TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

VĂN THỊ OANH

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG CỦA
NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN
RƢỢU VANG NHO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

VĂN THỊ OANH

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG CỦA
NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN
RƢỢU VANG NHO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

Hà Nội, tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Văn Thị Oanh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................ 2
3. Nội dung của đề tài ............................................................................... 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tàì .................................................. 2
4.1. Ý nghĩa lý luận ............................................................................... 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................ 2
5. Điểm mới của đề tài .............................................................................. 3
NỘI DUNG. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................... 4
1.1. Khái quát chung về lên men rƣợu vang ............................................. 4
1.1.1. Nguyên liệu sản xuất rƣợu vang ................................................. 4
1.1.2. Thành phần và giá trị dinh dƣỡng của rƣợu vang ....................... 5
1.1.3. Phân loại vang ............................................................................. 6
1.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ............................. 7
1.1.5. Bệnh vang.................................................................................... 8
1.2. Tình hình sản xuất vang nho trong nƣớc và trên thế giới .................. 9
1.2.1. Tại Việt Nam ............................................................................... 9
1.2.2. Trên thế giới .............................................................................. 10
1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang........................ 11
1.3.1. Nấm men ................................................................................... 11
1.3.1.1. Sơ lƣợc về nấm men ............................................................... 11



3.1. Phân lập chủng nấm nem có khả năng lên men rƣợu vang từ dịch
nho Cabernet sauvignon ................................................................... 21
3.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rƣợu vang từ
nho Cabernet sauvignon ................................................................... 23
3.2.1. Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men .................... 23
3.2.2. Khả năng lên men đƣờng .......................................................... 24
3.2.3. Khả năng kết lắng...................................................................... 25
3.2.4. Khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong của sản phẩm .............. 26
3.2.5. Xác định tên khoa học của chủng nấm men nghiên cứu .......... 26
3.3. Đánh giá sự đa dạng của nấm men dựa vào khả năng sử dụng các
nguồn dinh dƣỡng và điều kiên nuôi cấy .......................................... 27
3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau ............................. 27
3.3.1.1. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đƣờng ............................ 27
3.3.1.2. Khả năng lên men ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau .......... 29
3.3.2. Ngiên cứu sự đa dạng dựa vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ
khác nhau .................................................................................. 31
3.3.2.1. Sự đa dạng từ việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ ................ 31
3.3.2.1. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 ở các hàm lƣợng khác nhau tới quá
trình lên men. ............................................................................ 32


3.3.3. Nghiên cứu khả năng lên men ở các độ pH khác nhau đến quá
trình lên men ............................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 36
1. Kết luận ............................................................................................... 36
2. Kiến nghị ............................................................................................. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 37


DANH MỤC BẢNG

HL: Hàm lƣợng
Nxb: Nhà xuất bản
S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae
SLTB: Số lƣợng tế bào
TG: Thời gian
VSV: Vi sinh vật


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Từ xa xƣa, con ngƣời đã biết cách tạo ra rƣợu và sử dụng rƣợu mặc dù
chƣa hiểu rõ bản chất về quá trình này. Rƣợu trở thành một thứ đồ uống phổ
biến và đƣợc ƣa chuộng trên toàn thế giới. Rƣợu vang là một loại rƣợu nhẹ
đƣợc lên men trục tiếp từ dịch ép trái cây mà không cần qua quá trình chƣng
cất, là một thức uống có giá trị dinh dƣỡng cao, hƣơng vị thơm ngon và có lợi
cho sức khỏe con ngƣời khi dùng một cách điều độ.
Trên thế giới ngƣời ta đã biết làm rƣợu vang từ 3000 năm trƣớc công
nguyên. Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rƣợu vang trong đó
có 1/3 của Pháp và Angeri.
Ở Việt Nam ngành sản xuất vang mới bắt đầu từ những năm 80 của thế
kỉ 20 với sự xuất hiện của vang mang nhãn hiệu “Thăng Long” trên thị trƣờng
nội địa. Những năm sau đó dần xuất hiện các sản phẩm mới nhƣ vang Đà Lạt,
vang Vina wine, vang Tháp Chàm… Sản phẩm rƣợu vang vẫn chƣa đƣợc
quan tâm nhiều, quy mô sản xuất chủ yếu dƣới dạng thủ công, lên men tự
nhiên chƣa có cơ sở khoa học cũng nhƣ phƣơng pháp hợp lí dẫn đến năng
suất cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm chƣa cao. Hơn nữa vang của Việt Nam
còn đƣợc làm từ nhiều loại quả nhƣ: nho, dâu, táo mèo,vải, dứa… nên chất
lƣợng chƣa có tiêu chuẩn rõ ràng. Trong sản xuất rƣợu vang, nho là một

