BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
BỘ MÔN HÓA
 NGUYỄN VŨ LINH KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU
CỦA DANOFLOXACIN, DOXYCYCLINE,
CEFTIOFUR, CEFQUINOME
ĐỐI VỚI MỘT SỐ LOẠI VI KHUẨN
GÂY BỆNH TRÊN GIA SÚC GIA CẦM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên Ngành: HÓA DƯỢC K36

GÂY BỆNH TRÊN GIA SÚC GIA CẦM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên Ngành: HÓA DƯỢC K36
Hướng dẫn khoa hoc
TS. Lê Thanh Phước
ThS. Huỳnh Minh Trí CẦN THƠ − 2013
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

i
NGUYỄN VŨ LINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Năm học 2013-2014

Đề tài: “KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA
DANOFLOXACIN,DOXYCYCLINE, CEFTIOFUR, CEFQUINOME
ĐỐI VỚI MỘT SỐ LOẠI VI KHUẨN GÂY BỆNH
TRÊN GIA SÚC GIA CẦM”

Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
Bộ Môn Hóa Học
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Lê Thanh Phước
Ths. Huỳnh Minh Trí
2. Đề tài: Khảo sát hoạt nồng độ ức chế tối thiểu của Danoflaxacin,
Doxycycline, Ceftiofur, Cefquinome đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh
trên gia súc gia cầm.
3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Vũ Linh MSSV: 2102457
Lớp: Cử nhân Hóa Dược Khóa: 36
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức của LVTN: b. Nhận xét về nội dung của LVTN ( Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:  Những vấn đề còn hạn chế: c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng
nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có): LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

iii
NGUYỄN VŨ LINH


c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng
nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có): LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

v
NGUYỄN VŨ LINH
d. Kết luận, đề nghị và điểm: Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2013
Cán bộ phản biện
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

vi
NGUYỄN VŨ LINH
LỜI CẢM ƠN

Quá trình thực hiện luận văn giúp tôi tích lũy thêm nhiều kinh nghiệm từ
thực tế, làm hoàn thiện kiến thức học được từ giảng đường đại học và hổ trợ
cho công việc sau này. Để được kết quả như ngày hôm nay tôi xin chân thành
gửi lời cảm ơn đến:
Quí thầy cô trong khoa Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là thầy cô trong bộ
môn hóa đã tận tụy truyền thụ kiến thức quí báo cho thế hệ mai sao.
Thầy Lê Thanh Phước đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức, kinh
nghiệm trong học tập và chỉ dẫn cho tôi hoàn thành luận văn này.
Thạc sĩ Huỳnh Minh Trí đã nhiệt tình quan tâm, theo dõi, hướng dẫn, chỉ
bảo và chia sẻ kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm.

nghiệm.
Từ khóa danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome, Klebsiella
spp., E. coli, Staphylococcus spp., Salmonella spp., Pseudomonas spp., MIC,
MBC.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

viii
NGUYỄN VŨ LINH
ABSTRACT
Evaluation of antibiotic-resistant bacteria is a necessary requirement to
be able to see the status of the resistance and the effective of antibiotics. In this
study, we examine the antibiotic-resistant of bacteria with 4 antibiotics:
danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome and compare the effect in
vitro of these antibiotics together.
Through determining the MIC in liquid and the MBC of 4 antibiotics on
81 strains, consist of Staphylococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Klebsiella
spp., Pseudomonas spp. resistance and susceptibility are interpreted with CLSI
breakpoints.
The results showed that antimicrobial resistance is common on bacterial
pathogens of veterinary. E. coli is more sensitive than Staphylococcus spp.,
Salmonella spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp. with cefquinome.
Pseudomonas spp. is more sentitive than Staphylococcus spp., Salmonella
spp., Klebsiella spp., E. coli with cefquinome and danofloxacin.
Mutildrug-resistant bacteria is strong with 2-4 antibiotics (>80%).
Mutildrug-resistance of Gram negative bacteria is common with 2-3
antibiotics. Mutildrug-resistant of Gram positive bacteria is common with 3-4
antibiotics. Cefquinome is able to inhibit and bactericidal better than the rest
of the test by results of MIC and MBC.
Keyword: Danofloxacin, doxycycline, ceftiofur, cefquinome, Klebsiella

kháng kháng sinh của vi khuẩn 10
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

