TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

PHẠM THANH DUNG

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG
CỦA NỒNG ĐỘ NACL TỚI SINH TRƢỞNG MẦM
VÀ HOẠT ĐỘ MỘT SỐ EMZYM
CHỐNG OXY HÓA Ở HẠT MẦM ĐẬU TƢƠNG
(GLYCINE MAX ( L).MERR)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
=======***=======

PHẠM THANH DUNG

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG
CỦA NỒNG ĐỘ NACL TỚI SINH TRƢỞNG MẦM
VÀ HOẠT ĐỘ MỘT SỐ EMZYM
CHỐNG OXY HÓA Ở HẠT MẦM ĐẬU TƢƠNG
(GLYCINE MAX ( L).MERR)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

Phạm Thanh Dung


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Lý do chọn đề tài. ......................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu. ................................................................................... 3
1.3. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................... 3
1.4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn. ......................................................................... 3
NỘI DUNG ........................................................................................................ 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Sự nảy mầm và sinh trưởng của mầm đậu tương .......................................... 4
1.2. Tình hình nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của đậu tương ở Việt Nam
và thế giới . ......................................................................................................... 5
1.3. Vai trò của hai enzyme catalase và peroxidase trong giai đoạn nảy mầm và sinh
trưởng mầm của thực vật nói chung và ở cây đậu tương nói riêng. ........................... 8
1.4. Tình hình nghiên cứu về vai trò của enzym chống oxy hóa ở thực vật nói
chung và ở cây đậu tương nói riêng. .................................................................... 9
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu. ................................................................................ 11
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 11
2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ........................................................... 11
2.2.2. Cách bố trí thí nghiệm. ............................................................................ 12
2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu. .................................... 13
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 17
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. ....................... 18
3.1. Khả năng nảy mầm và sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng trong môi
trƣờng mặn. ..................................................................................................... 18
3.1.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương................................................. 18


Trong quá trình sống, thực vật luôn chịu tác động của các nhân tố ngoại
cảnh. Trong số đó có những nhân tố không thuân lợi cho hoạt động sống của
thực vật như: khô hạn, giá rét, đất chua, đất mặn, sâu bệnh... Một trong những
nhân tố bất lợi của môi trường gây ảnh hưởng lớn đến năng suất là tác động của
muối. Hàm lượng muối cao trong đất là một trong những nguy cơ hạn chế năng
suất và phẩm chất cây trồng ở nhiều nơi trên thế giới. Hiện nay có khoảng 230

1


triệu ha đất (sản suất gần 50% sản lượng lương thực trên thế giới) bị nhiễm mặn.
Riêng ở Việt Nam và Đông Nam Á ước tính có khoảng 54 triệu ha đất bị nhiễm
mặn. Phần lớn diện tích mặn chưa được sử dụng, chỉ một phần nhỏ được sử dụng
nhưng cho năng suất chưa cao.
Những nghiên cứu về tác động của mặn và hạn nói chung lên sự sinh
trưởng và phát triển của cây trồng cho thấy, cây trồng có khả năng thích ứng
trong một giới hạn nhất định với tác động của các nồng độ muối. Khi gặp điều
kiện stress muối, thực vật sẽ có các phản ứng về mặt hình thái, sinh lý, sinh hóa
để thích nghi với điều kiện bất lợi đó của môi trường như thay đổi một số đặc
điểm hình thái giải phẫu phù hợp hoặc gia tăng một số chất có khả năng bảo vệ,
đặc biệt là sự hình thành và tích lũy một số enzym chống oxy hóa như: enzym
catalase và enzym peroxidase. .
Vấn đề nghiên cứu khả năng chống oxy hóa ở cây trồng đến nay còn ít,
nhất là ở giai đoạn sinh trưởng đầu tiên của mầm. Vì thế để nâng cao năng suất
và chất lương đậu tương cùng với công tác tạo giống thì việc lựa chọn những
giống thích hợp với từng vùng sinh thái khác nhau nhất là vùng đất mặn là việc
làm có ý nghĩa thực tiễn rất lớn.
Ở Việt Nam có khí hậu nhiệt đới, gió mùa nóng ẩm thích hợp cho việc
trồng đậu tương. Tuy nhiên, đậu tương lại khá nhạy cảm với các điều kiện bất lợi
của môi trường đặc biệt là giai đoạn nảy mầm, việc stress muối sẽ ảnh hưởng lớn