nguyên liệu truyền thống rất đƣợc ƣa thích và có giá trị dinh dƣỡng cao.

nho Cabernet sauvignon. Kết quả nghiên cứu này là giữ liệu góp phần bổ
sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của nấm men trong đời sống.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu sẵn có trong nƣớc nhằm sản suất
một loại vang phù hợp với thị hiếu của ngƣời tiêu dùng, phát triển ngành công
nghiệp sản xuất rƣợu vang, đem lại giá trị kinh tế.

2


5. Điểm mới của đề tài
Đề tài là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về mức độ đa dạng
của nấm men dựa vào khả năng sử dụng nguồn dinh dƣỡng và điều kiện nuôi
cấy trong lên men rƣợu vang nho Cabernet sauvignon là một trong những
giống nho nổi tiếng đƣợc sử dụng làm rƣợu vang.

3


NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về lên men rƣợu vang
Lên men là một quá trình trao đổi chất phức tạp, có sự tham gia của nấm men
hoặc một số sinh vật khác, dƣới tác dụng của các enzyme tƣơng ứng gọi là
chất xúc tác sinh học. Trong quá trình lên men rƣợu, đƣờng đƣợc biến đổi
thành rƣợu etylic và CO2. Quá trình lên men kèm theo sự hình thành các sản
phẩm phụ đồng thời giải phóng ra năng lƣợng.
1.1.1. Nguyên liệu sản xuất rượu vang
Từ lâu ngƣời ta chỉ chú trọng tới nho để sản xuất rƣợu vang vì:
Nho cho chất lƣợng tốt nhất, hƣơng vị đậm đà, vị ngọt, nóng của cồn


0,31

0,035

Dứa

54,3

3,9

0,6

0,249

0,83

Mơ

73,8

9,0

1,1

0,249

0,83

Nho


0,249

0,83

1.1.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang
Các thành tố cơ bản của một rƣợu vang đã hoàn thành là nƣớc và alcohol,
một số thành tố khác có hàm lƣợng rất nhỏ, nhƣng là tác nhân về chất lƣợng
và đặc điểm của rƣợu.
Đường (62 – 132 g/l): là nguyên liệu để tạo nên các loại rƣợu trong quá
trình lên men vang. Trong dịch quả chín chủ yếu là các loại đƣờng fructozo,
glucozo và một ít glactozo ngoài ra còn có cả đƣờng saccarozo.
Cồn ethanol: là 1 trong những thành phần quan trọng của rƣợu. Cồn
ethanol do lên men tự nhiên từ dịch trái cây nên nó là thứ cồn tinh khiết
không lẫn andehit và este. Độ cồn của rƣợu vang từ 100 – 120.
Các axit vô cơ, axit hữu cơ: Axit malic, axit citric, axit oxalic… Rƣợu
vang là loại đồ uống có độ chua cao. Hàm lƣợng axit tổng số từ 4 – 7g/l. Độ
pH của vang từ 3 – 4.
Trong vang chứa hàm lƣợng phong phú các muối với hàm lƣợng thấp đó
là muối của các nguyên tố: P,S, K, Na, Fe, Cu…

5


Rượu vang giàu các vitamin và axit amin: Có vai trò vói sự sinh trƣởng
và phát triển của nấm men, đồng thời làm cho vang có vị đặc trƣng: valin,
lizin, treonin…
Các chất tạo màu (0.01 đến 0.5%): các phức chất phenol tạo màu cho
rƣợu và những khác biệt trong hƣơng vị giữa các vang đỏ và vang trắng. Vỏ
trái nho chứa các phenol đa phân tử, dƣới dạng các anthocyanin và tannin, mà

