TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRỊNH HUỲNH NHẬT TOÀN

KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA
ESCHERICHIA COLI TRÊN GÀ KHỎE Ở HỘ
CHĂN NUÔI TẠI PHƢỜNG THỚI AN ĐÔNG–
QUẬN BÌNH THỦY – THÀNH PHỐ CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y

CẦN THƠ - 2013


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y

KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA
ESCHERICHIA COLI TRÊN GÀ KHỎE Ở HỘ
CHĂN NUÔI TẠI PHƢỜNG THỚI AN ĐÔNG–
QUẬN BÌNH THỦY – THÀNH PHỐ CẦN THƠ

Cán bộ hướng dẫn :
ThS. Bùi Thị Lê Minh

Sinh viên thực hiện :

LỜI CẢM TẠ

Trong thời gian học tập và rèn luyện dƣới mái trƣờng Đại học Cần Thơ,
thầy cô đã dành bao tâm huyết để truyền đạt những kiến thức quý báu cho chúng
tôi vững bƣớc vào đời. Hôm nay ƣớc mơ của tôi đã thành sự thật, với sự phấn đấu
của bản thân tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Trong suốt quá trình học tập
cũng nhƣ thời gian thực hiện đề tài tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của rất nhiều
ngƣời. Trong giây phút này đây tôi không biết nói gì hơn ngoài lời cảm ơn chân
thành đến những ngƣời đã quan tâm, lo lắng và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Xin chân thành cảm ơn:
Cô Bùi Thị Lê Minh – ngƣời đã hết lòng chỉ bảo, động viên tôi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp.
Thầy Trần Ngọc Bích đã luôn động viên và hết lòng chỉ bảo, dìu dắt tôi
trong suốt thời gian đại học.
Quý thầy cô Bộ môn Thú Y, Bộ môn Chăn Nuôi đã tận tình truyền đạt kiến
thức cũng nhƣ những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt những năm tháng
qua.
Cha mẹ tôi – ngƣời đã nuôi nấng, dạy dỗ và luôn đặt niềm tin, hy vọng vào
tôi để tôi có đƣợc ngày hôm nay.
Anh chị tôi – ngƣời luôn động viên, an ủi, luôn bên cạnh tôi những lúc khó
khăn nhất.
Các bạn trong và ngoài lớp đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn!


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu,

3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu ...............................................................................9
3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tƣợng ..............................................................9
3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm .........................................................9
3.2.3 Hóa chất và môi trƣờng thí nghiệm ...........................................................9
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................10


3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu ...............................................................................10
3.3.2 Phƣơng pháp pha loãng mẫu .....................................................................10
3.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng E.coli.................................................................11
3.3.4 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ ...............................................................14
3.3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................15
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ..........................................................16
4.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli trên gà ..............................................................16
4.1.1 Tỉ lệ nhiễm E.coli trên gà thịt ...................................................................16
4.1.2 So sánh tỉ lệ nhiễm E.coli trên gà thịt và gà đẻ ..........................................16
4.2 Mật độ nhiễm E.coli trên gà thịt và gà đẻ .....................................................17
4.3 Kết quả làm kháng sinh đồ ..........................................................................17
4.4 Tính đa kháng của E.coli đối với các loại kháng sinh ...................................19
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................20
5.1 Kết luận .......................................................................................................20
5.2 Đề nghị ........................................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................21
PHỤ CHƢƠNG ................................................................................................ 23


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
E.coli: Escherichia coli
APEC: Avian pathogenic E.coli
ST: Heat stable


TÓM LƢỢC
Đề tài “Khảo sát sự lưu hành của Escherichia coli trên gà khỏe ở hộ chăn
nuôi tại Phường Thới An Đông – Quận Bình Thủy – Thành Phố Cần Thơ” được
thực hiện từ tháng 08 đến tháng 12/2013 trên 56 mẫu phân gà ở trạng thái khỏe
mạnh, trong đó bao gồm 20 mẫu phân gà đẻ và 36 mẫu phân gà thịt ở các lứa
tuổi khác nhau. Sau khi lấy mẫu về chúng tôi tiến hành phân tích định lượng theo
TCVN 5155-90 và thử độ nhạy của một số loại kháng sinh đối với các mẫu phân
lập được. Kết quả phân tích định lượng thu được là tỷ lệ nhiễm E.coli trên phân
gà 78,57%. Mật độ nhiễm 7,2 x 106 - 9,6 x 106 tùy đối tượng. Kháng sinh đồ thu
được cho biết E.coli nhạy cảm với các kháng sinh Norfloxacin (72,72%),
Amoxicillin/ clavulanic acid (63,63%) và đề kháng mạnh với các kháng sinh
Amoxcillin (88,63%), Ampicilline (59,09). Xét về tính đề kháng kháng sinh thì
một số vi khuẩn có thể đề kháng cùng lúc từ 2 đến 8 loại kháng sinh khác nhau,
trong đó số vi khuẩn đề kháng cùng lúc 6 loại kháng sinh chiếm đa số các mẫu
phân lập được (31,82%) và số mẫu kháng lại 2 và 3 loại kháng sinh chiếm tỷ lệ
nhỏ nhất (2,27%).


CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Trần Cẩm Vân (2001), vi khuẩn E.coli thƣờng cƣ ngụ sẵn trong đƣờng
tiêu hóa của các loại gia cầm ở mọi lứa tuổi với tỷ lệ cao, ở trong ruột chúng sống
đối kháng với một số vi khuẩn khác nhƣ Salmonella và Shigella nhờ có khả năng
tạo ra một loại chất ức chế có tên là Colixin. Chúng có khả năng tổng hợp một số
vitamin thuộc nhóm B, E và K. Vì thế khi không gây bệnh chúng có lợi cho
đƣờng ruột nhờ hạn chế đƣợc một số vi khuẩn khác, giữ thế cân bằng sinh thái
trong ruột và sinh tổng hợp một số vitamin, tuy nhiên khi gặp điều kiện thuận lợi
vi khuẩn sẽ phát triển mạnh hơn và gây bệnh cho đàn gia cầm (trích dẫn bởi Phan
Chí Thiên, 2011). E.coli gây bệnh trên gia cầm với nhiều thể bệnh khác nhau,
ngoài các serotype chỉ gây bệnh trên gia cầm thì E.coli còn có chủng O157:H7 có


Hình 1. Túi khí chứa nhiều dịch viêm
(http://www.anova.com.vn/contents/articleasp?id=288&detail=16&ucat=44)


Hình 2. Màng fibrin phủ đầy quanh tim.

Hình 3. Viêm màng bao tim và viêm màng bụng
(http://www.anova.com.vn/contents/articleasp?id=288&detail=16&ucat=44)

Hình 4. Viêm rốn và lòng đỏ không tiêu
(http://www.anova.com.vn/contents/articleasp?id=288&detail=16&ucat=44)


2.1.1 Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Nhƣ Thanh (1997), E.coli là một loại trực khuẩn hình gậy
ngắn, kích thƣớc 2-3 μm x 0,6 μm. Trong cơ thể trực khuẩn có hình cầu đứng
riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi trong môi trƣờng nuôi cấy còn thấy
những trực khuẩn dài 4-8 μm, những loại này thƣờng gặp trong canh khuẩn già.
Phần lớn E.coli di động do có lông ở xung quanh thân nhƣng một số không thấy
di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, bắt màu Gram âm, có thể bắt màu toàn
thân hoặc sẫm ở hai đầu khoảng giữa nhạt hơn, có thể hình thành giáp mô khi gặp
môi trƣờng dinh dƣỡng tốt, nhƣng soi tƣơi có thể không thấy đƣợc. Nếu cố định
bằng axit osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế bào E.coli có nhân, đó là
một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng.
Theo Rea và Fleming (1994), trên thạch dinh dƣỡng chúng tạo ra khuẩn lạc
từ trơn láng (Smooth= S) đến sần sùi (Rough= R) hoặc dạng nhầy (Mucoid= M),
đƣờng kính từ 1,5-3 mm. Dạng S thì hơi lồi, ƣớt với bề mặt bóng láng, rìa khuẩn
lạc nguyên vẹn và tan dễ dàng trong nƣớc muối sinh lý. Dạng R thì khô và khó
tan trong nƣớc muối sinh lý. Dạng S có chuỗi polysaccharide là một phần của