1.1. Sự nảy mầm và sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng
Sự sinh trưởng phát triển của đậu tương được chia làm các giai đoạn sau:
Nảy mầm, cây con, ra hoa, hình thành quả, quả chín.
Sau khi trồng hạt đậu tương ngấm nước rất nhanh trừ một vài giống đặc
biệt là loại hoang dại khả năng ngấm nước chậm hơn. Trong điều kiện thuận lợi,
rễ xuất hiện sau khi trồng 1-2 ngày. Rễ này gọi là rễ chính nó phát triển nhanh
xuống phía dưới, đến ngày thứ 3 - 4 rễ phụ bắt dầu xuất hiện. Sau 4 - 5 ngày lá
mầm xuất hiện và đẩy lên khỏi mặt đất sự sinh trưởng mạnh của phần trên trụ
mầm dưới lúc đầu lá mầm có màu vàng nhạt, sau có màu xanh sau cùng chuyển
sang màu vàng và rụng xuống.
Thực chất quá trình nảy mầm là quá trình biến đổi sinh lí, sinh hoá mạnh
mẽ diễn ra trong hạt,chuẩn bị cho sự hình thành cây non. Đậu tương thuộc cây
hai lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các pha như sự nảy mầm ở các cây hai lá
mầm đó là:
+ Pha trương hạt: tính từ khi bắt đầu nảy mầm, hạt hút nước rất mạnh làm
trương hạt.
+ Pha hình thành và hoạt hoá enzym: hạt có một lượng enzym nhất định
nhưng chủ yếu ở dạng liên kết, khi hạt hút nước thì enzym mới được giải phóng
ở dạng tự do và bắt đầu hoạt động mạnh.
+ Pha tích luỹ chất dinh dưỡng: ngay trong những phút đầu ngâm trong
nước, độ hấp thụ oxy của hạt tăng lên đặc biệt là chu trình hexozomonophotphat
tăng lên nhiều lần, do vây lượng ATP tích luỹ nhiều hơn.

4


+ Pha động viên các chất dự trữ và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho
cơ thể ở giai đoạn nảy mầm: các chất dinh dưỡng trong hạt chủ yếu thuộc 3 nhóm
chất hữu cơ là: gluxit ,protein, lipit.trong quá trình nảy mầm enzym α-amilaza tác
động vào liên kết 1,4-glucozit phân giải tinh bột thành các đextrin tham gia vào quá

đột biến. Giống Tiefeng 18 được tạo ra do xử lý bằng tia gamma có khả năng
chịu được phèn cao, không đổ, năng suất cao, phẩm chất tốt. Giống Heinoum
N06, Heinoum N016 xử lý bằng tia gamma có hệ rễ tốt, lóng ngắn, nhiều cành,
chịu hạn, khả năng thích ứng rộng.
Thái Lan với sự phối hợp giữa hai trung tâm là MOAC và CGPRT nhằm
cải tiến tạo giống có năng suất cao, chống chịu với một số sâu bệnh hại chính
đồng thời có khả năng chịu được đất mặn, chịu được hạn hán và ngày ngắn
(Judy W.H và Jackobs J.A, 1979).
- Nghiên cứu về biện pháp kỹ thuật:
Theo Lawn các yếu tố khí hậu bao gồm nhiệt độ, ánh sáng và lượng mưa
là những yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các thời kỳ sinh trưởng và phát triển, khả
năng cố định đạm và năng suất hạt đậu tương. Gieo trồng đậu tương ở thời vụ
không thích hợp thường làm giảm năng suất hạt đậu tương vì các nguyên nhân
sau: giảm mật độ cây trồng do độ ẩm đất thấp không đảm bảo cho sự nảy mầm
của hạt, rút ngắn thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng do điều kiện nhiệt độ cao…
Tại Queensland – Úc, Dickson và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng
của phân lân được bón đã chỉ ra rằng năng suất đậu tương tăng lên rất đáng kể
khi đậu tương được bón phân lân.