Nhiệt độ < 100C không diễn ra quá trình lên men.
Nếu nhiệt độ 350C đây là nhiệt độ nguy hiểm nấm men mất tác dụng, quá
trình lên men ngừng lại nhƣng nấm men không bị chết.
Nếu nhiệt độ > 350C quá trình lên men ngừng lại ảnh hƣởng đến sự chuyển
đƣờng thành cồn và CO2.
Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rƣợu vang đã xác định khoảng
nhiệt độ tối ƣu cho nấm men vang phát triển là 25 – 280C [11].
Oxi: Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rƣợu vang thuộc
giống Saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi trong
môi trƣờng đủ lƣợng oxy nấm men phân hủy đƣờng dùng làm nguồn năng
lƣợng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối.
pH: Trong quá trình nuôi cấy pH môi trƣờng luôn bị biến đổi đƣợc điều
khiển bởi sự sinh sản của nấm men. Vùng pH tối thích của nấm men là 4 – 6.
Tuy nhiên trong sản xuất rƣợu vang ngƣời ta thƣờng chuẩn bị môi trƣờng
nƣớc quả có độ pH bằng 3.0 – 3.5.
Nồng độ đường và áp suất thẩm thấu. Sự chênh lệch áp suất giũa tế bào
nấm men với môi trƣờng nuôi cấy làm cho lƣợng đƣờng trong dung dịch dễ
dàng hòa tan và thấm qua màng, sản phẩm của tế bào hòa tan vào môi trƣờng

7


khi nồng độ trong môi trƣờng quá cao tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây khô
hạn sinh lí, co CNS phá hủy tính trạng sinh lí của tế bào nấm men.
Nồng độ rượu: Khi lên men đƣờng thành rƣợu nồng độ cồn thấp làm tê
liệt tế bào nấm men, nồng độ cồn cao ức chế quá trình đồng hóa hidrocacbon
và nito. Trong môi trƣờng có nồng độ hợp lí đạt tiêu chuẩn cần có đối với
nhóm nấm men trong sản xuất rƣợu sẽ tích lũy từ 9 – 14%.
HL men giống: HL men giống tăng nhiều quá sẽ gây ra sự cạnh tranh
của nấm men ảnh hƣởng đến chất lƣợng lên men. SLTB có trong dịch lên

Đặc điểm: Rƣợu bị chua và có vị đắng.
Nguyên nhân: Do vi khuẩn lactic phá hủy glixerin tạo thành các acrolrin.
Vang chua lactic
Đặc điểm: Rƣợu có mùi chua khó chịu.
Nguyên nhân: Khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đƣờng, kỹ thuật lên
men thấp, làm cho nấm men ngừng hoạt động, hoặc do cấy men chƣa đủ,
nhiệt độ cao, thiếu oxy,... vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa đƣờng khử thành
đƣờng manit và axit bay hơi.
Vang bị đục
Đặc điểm: Vang có màu đục không trong [16].
1.2. Tình hình sản xuất vang nho trong nƣớc và trên thế giới
1.2.1. Tại Việt Nam
Khoảng 100 năm trở lại đây nhờ sƣ̉ dụng quy trì nh sản xuất rƣợu vang
chất lƣợng cao chúng ta cho ra đời dòng vang đầu tiên khá t hành công Vine
Wine. Theo công nghệ sản xuất đó một loạt nhƣ̃ng dòng vang khác lần lƣợt ra
đời: Vang Gia Lâm , vang Đông Đô , vang Tây Hồ ,… Đến nay nhiều công
trình nghiên cứu trong lĩnh vực sản xuất rƣợu vang nho cũng đã và đang đƣợc

