1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ RUỘT TÔM SÚ
VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
CỦA CAO CHIẾT LÁ CỎ MỰC (ECLIPTA
ALBA H.)



Cán bộ hướng dẫn Tác giả
Ts Đái Thị Xuân Trang Trương Phạm Thảo Quỳnh

3PHẦN KÝ DUYỆT Đề tài: “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn của cao cây cỏ mực (Eclipta alba H.)” do sinh viên Trương Phạm
Thảo Quỳnh thực hiện đã được duyệt thông qua hội đồng phản biện luận văn tốt
nghiệp đại học.


đỡ, chia sẽ nhiều kinh nghiệm trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn
này.
Những người bạn thân thiết đã gắn bó, chia sẽ mọi niềm vui nổi buồn trong
suốt thời gian qua. Trương Phạm Thảo Quỳnh
Xin chân thành cảm ơn !!!
5
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH SÁCH BẢNG ii
DANH SÁCH HÌNH iii
DANH MỤC VIẾT TẮT iv
TÓM LƯỢC v
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về tôm sú 3
2.2. Sơ lược về hệ vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm 4
2.3. Cỏ mực 5
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 8
3.1. Phương tiện nghiên cứu 8
3.2. Phương pháp nghiên cứu 9
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12
4.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú 12
4.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao lá cây cỏ mực 16

Hình 4. Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học khi đã nhuộm Gram 14
Hình 5. Vòng vô khuẩn của cao lá Cỏ Mực lên một số dòng vi khuẩn 15
Hình 6. Biểu đồ thể hiện đường kính vòng vô khuẩn ở các nồng độ cao chiết khác
nhau ở các dòng vi khuẩn khác nhau 17

8
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TCBS Thiosulphate citrate bile-salts sucrose
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
NA nutrition agar

9
TÓM LƯỢC
Mười hai dòng vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú của huyện Trần Văn
Thời, tỉnh Cà Mau trên môi trường thạch TCBS. Các dòng vi khuẩn có dạng tròn
hoặc không đều, bìa nguyên hoặc răng cưa, một số dòng vi khuẩn tạo bao nhày
xung quanh khuẩn lạc, đường kính khuẩn lạc biến thiên từ 0,5 – 4 mm. Tất cả 12
dòng vi khuẩn đều là vi khuẩn Gram âm và có khả năng di động trên môi trường
TCBS bán lỏng. Trong 12 dòng vi khuẩn phân lập được có 10 dòng vi khuẩn bị ức
chế bởi cao chiết lá cây cỏ mực. trong đó, dòng vi khuẩn G2, G3, G4, G7, Y8, và
Y9 bị ức chế bởi cao lá cây cỏ mực ở nồng độ 6 µg/mL, dòng vi khuẩn Y4 bị ức chế
bởi cao từ nồng độ 8 µg/mL, dòng vi khuẩn Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 16
µg/mL, dòng vi khuẩn G1 và Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 32 µg/mL. Hai dòng
vi khuẩn Y2 và Y5 không bị ức chế bởi cao chiết cây cỏ mực ở tất cả các nồng độ
khảo sát. Trong đó, các dòng bị ức chế mạnh nhất bởi cao chiết lá cây cỏ mực
đáng kể đến là dòng vi khuẩn G7 (đường kính vòng vô khuẩn 30,3 mm ở nồng
độ 8 µg/mL), G3 (đường kính vòng vô khuẩn 59,6 mm ở nồng độ 128 µg/mL) và
G4 (đường kính vòng vô khuẩn 57,3 mm ở nồng độ 128 µg/mL).
Từ khóa: Tính kháng khuẩn, vi khuẩn đường ruột tôm, bệnh tôm sú, cây
cỏ mực, Eclipta alba H.

thủy sản được xem là tối ưu do có tính an toàn cho con người, môi trường và không
để lại tồn dư, phù hợp với các quy định về an toàn thực phẩm.