x
NGUYỄN VŨ LINH
2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC
methods). 10
2.3.2 Phương pháp đo vòng vô khuẩn (Disk-diffusion method) 12
2.4 Một số vi khuẩn gây bệnh trên người, vật nuôi điển hình và các
kháng sinh trong thử nghiệm 13
2.4.1 Một số vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi 13
2.4.2 Kháng sinh 20
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 24
3.1 Phương tiện nghiên cứu 24
3.1.1 Hóa chất 24
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ 24
3.1.3 Vi khuẩn 26
3.2 Địa điểm tiến hành 26
3.3 Phương pháp nghiên cứu 26
3.3.1 Phương pháp pha huyền dịch vi khuẩn. 26
3.3.2 Chuẩn bị môi trường nước thịt 27
3.3.3 Phương pháp pha loãng dãy nồng độ kháng sinh 28
3.3.4 Phương pháp đọc kết quả 29
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
4.1 Kết quả khảo sát MIC 30
4.1.1 Khảo sát giá trị MIC của 4 loại kháng sinh trên vi khuẩn E.
coli tại mật độ 10
6
CFU/ml và 10
5


xii
NGUYỄN VŨ LINH
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Gia tăng đề kháng của Streptococcus pneumoniae
với peniciline tại một số nước Đông Nam Á (1996-2001). 7
Hình 2.2: Gia tăng đề kháng của Streptococcus pneumoniae
với erythromycin tại một số nước Đông Nam Á (2000-2001). 8
Hình 2.3: Thực trạng đề kháng của Streptococcus pneumoniae
tại Việt Nam (2006). 8
Hình 2.4: Phương pháp MIC trong tube. 11
Hình 2.5: Phương pháp pha loãng kháng sinh trong thạch
(môi trường đặc). 12
Hình 2.6: Phương pháp thử nghiệm E-test dùng trong xác định MIC. 13
Hình 2.7: Xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn thông qua
phương pháp khuếch tán qua thạch. 14
Hình 2.8: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử 15
Hình 2.9: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus trên môi trường thạch NA 15
Hình 2.10: Vi khuẩn E. coli dưới kính hiển vi điện tử 16
Hình 2.11: Khuẩn lạc E. coli trên môi trường thạch NA. 16
Hình 2.12: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi điện tử. 17
Hình 2.13: Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trường thạch NA. . 17
Hình 2.14: Vi khuẩn Salmonella typhimurium dưới kính hiển vi điện tử. 18
Hình 2.15: Khuẩn lạc Samonella typhimurium trên môi trường thạch TSA. 19
Hình 2.16: Vi khuẩn Klebsiella spp. dưới kính hiển vi điện tử. 20
Hình 2.17: Khuẩn lạc Klebsiella pneumonia trên môi trường thạch TSA. 20
Hình 2.18: Đặc diểm cấu trúc phân tử ceftiofur. 22
Hình 2.19: Đặc điểm cấu trúc phân tử cefquinome. 23
Hình 3.1: Một số thiết bị dùng trong thử nghiệm MIC. 25

Bảng 4.16: Kết quả MBC tại mật độ vi khuẩn 10
5
CFU/ml. 45
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

xiv
NGUYỄN VŨ LINH
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AMR Antimicrobial Resistance
ANSORP Asian Network for Surveillance of Resistant
Pathogens
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
ESBL Extended Spectrum Beta Lactamase
GRAP Global Antiboitic Resistance Partnership
MIC Minimum Inhibitory Concentration
MBC Minimum Bactericidal Concentration
MDR-TB Multidrug Resistant Tuberculosis
XDR-TR Extensively Drug Resistant Tuberculosis
PABA para-aminobenzoic acid
UNICEF Quĩ nhi đồng quốc tế
WHO World Health Organization

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

1
NGUYỄN VŨ LINH
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Đề kháng kháng sinh không là vấn đề mới, nhưng trước tình hình phát
triển của dịch bệnh như hiện nay thì việc ngăn chặn, khác phục tình trạng đề

đoán của các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng” [4]. Điều này cho thấy đề
kháng kháng sinh rất được quan tâm.
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

