn Clostridium spp. tồn tại đa
dạng và phân bố rộng rãi. Trong hệ tiêu hóa của vật chủ cảm nhiễm (bao gồm cả
ngƣời) là môi trƣờng thuận lợi nhất để vi khuẩn phát triển, một số chủng vi
khuẩn còn đƣợc xem là vi khuẩn thƣờng trực trong đƣờng ruột (nhƣ: C.
perfringens) (Cooper và ctv, 2013). Vi khuẩn trong phân hay từ xác vật chủ chết
phân hủy vào môi trƣờng tự nhiên, từ khu vực nay sang khu vực khác, hệ sinh
thái này sang hệ sinh thái khác (Espelund và Klaveness, 2014).
Nhƣng mỗi loại vi khuẩn Clostridium lại có thể tồn tại ở các môi trƣờng, có
các yếu tố truyền lây và vật chủ thích hợp, điều đó sẽ tạo nên sự đặc trƣng của
từng chủng vi khuẩn. Sự hiện diện, phổ biến của từng chủng có ý nghĩa trong thú
y đƣợc ghi nhận trên các mẫu lâm sàng nghiên cứu nhƣ sau:
13
Bảng 2. Sự hiện diện của các Clostridium trong một số loại mẫu
Loài
C. colinum
+
C. difficile
+
C. fallax
+ C. histolyticum
+ C. novji
+
+
+
C. perfringens
+
+
+
hội cho vi khuẩn phát triển và phân bố, trong đất (nƣớc) là môi trƣờng phù hợp
nhất và có sự hiện diện đa dạng các chủng vi khuẩn. Theo Nguyễn Thiện và ctv
(2005) ghi nhận tại các vùng ao, hồ, đầm nƣớc lớn tại nƣớc ta, khả năng khuếch
tán trong đất (nƣớc) của oxy kém và giảm dần theo độ sâu, nhƣng bên cạnh đó,
hàm lƣợng cao của carbon dioxide luôn là điều kiện phát triển tốt nhất của vi
khuẩn. Riêng các loại đất có sự khuếch tán oxy kém trong tự nhiên là đất tại các
đầm lầy, đất phù sa, đất ruộng, đất bị nhiễm chất hữu cơ hoặc các loại kim loại
nặng. Tại các vùng đất ẩm ƣớt thì oxy trong đất thấp vì các khe hở của đất đƣợc
lấp đầy bời nƣớc nên làm cho oxy không thể đi sâu vào lòng đất.
Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ nhiệt độ, pH, các chất vô cơ, các chất hữu cơ
trong quá trình phân hủy xác động vật hay các loại thực vật thủy sinh, các ion:
14
NO
3
-
, NH
4
+
, P
2
O
5
2-
, nồng độ muối trong đất (nƣớc) (Nguyễn Thiện và ctv, 2005)
sẽ ảnh hƣởng đến vi khuẩn trong môi trƣờng.
2.2.5 Khả năng sinh độc tố của vi khuẩn Clostridium spp.
Có hơn 14 loài vi khuẩn Clostridium gây bệnh quan trọng cho ngƣời và
động vật, với khả năng sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố (Markey và ctv,
lƣợng
Type D
Gia súc, cừu (ngựa, ngƣời)
Xác các loài động vật, xƣơng
Type E
Ngƣời, chim, cá
Cá, các sản phẩm từ cá, bùn ở lớp
đáy ao (ao cá nuôi)
Type F
Ngƣời
Thịt (pa-tê gan), cá
Type G
Ngƣời
Đất
(Nguồn: Markey và ctv, 2013)
Độc tố đƣợc hấp thụ ở ruột vào máu đi đến các khớp nối thần kinh cơ ngoại vi
tấn công các protein dung hợp (SNAP-25, syntaxin hoặc synaptobrevin) tại điểm
tiếp hợp thần kinh cơ gây ức chế sản sinh acetylcholine từ đó gây cản trở quá
trình dẫn truyền xung thần kinh gây liệt cơ bắp, trái ngƣợc với tình trạng co cơ
trong các bệnh uốn ván (độc tố của C. botulinum tác động trên thần kinh ngoại vi
Copyright: Tài liệu đại học ©