11
Do đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và Khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba H.)” là cần thiết. Đề tài đóng
góp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng thảo dược trong điều trị bệnh trên thủy sản.
Mục tiêu của đề tài là đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn được phân lập từ
ruột tôm sú (Penaeus monodon) bệnh của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba).

12
Chương 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về tôm sú
Khoá phân loại tôm sú:
Ngành Arthoopoda
Lớp Malacostraca
Bộ Decapoda
Họ Penaeidae
Chi Penaeus
Loài Penaeus monodon
Tôm sú có tên tiếng anh phổ biến black tiger shrimp. Tôm sú (Penaeus
monodon) có khả năng sinh trưởng nhanh. Tôm sẽ đạt mức trưởng thành sau
khoảng 4-5 tháng nuôi trồng. Tôm trưởng thành có chiều dài đến 27 cm và trọng
lượng khoảng 250 g/con, đây là trọng lượng lý tưởng cho tôm thương phẩm tiêu thụ
quốc tế [3].
Trong tự nhiên, tôm nước mặn sinh trưởng ở xa bờ. Đến mùa sinh sản, tôm
trưởng thành tiến vào gần bờ để đẻ trứng. Trứng nở ra ấu trùng trải qua 3 thời kì
biến thái Naupilus, Zoea, Mysis. Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các cửa
sông, nơi nước biển và nước sông pha với nhau tạo nên vùng nước lợ có độ mặn

tích cụm so sánh với 26 chủng vi khuẩn chuẩn và chủng tham khảo dựa vào khoảng
cách Euclid-UPGMA. Kết quả so sánh qua 41 chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh
hóa cho thấy các chủng vi khuẩn phát sáng được phân thành ba nhóm chủ yếu cùng
với vi khuẩn chuẩn và vi khuẩn tham khảo. Tuy nhiên chúng chỉ thuộc vào hai loài
vi khuẩn là V. harveyi và V. carchariae. Kết quả kháng sinh đồ 26 trong số 27
chủng nói trên với 6 loại thuốc kháng sinh thông dụng trong nuôi thủy sản cho thấy
100% chủng thử nghiệm kháng với ampicilin, và có khoảng từ (hoặc ít hơn) 15%
kháng với trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracillin, chloramphenicol,
nitrofurantoin và norfloxacin. Phần lớn (77%) các chủng chỉ kháng với một loại
kháng sinh. Số chủng kháng với 2 loại kháng sinh là 15%. Có một chủng kháng 4
loại và một chủng kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm [4].
Nhóm vi khuẩn γ-Proteobacteria là nhóm vi khuẩn thường gặp trong ruột tôm
sú ở các trại nuôi. Hệ vi khuẩn đường ruột tôm sú phong phú và đa dạng ở các trại
nuôi tôm khác nhau. Các nhóm vi khuẩn này bao gồm Vibrio, Photobacterium,
Aeromonas và Propionige-nium (ngành Fusobacteria). Một số nhóm vi khuẩn
thường gặp khác, bao gồm Actinomyces, Anaerobaculum, Halospiru-lina,
Pseudomonas, Mycoplasma và Shewanella [2]. Hai nhóm vi khuẩn là nguyên nhân

14
gây ra nhiều bệnh khác nhau ở tôm bao gồm Leucothrix spp. và một vài loài Vibrio.
Hiện nay có khoảng 28 loài thuộc Vibrio spp. Trong đó, có 4 loài thuộc tác nhân
gây bệnh cho con người gồm V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V.
alginolyticu [5].
Vibrio spp. Được tìm thấy phổ biến ở trong nước biển và ven bờ, trong nước
bể ương tảo, bể ương Artemia, trong bể ươm ấu trùng. Trong bể ương lượng ấu
trùng Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng mặt. Đối với cá, Vibrio
spp. gây bệnh nhiễm khuẩn máu là chủ yếu. Đối với tôm, Vibrio spp. gây bệnh phát
sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin, gây bệnh máu vón cục ở cua, bệnh ấu trùng
nhuyễn thể. Những loài gây bệnh cho động vật thuỷ sản là V. alginolyticus, V.
anguillarum, V. ordalii, V. salmonicida, V. parahaemolyticus, V. harvey, V. vulnificus… V.