2
NGUYỄN VŨ LINH
Nhằm gớp phần nghiên cứu về tình trạng đề kháng kháng sinh đặc biệt là
trong lĩnh vực chăn nuôi, bởi đây không chỉ là ngành kinh tế trọng điểm mà còn
có mối quan hệ trực tiếp tới đời sống và sức khỏe của cộng đồng. Nên đề tài:
"Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của Danoflaxacin, Doxycycline,
Cefquinome, Ceftiofur đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh trên gia súc
gia cầm" được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vemedim -
Công ty Cổ phần SXKD vật tư thuốc thú y Vemedim. Đề tài như một bản
báo cáo nhỏ về tình hình đề kháng của vi khuẩn gây bệnh trên gia súc, gia cầm
giúp cộng đồng có cái nhìn tổng quan về thực trạng đề kháng kháng sinh trên
vật nuôi, gớp phần nâng cao ý thức và trách nghiệm cá nhân trong sử dụng
kháng sinh [5].
1.2 Nội dung thực hiện
Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ tiêu diệt 99% vi
khuẩn (MBC) của 4 loại kháng sinh: Danoflaxacin, doxycycline, ceftiofur,
cefquinome trên 5 loại vi khuẩn thường gây bệnh trên gia súc gia cầm: E. coli,
Salmonella spp., Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp. tại
mật độ vi khuẩn 10
6
UFC/ml.
Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ tiêu diệt 99% vi
khuẩn (MBC) của 4 loại kháng sinh: Danoflaxacin, doxycycline, ceftiofur,
cefquinome trên 5 loại vi khuẩn thường gây bệnh trên gia súc gia cầm: E.coli,
Salmonella spp., Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp. tại
mật độ vi khuẩn 10

Kháng sinh có khả năng tác động trực tiếp lên sự chuyển hóa của vi sinh
vật, bao gồm:
Kháng sinh ức chế lên quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn. Gây
thay đổi áp xuất thẩm thấu của tế bào, tạo điều kiện cho các đại thực bào trong
cơ thể tiêu diệt chúng. Các kháng sinh có cơ chế này gồm: penicillin, bacitracin,
cephalosporin, cycloserine, vancomycin,
Ức chế chức năng của màng tế bào. Một số kháng sinh có thể thể gắn lên
màng tế bào vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng. Ví dụ như amphotericin
B có khả năng gắn vào sterol ở màng tế bào nấm làm thay đổi tính thấm của
màng. Các kháng sinh có cơ chế này gồm: colistin, polymcin, gentamycin,
amphotericin B, colistin, imidazole, nystatin,
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

4
NGUYỄN VŨ LINH
Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. Nhóm aminoglycoside,
tetracycline gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình
dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của
ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin
mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu
phần 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên
của chuỗi polypeptide.
Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic. Nhóm refampin gắn với enzyme
RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin).
Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase (làm cho hai mạch
đơn của DNA không thể duỗi xoắn) làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (p-aminobenzonic acid) có tác dụng
cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm
trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức
chế quá trình tạo acid nucleic.

khuẩn và gắn vào các yếu tố di truyền của vi khuẩn đó nhờ tương đồng nhiễm
sắc thể (crossover).
 Tiếp hợp (conjugation) là quá trình tế bào vi khuẩn cho (donor) tổng
hợp yếu tố giới tính (sex pili) và gắn vào tế bào vi khuẩn nhận (recipient). Từ
cầu nối này, một bản sao (copy) gen kháng thuốc nằm trên plasmid được
chuyển cho vi khuẩn nhận.
Trong quá trình tải nạp, vi khuẩn cần có điểm tiếp nhận phù hợp với phage
trên bề mặt của chúng. Trong tiến trình biến đổi, DNA phải chèn vào bộ gen
nhờ tương đồng về di truyền. Như vậy, với cả hai tiến trình này, vi khuẩn phải
tương đồng về di truyền để sự tái tổ hợp có thể xảy ra. Dạng trao đổi này chỉ có
thể xảy ra ở các loài vi khuẩn có mối liên hệ về di truyền. Trong khi đó, tiến
trình tiếp hợp không có giới hạn này.
Đề kháng với kháng sinh là vấn đề thường gặp đối với vi khuẩn. Sự đề
kháng với kháng sinh vô cùng nguy hiểm vì tạo ra các chủng vi khuẩn kháng
thuốc (lờn thuốc) trong cộng đồng.
2.1.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh
Việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho người và vật nuôi đã
có ý nghĩa to lớn trong điều trị. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh đã đồng thời
tạo nên một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn. Bằng chứng rõ ràng nhất là khi
kiểm tra các chủng vi khuẩn thời kỳ chưa sử dụng kháng sinh, các nhà khoa học
không phát hiện sự đề kháng với kháng sinh cũng như bất kì gen liên quan đến
tình trạng đề kháng thường gặp ở các chủng vi khuẩn đương thời. Áp lực chọn
lọc đề kháng kháng sinh xuất phát từ nhiều nguồn như việc sử dụng kháng sinh
trong phòng và trị bệnh trên người, trên động vật và thực vật, kháng sinh dùng
với mục đích kích thích tăng trọng trong chăn nuôi gia súc.
Sự đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn đã được nghiên cứu và ghi nhận
với các cơ chế sau:
 Sản xuất enzyme làm vô hoạt kháng sinh: Staphylococcus sản xuất
beta-lactamase làm mở vòng beta-lactam làm penicillin G mất tác dụng. Vi
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

hội. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị. Một số
trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các
kháng sinh đang điều trị. Ngoài ra các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng
có khả năng đề kháng kháng sinh là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho
những vi khuẩn gây bệnh khác.
Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 440,000 trường hợp nhiễm lao đa kháng
thuốc (MDR-TB), làm ít nhất 150,000 người chết. Theo thống kê từ WHO, năm
2011 toàn cầu hiện có khoảng 640,000 trường hợp lao đa kháng thuốc (MDR-
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