6


Oliver S. and S.A Barler cho biết: Hoạt động cố định Nito của vi khuẩn nốt
sần được đo bằng hàm lượng Legemoglobin vào cuối thời kì ra hoa đã tăng 2,5 lần ở
600 ppmP và 800 ppmP. Nhưng Canxi lại làm giảm hoạt động của vi sinh vật. Khi
bón nhiều lân, tốc độ cố định Nitơ cao hơn và lượng axit glutamic tăng.
Ở nước ta, do vị trí quan trọng của đậu tương trong hệ thống cây trồng nên
các nhà khoa học đã đầu tư chọn, tạo các giống đậu tương mới với mục tiêu: nâng
cao năng suất, phẩm chất và khả năng thích ứng, tính chống chịu. Bên cạnh đó,
công tác nhập nội nguồn gene đậu tương cũng làm xuất hiện nhiều giống đậu

Hiện nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật đã giúp
các nhà khoa học chọn tạo được các giống đậu tương mới năng suất cao góp
phần nâng cao hiệu quả kinh tế của cây đậu tương. Các kết quả nghiên cứu của
Mai Quang Vinh, Ngô Phương Thịnh tại Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo ra
nhiều giống đậu tương mới: DT84, DT90, DT95,… có năng suất cao và tính
chống chịu điều kiện bất lợi cũng tăng hơn các giống cũ. [24], [25]
1.3. Vai trò của hai enzyme catalase và peroxidase trong giai đoạn nảy mầm và
sinh trƣởng mầm của giới thực vật nói chung và ở cây đậu tƣơng nói riêng.
Trong các yếu tố ngoại cảnh thì nước là yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng lớn
nhất đến sinh trưởng phát triển và năng suất của đậu tương. Dưới điều kiện tác
động của NaCl, lượng nước cung cấp cho các quá trình sinh lí, sinh hóa giảm ,
gây khó khăn cho sự phát triển của hạt mầm. Nồng độ muối cao dẫn tới hạn sinh
lí và sự nhiễm độc các ion Na+ và Cl-, ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển
của đậu tương.[15]
Nồng độ muối cao tác động tiêu cực đến tăng trưởng, đặc điểm nông học,
chất lượng giống và số lượng, và do đó làm giảm năng suất của đậu tương. Để
đối phó với stress muối, đậu tương đã phát triển một số cơ chế, bao gồm: (i) duy
trì cân bằng nội môi ion; (ii) điều chỉnh để đáp ứng với stress thẩm thấu; (iii)

8


khôi phục sự cân bằng thẩm thấu; và (iv) trao đổi chất khác và sự thích ứng của
cấu trúc tế bào.[29]
Đậu tương có khả năng chống lại hoặc hạn chế sự mất nước bằng những
biến đổi hình thái và những phản ứng hóa sinh phù hợp. Hệ thống chống oxy hóa
hoạt động rất phức tạp để trung hòa các gốc tự do. Các enzym chống oxy hóa đã
có những biến đổi để bảo vệ hạt mầm trong điều kiện mặn: khi cây bị stress
nước, ở mức độ nội bào sẽ tạo ra các tác nhân gây hại như gốc superoxit, H2O2
và gốc hydroxy tự do, đây là nguyên nhân gây hư hại cho màng sinh chất, các

nói chung và cây đậu tương nói riêng.[ 29]
Một số thí nghiệm nghiên cứu đã cho thấy, ở đậu tương, khi bị stress mặn
nhẹ, bên trong mầm có một mức độ cao của các enzym chống oxy hóa và giảm
hàm lượng glutathione có thể bảo vệ chống lại các gốc tự do hay oxy hoạt tính
(ROS), và do đó tránh được các sự cố của leghemoglobin, peroxy lipid và
protein.[ 30]
Tuy nhiên, nếu stress mặn nghiêm trọng thì tế bào hạt mầm bị suy thoái
không thể đảo ngược trong leghemoglobin và giảm hoạt động nitrogenase bất
chấp sự gia tăng GR hoạt động mức độ cao của glutathione ở trạng thái khử
(GSH) (Comba et al. 1998).