9


tiến hành mang lại nhiều kết quả tốt . Đồng thời vang Việt Nam cũng bắt đầu
bƣớc vào thời kỳ hội nhập các sản phẩm cũng đƣợc xuất khẩu đến 1 số nƣớc
trên thế giới. Vang Đà Lạt, Anh Đào, Sao La là những sản phẩm đƣợc yêu
thích ở Việt Nam bởi mùi vị và chất lƣợng. Đặc biệt năm 2008 vang Đà Lạt
đƣợc Phòng Thƣơng mại Công nghiệp Việt Nam và AC Nielsen Việt Nam
trao tặng danh hiệu Thƣơng hiệu nổi tiếng (trong top 500 thƣơng hiệu nổi
tiếng nhất tại thị trƣờng Việt Nam).Theo thống kê của Hiệp hội Rƣợu Bia và
Nƣớc giải khát Việt Nam, hiện cả nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và
đóng chai rƣợu vang với sản lƣợng mỗi năm tăng khoảng 12 – 13 triệu lít

những năm kế tiếp [18].
1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang
1.3.1. Nấm men
1.3.1.1. Sơ lược về nấm men
Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản bằng
cách nảy chổi. Chúng phân bố rộng rãi trong môi trƣờng đất, nƣớc, không khí,
đặc biệt có nhiều trong các loại quả. Nấm men đƣợc dùng trong lên men rƣợu
vang là S. cerevisiae chứa trung bình 75% nƣớc, 25% chất khô.
Ngƣời ta phân loại nấm men trong sản xuất rƣợu vang thành một số loại sau:
S.cerevisiae, Saccharomyces vini, S. oviomis…
Nhƣng sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng S.cerevisiae. Chủng
nấm men này có khả năng lên men dịch có HL đƣờng cao và tạo đƣợc
20 – 30%V cồn, khả năng lắng kết và tạo hƣơng vị cho vang tốt [3], [4].
1.3.1.2. Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men
Hình thái của tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan hoặc hình
trứng... kích thƣớc tƣơng đối lớp: đƣờng kính khoảng 7µm. Hình dạng có thể
thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy và tuổi tế
bào. Nấm men mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống, gồm:
Thành tế bào: thành phần chính là glucan và mannan chiếm khoảng
90%, còn lại là prrotein, lipit và một số thành phần nhỏ khác nhƣ kitin...

11


Màng nguyên sinh chất: là một lớp tế bào mỏng bao quanh tế bào chất
gồm các hợp chất phức tạp nhƣ photpholipit, protein, enzim permaza...
Tế bào chất: ở dạng thể keo không đồng nhất, chứa đầy đủ các cơ quan
tử của tế bào nhƣ ty thể, nhân, riboxom, không bào, các hạt dự trữ... Thành
phần cấu tạo chủ yếu của tế bào chất là nƣớc, protit, gluxit, lipit, các muối
khoáng...

Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rƣợu vang,
thùng chứa thiết bị hoặc không khí đƣa đến nhƣ nấm mốc thuộc chi Rhizopus,
Aspergillus [4], [13].
1.3.3. Vi khuẩn lactic
Trong dịch quả cũng nhƣ trong vang thƣờng gặp khá nhiều loài vi
khuẩn lactic, trong đó có rất nhiều loài cần thiết cho quá trình sản xuất vang
từ các loại quả giàu axit malic. Ví dụ các chủng vi khuẩn lên men lactic thuộc
các giống Pediococus và Leuconostoc. Ngày nay, ngƣời ta xác định cả các vi
khuẩn lactic lên men đồng hình nhƣ: Lactobacillus plantarum, L.casie và các
vi khuẩn lên men lactic dị hình: L.buchneri, L.brevis đều có thể lên men [8],
[14].
1.3.4. VSV làm hỏng vang
Có không ít các loài vi khuẩn làm cho vang bị đục, có vi chua, mùi khó chịu
làm chi vang bị hỏng nhƣ:

13


Pichia, Candida,… là các loại nấm men tạo màng trên bề mặt vang,
phân giải đƣờng thành các acid hữu cơ: xitric, axetic… làm cho vang bị đục,
độ chua tăng cao, vị không ngon [2], [3].
Các chủng vi khuẩn thuộc Acetobacter oxy hóa etylic thành axit axetic
và CO2.
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của tế bào
nấm men
Nguồn cacbon
Các hợp chất hữu cơ khác nhau nhƣ các loại đƣờng và dẫn xuất, rƣợu, axit
hữu cơ, axit amin... có thể là nguồn dinh dƣỡng cacbon của nấm men, trong
đó nguồn đƣờng là chủ yếu. Nấm men có thể sử dụng nhiều nguồn đƣờng
khác nhau nhƣ glucozo, saccarozo, maltozo... Hợp chất cacbon chiếm vị trí