Ngành Anthophyta
Lớp Asteridae
Bộ Asterales
Họ Asteraceae
Chi Eclipta
Loài Eclipta alba [11]

Cỏ mực (Eclipta alba) được dùng để điều trị các bệnh như nôn ra máu từ dạ
dày, chảy máu cam, tiểu ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột,
lỵ, trẻ em suy dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da,
ezecma, vết loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra, Cỏ mực còn được dùng
làm thuốc sát trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt,
sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc [11].
Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc
tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt từ cây cỏ mực (Eclipta alba), mỗi ngày 1-3 ống (2 ml).
Có nơi đã sản xuất thành công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu [11]. Đã có
nghiên cứu cho thấy cỏ mực được dùng để điều trị cho bệnh nhân bị viêm âm đạo
do tạp khuẩn, do nấm và do Trichomonas, và được cho có độc tính rất thấp, giới hạn
an toàn rộng, cầm máu tốt, trong vài trường hợp cá biệt, tác dụng này của cỏ mực
thể hiện rõ rệt hơn cả tác dụng của vitamin K (rõ rệt trong các trường hợp suy gan)
Hình 1: Cây cỏ mực (Eclipta alba)
Nguồn: http://benhvathuoc.com/wp-
content/uploads/2012/10/co
-
nho
-
noi.jpg
huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau.
Cây cỏ mực (Eclipta alba) được thu lá tại xã Thới Hưng, huyện Cờ Đỏ,
thành phố Cần Thơ.

18
● Hóa chất
Ethanol 96°, methanol (Merck), dimethyl sulfoxide (Merck), natri clorua
(China), yeast extract (Himeda, India), chloroform (Merck), peptone (China),
dipotassium phosphate (China), agar (Việt Nam).
Môi trường phân lập vi khuẩn: Thiosulphate citrate bile-salts sucrose (TCBS) [12].
Môi trường dinh dưỡng NA [12].
3.2. Phương pháp
● Thí nghiệm 1: Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn
Phương pháp thu mẫu
Tôm sú (Penaeus monodon) được thu từ các ao nuôi tại ấp Tân Thành, xã
Lợi An, Huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau.
Mẫu tôm được thu nguyên con, còn sống để phân lập vi khuẩn. Tôm được
xác định là bệnh khi có dấu hiệu sau tôm bơi lờ đờ, cập mé, bỏ ăn, thức ăn trong
ruột bị đứt khúc, không liền mạch. Mẫu tôm sau khi được vớt khỏi mặt nước thì tiến
hành giải phẫu lấy bệnh phẩm ngay và chỉ những mẫu bệnh phẩm còn sống mới
được sử dụng để phân lập vi khuẩn.
Phương pháp phân lập vi khuẩn
Tôm bệnh được giải phẫu để lấy phần ruột. Ruột tôm được nghiền trong ống
nghiệm chứa 2 mL dung dịch nước muối 0,9%, sau đó dịch nghiền được trải đều lên
đĩa thạch môi trường TCBS, mẫu được ủ ở nhiệt độ 32°C. Sau 24 giờ, quan sát đặc
điểm khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc tiêu biểu và cấy chuyển sang môi trường
chọn lọc TCBS. Vi khuẩn được phân lập trên môi trường TCBS cho đến khi quan
sát được các khuẩn lạc đồng nhất về hình thái (màu sắc, độ nổi, bìa, kích thước,
hình dạng).
Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương

100 µL dịch nuôi vi khuẩn với mật số 10
6
vi khuẩn/mL được trãi đều trên
mặt thạch môi trường TCBS. Đĩa thạch được để khô 15 phút trước khi đặt khoanh
giấy tẩm cao chiết.
Khoanh giấy (đường kính 6 mm) được cho ngấm cao chiết cây cỏ mực ở các
nồng độ 128, 64, 32,16, 8 µg/mL và mẫu được chuẩn bị tương tự nhưng thay cao
chiết bằng dung môi đã sử dụng rồi để khô sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã trải
vi khuẩn. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần. Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong
30 phút cho cao chiết từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
Mẫu vi khuẩn được ủ ở 32°C trong 24 giờ. Quan sát và ghi nhận đường kính
vùng ức chế (đo bằng thước đo đơn vị mm). Đường kính vùng ức chế bao gồm
đường kính khoanh giấy. Ranh giới vùng ức chế xác định bằng một vùng không có

20
bất kỳ khuẩn lạc nào có thể phát hiện bằng mắt thường, bỏ qua các khuẩn lạc li ti ở
mép mà chỉ có thể phát hiện dưới kính hiển vi.

21
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú
Mười hai dòng vi khuẩn phân lập được từ 30 mẫu ruột tôm sú bệnh trên môi
trường TCBS đều có tế bào dạng hình que (dài hoặc ngắn), di động. Các dòng vi
khuẩn này được kí hiệu như sau: kí hiệu đầu là Y (yellow) hoặc G (green) thể hiện
màu sắc khuẩn lạc trên môi trường TCBS. Chữ số cuối là kí hiệu cho số dòng vi
khuẩn phân lập được.
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
Trên môi trường TCBS, khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn có màu vàng hoặc
màu xanh lá (đậm hoặc nhạt). Màu sắc của khuẩn lạc quyết định màu của môi
trường nuôi cấy. Đối với khuẩn lạc có màu vàng, môi trường trong đĩa nuôi cấy
Y2
G2
Y5
G5 G4
G1
Hình 3: Các dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Y2: khuẩn lạc vàng, tròn không đều, không bóng
G1: khuẩn lạc xanh, tròn, bóng
G2: khuẩn lạc xanh, tròn, không bóng, có bao
Y5: khu
ẩn lạc v
àng, tròn, bóng 23
Trong 12 dòng vi khuẩn đã phân lập được, có 4 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc

8 Y3 Vàng Tròn + Nguyên Nổi 2,2-3
9 Y4 Vàng Tròn + Răng cưa Lài 1,2-1,7
10 Y5 Vàng Không đều + Nguyên Nổi 2-2,5
11 Y6 Vàng Không đều - Răng cưa Lài 3,5-4
12 Y7 Vàng Tròn + Nguyên Nổi 2-2,5
Chú thích: “+“ có tâm, “-” không có tâm.

24

4.2. Khảo sát hoạt tính của cao lá cỏ mực
Trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao lá cỏ mực, dung
môi methanol được dùng để pha loãng cao chiết. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của
dung môi đối với sự phát triển của vi khuẩn là không đáng kể, dung môi không tạo
được vòng vô khuẩn đối với tất cả các dòng vi khuẩn. Như vậy, việc sử dụng
methanol làm dung môi để pha loãng cao chiết là thích hợp. Ở các nồng độ cao
chiết khác nhau, ở những dòng vi khuẩn khác nhau sẽ tạo được vòng vô khuẩn với
kích thước khác nhau.
Bảng 2: Khả năng kháng vi khuẩn đường ruột tôm của cao lá cây Cỏ Mực
khảo sát ở các nồng độ
STT



24,6
c

32
2
G2
15
ab

28
bc

21,6
ab

36,3
cd

40,3
b

 8
3
G3
14,3
b

18,6
de

G5
30,3
a

26,3
ab

37
bc

40
bc

41,3
b

 8
6 Y1
11,6
b

28
bc

32
d

36,3
bcd


0
c

11,3
e

24,3
bc

30,6
d

35
b

16
9
Y4
19
b

25,6
cd

30
bc

33
d



3,3
c

12,6
e

10,3
d

32
12
Y7
23,6
ab

25,3
cd

29,3
d

35,6
bcd

41,3
b

 8
Cácchữ cái theo sau các giá trị trong cùng cột giống nhau thì không khác biệt có ý