10


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣ ng nghiên cứu.
Giống ĐT22:
- Nguồn gốc: Được Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ
dòng đột biến của hạt lai DT95 và ĐT12. Đã được Hội đồng Khoa học và Công nghệ
( Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) công nhận là giống mới.[33]
- Đặc điểm: ĐT22 có hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có
màu nâu, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình đạt 25 – 45 quả trên cây,
có khoảng 16% – 20% số quả ba hạt, chiều cao cây khoảng 45cm – 75cm, khối
lượng 1000 hạt 155g – 160g.[32]
Năng suất đạt 18 – 27 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm
canh, có thể trồng được cả ba vụ trong năm.
ĐT22 là giống chịu được đất ướt và những bệnh mức nhẹ đến trung bình
đối với một số loại bệnh hại chính, kháng được bệnh phấn trắng.
Được Trung tâm Khuyến nông – Khuyến lâm tỉnh Bắc Cạn đưa vào dự án
trồng khảo nghiệm bảy giống đậu tương mới và hai giống đối chứng, ĐT22 được

hóa 1 lần và vào một khung giờ giống nhau. Ghi lại kết quả thu được của một
ngày vào bảng để theo dõi và tổng hợp.
- Hàng ngày, bổ sung lượng dung dịch muối NaCl khoảng 50 ml/khay,
gia giảm số lượng để đạt mức độ đủ ẩm, không úng ngập.

12


2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu.
Xác định tỷ lệ nảy mầm.
Tỷ lệ nảy mầm được xác định theo phương pháp của Volcova (1984).
Đếm số hạt nảy mầm trong các khay mẫu từ khi hạt đầu tiên nảy mầm đến khi
không còn có thêm hạt mới nảy mầm. Những hạt nảy mầm là những hạt có chiều
dài rễ mầm đạt từ 3mm trở lên, tỷ lệ nảy mầm được tính theo công thức sau:
P=

a
 100
b

Trong đó:
P: Khả năng nảy mầm của hạt (%).
a: Số hạt nảy mầm
b: Tổng số hạt đem gieo
Xác định khả năng sinh trƣởng của mầm.
Đo chiều dài thân mầm, thân rễ vào các ngày 2, 4 và 6 và khối lượng tươi,
khô vào ngày 1 và ngày 6 sau khi gieo hạt.
- Sinh trưởng của thân, rễ mầm (mm): Dùng thước chia đến milimet đo
chiều dài của thân, rễ mầm.
- Khối lượng tươi của mầm (g): Dùng giấy thấm thấm sạch nước, sau đó

- Chiết enzym:
 Lấy mẫu từ các khay nồng độ, cân mẫu, nghiền mẫu trong 10ml đệm
photphat (pH 7,0) 50mM.
 Ly tâm lạnh ở 6000g/ 40 phút/ 2oC.
 Dịch trong phía trên là dịch chiết enzym thu được.
Cách tiến hành:
- Lấy 2 bình nón dung tích 100ml:

 Bình thí nghiệm: Dung dịch H2O2 0,1% (ml): 10
Dịch chiết enzym (ml)

: 10

Giữ ở 30oC trong 30 phút
Axit H2SO4 10% (ml)

:5

Chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu
hồng bền ( bền màu trong khoảng 30 giây).

14


 Bình đối chứng: Dịch chiết enzym (ml) : 10
Đun sôi cách thủy trong 5 phút để biến tính enzym, lấy ra để nguội.
Dung dịch H2O2 0,1% (ml): 10
Giữ ở 30oC trong 30 phút
Axit H2SO4 10% (ml)