7
NGUYỄN VŨ LINH
TB), trong đó siêu lao kháng thuốc (XDR-TB) chiếm khoảng 9% tại 64 quốc
gia [6].
Theo thông kê từ UNICEF mới đây cho thấy, Streptococcus pneumoniae
là nguyên nhân gây ra 50% các ca tử vong do viêm phổi ở trẻ trên toàn thế giới
[4]
. Một nghiên cứu khác từ trung tâm nghiên cứu giám sát ANSORP từ 1-2000
đến 6-2001 tại 14 trung tâm của 11 nước trong khu vực Asian cho thấy các
chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae tại một số nước như Việt Nam, Hàn
Quốc, Hồng Kong, và Đài Loan có tỷ lệ đề kháng khá cao với penicillin
(71,4%, 54,8%, 43,2%, 38,6%) và erythromycin (92.1%, 80,6%, 76,8%, 86%)
[7]. Các số liệu từ ANSORP cho thấy một số quốc gia ở khu vực Đông Nam Á
là điểm nóng về kháng thuốc trên toàn cầu, trong đó có Việt Nam.

Hình 2.1: Gia tăng đề kháng của Streptococcus pneumoniae với peniciline tại
một số nước Đông Nam Á (1996-2001).
(Nguồn Song JH and ANSORP, 2004. Antimicrob Agents Chemother, p 2101.)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC


NGUYỄN VŨ LINH
trong vòng 12 năm, từ 4% lên 97% năm 2005 [5]. Một báo cáo khác cho thấy
hơn 80% các chủng S. typhimurium phân lập được kháng với kháng sinh acid
nalidixic [11]. Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nên các vụ ngộ độc thực
phẩm (chỉ sau E. coli) và bệnh thương hàn.
Đề kháng kháng sinh đang trở nên nghiêm trọng và không còn là vấn đề
riêng của ngành y tế mà là vấn đề chung của toàn xã hội. Việc ngăn chặn đề
kháng kháng sinh phát triển là chính sách phát triển của mỗi quốc gia. Đặc biệt
đối với các nước đang phát triển, đề kháng kháng sinh còn là gánh nặng trong
phát triển kinh tế và gây đe dọa đến an sinh xã hội.
2.2.2 Tình hình sử sụng kháng sinh và đề kháng kháng sinh trong
chăn nuôi
Trong chăn nuôi, nhằm mục đích kích thích tăng trưởng, hoặc phòng bệnh
và điều trị, nên nhiều loại kháng sinh đã được đưa vào sử dụng. Việc tiếp xúc
với dư lượng kháng sinh có trong các sản phẩm từ trứng, thịt, sữa, Và tồn dư
kháng sinh trong phân, nước tiểu, nguồn nước là nguyên nhân làm gia tăng khả
năng đề kháng của vi khuẩn trong môi trường và trên người.
Giám sát cả hai lĩnh vực chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam
cho thấy, tất cả các trang trại chăn nuôi đều sử dụng kháng sinh. Các kháng
sinh được sử dụng là: tylosin (16%), amoxicillin (12%), gentamicin (9%),
enrofloxacin (7%), penicillin (6%), lincomycin (6%), tiamulin (6%), colistin
(5%), streptomycin (5%), norfloxacin (5%), tetracyclin (4%), ampicillin (4%)
và florphenicol (3%) [12].
Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp, tình hình sử dụng kháng sinh trong
chăn nuôi chưa hợp lý, 27% số hộ chăn nuôi lợn thịt, 24% số hộ chăn nuôi lợn
con và 10 % số hộ chăn nuôi gà thịt có sử dụng kháng sinh từ 3-6 hoạt chất
[11].
Theo một cuộc khảo sát cho thấy có 44% chủ hộ tự chọn kháng sinh và
liều theo kinh nghiệm để điều trị, 33% theo sự hướng dẫn của bác sỹ thú y, 17%
theo hướng dẫn của nhà sản xuất, 6% có làm xét nghiệm kháng sinh đồ. Hầu