15


purpurogallin có thể được đo quang phổ ở bước sóng 420nm với khoảng thời
gian đặc hiệu ( sử dụng phần mềm Kinetis, đo trong 3 phút, 20 giây đọc kết quả
một lần).
Thiết bị và vật liệu:
- A: 2M NaOH : Hòa tan 8g NaOH trong 90ml nước cất, sau đó dâng lên
100ml nước.
- B: 0,1M đệm photphat pH 6,0: Hòa tan 6,8g KH2PO4 vào 450ml nước
cất,sử dụng máy đo độ pH, thêm dung dịch NaOH 2M để đạt đệm pH 6,0. Sau
đó dâng nước lên 500ml.
- C: 5,33% Pyrogallol: Hòa tan 1,333g Pyrogallol trong 20ml nước cất,
sau đó dâng lên vạch 25ml. ( Bảo quản lạnh, để trong lọ tối, pha mới mỗi ngày).
- D: Dung dịch H2O2: Pha 0.66ml H2O2 30% vào 50ml nước cất. ( Để
trong lọ tối, pha mới mỗi ngày).
- E: Dịch chiết enzym: Nghiền mẫu với 5ml đệm pH 6,0 ( tỷ lệ 1 phần
mẫu : 5 phần đệm). Tiến hành ly tâm dịch nghiền 6000g/30 phút/ 0 oC. Dịch
trong phía trên là dịch chiết enzym thu được.
Cách tiến hành:
Đo ở bước sóng 420nm.
Hóa chất
0,1M đệm photphat pH 6,0.
5,33% Pyrogallol
H2O2
Dịch chiết enzym
Tổng

Ống đối chứng

diễn bởi giá trị trung bình và sai số trung bình của các phép đo. Kết quả thí
nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm thống kê Microsoft Excel
theo các tham số: giá trị trung bình ( X ), độ lệch chuẩn (  ), sai số trung bình
(m), hệ số biến động (Cv), sai số của hiệu các trung bình số học (m d), độ
chính xác của thí nghiệm( m%), độ tin cậy của hai số trung bình (t d) được tính
theo các công thức:
N

X

Cv = 

=


i 1

Xi



n

 .100

m%=

X

td =

3.1. Khả năng nảy mầm và sự sinh trƣởng của mầm đậu tƣơng trong môi
trƣờng mặn.
3.1.1. Khả năng nảy mầm của hạt đậu tương.
Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu tương trong 6 ngày thí nghiệm được thể hiện
qua bảng 1 và hình 1.
Bảng 1. Ảnh hƣởng của các nồng độ NaCl đến tỷ lệ nảy mầm của đậu tƣơng
ĐV: %
Mẫu TN

Ngày 2

Ngày 4

Ngày 6

ĐC

79,33

100,00

100,00

M0,3

72,00

100,00

100,00


44,80

M1,8

-

4,66

14,60

Tỷ lệ nảy mầm của hạt tăng nhanh từ ngày 2 đến ngày thứ 4. Qua ngày thứ
4, tỷ lệ hạt nảy mầm tăng thêm nhưng không còn cao, những hạt chưa nảy mầm
trương nước to nhưng mầm vẫn không làm nứt được vỏ hạt để chồi ra. Sang
ngày thứ 6, những hạt chưa nảy mầm có lớp keo bao quanh và bắt đầu có dấu
hiệu bị hỏng.
Tỷ lệ hạt nảy mầm ở nồng độ NaCl 0,3 và 0,6 khá cao, đạt giá trị ngang
bằng với tỷ lệ nảy mầm ở khay đối chứng từ ngày 4. Tỷ lệ hạt nảy mầm tỷ lệ
nghịch với sự gia tăng của nồng độ NaCl. Ngày 2 ( sau 1 ngày hạt được gieo),
đậu tương chỉ nảy mầm ở các nồng độ 0,3% ; 0,6% và 0,9% với tỷ lệ nảy mầm

18


giảm dần theo thang nồng độ tăng. Ngày 4 (sau 3 ngày hạt được gieo), đậu tương
nảy mầm được ở những nồng độ NaCl cao hơn và nồng độ NaCl càng cao thì tỷ
lệ hạt nảy mầm càng thấp.

Hình 1. Ảnh hƣởng của các nồng độ NaCl đến tỷ lệ nảy mầm của đậu tƣơng
Tỷ lệ nảy mầm của hạt như đã nói ở phần trên đã chứng tỏ nồng độ muối có