triptophan, E.coli sẽ li giải Tritophan thành Indole. Để nhận biết Indole ngƣời ta
nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, hợp chất Indole với thuốc thử Kovacs có màu đỏ.
Methyl Red: thử nghiệm MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác
biệt về khả năng tạo và duy trì các sản phẩm biến dƣỡng có tính axit bền trong
môi trƣờng trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị methyl red giúp phân biệt
nồng độ H+ hiện diện trong môi trƣờng sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ
thị này thay đổi khác nhau tùy vùng pH hay nồng độ ion H+: đỏ khi pH thấp hơn
4,4; màu cam khi pH 5,0- 5,8 và màu vàng khi pH trên 6,0. Nồng độ ion H+ phụ
thuộc vào tỉ lệ CO2 , H2 và con đƣờng chuyển hóa đƣờng của từng vi sinh vật.
Trong môi trƣờng glucose, E.coli tạo môi trƣờng có H+ cao (pH
chủng E.coli O157:H7 là một chủng sinh độc tố Shiga gây hại cho ngƣời (Nguyễn
Đức Hiền, 2009).
Trong đƣờng tiêu hóa E.coli chiếm tỉ lệ cao nhất trong số vi khuẩn hiếu khí
(khoảng 80%). Tuy nhiên, E.coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó
đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đƣờng tiết niệu, viêm đƣờng
mật, đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E.coli có thể
gây nhiều bệnh khác nhƣ viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thƣơng. Theo báo cáo
của chƣơng trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh
thƣờng gặp (1988- 1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S. aureus) về tỉ lệ phân lập
đƣợc từ các loại bệnh phẩm ở nƣớc ta (Viện sốt rét ký sinh trùng – côn trùng Quy
Nhơn).
Theo Trần Cẩm Vân (2001), bình thƣờng E.coli sống trong ruột nhƣng
không gây bệnh. Khi cơ thể suy yếu một số chủng trở nên gây bệnh. E.coli không
chỉ gây bệnh đƣờng ruột nhƣ tiêu chảy, kiết lỵ mà còn có thể gây một số bệnh
khác nhƣ viêm phế quản, viêm màng phổi...
Theo Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1997), bệnh do trực khuẩn E.coli có thể xảy ra
nhƣ một bệnh truyền nhiễm kế phát trên cơ thể thiếu vitamin và mắc các bệnh do
virus và kí sinh trùng. E.coli thƣờng gây bệnh cho súc vật mới đẻ từ 2-3 ngày
hoặc 4-8 ngày, gây bệnh đƣờng ruột cho ngựa, bê, lợn con, cừu con, gia cầm con.
Ở gia cầm (gà, vịt, bồ câu) phân xanh lá cây rất hôi thối, có khi viêm kết mạc
mắt, viêm cuống phổi, viêm phổi, viêm niêm mạc mũi làm gia cầm thở khó
(Trích dẫn của Phan Chí Thiên, 2011).
Theo Lê Hồng Mận (1999), vi khuẩn E.coli gây bệnh trên gà là nhóm APEC
(Avian pathogenic E.coli) thuộc các serotype O1, O2, O78 gây bệnh ở đƣờng ruột
thƣờng là do kết hợp với yếu tố ngoại cảnh và nhân tố mở đƣờng (Trích dẫn của
Nguyễn Quốc Cƣờng, 2010).
2.2 Kháng sinh
Theo Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1977), chất kháng sinh là những chất hóa học do
sinh vật bài tiết ra hoặc do tổng hợp hóa học, có khả năng ức chế sự phát triển của



CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Nội dung nghiên cứu
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E.coli trên phân gà bằng phƣơng pháp định
lƣợng theo TCVN 5155-90 để xác định tỉ lệ và mật độ nhiễm E.coli trên gà.
Kiểm tra độ nhạy của kháng sinh đối với các chủng E.coli phân lập đƣợc.
3.2 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013.
Địa điểm thu mẫu: mẫu đƣợc lấy tại một số hộ nuôi gà thuộc địa bàn
Phƣờng Thới An Đông – Quận Bình Thủy - Thành Phố Cần Thơ.
Địa điểm phân tích mẫu: tại phòng vi trùng và miễn dịch của Bộ Môn Thú
Y, Khoa Nông Nghiệp & SHƢD, Trƣờng Đại học Cần Thơ.
Đối tƣợng nghiên cứu: phân gà thịt (ở 3 lứa tuổi: dƣới 1 tháng tuổi, 1-2
tháng tuổi, trên 2 tháng tuổi) và phân gà đẻ.
3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm
Ống đong các loại 50ml, 500ml,…máy autoclave, tủ sấy vô trùng, tủ ấm, tủ
sấy khô, bếp đun cách thủy, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que trang, đèn cồn,
pipet, micropipet các loại, bình tam giác, cốc thủy tinh, bình định mức, cân điện
tử, kéo, kẹp, tampon vô trùng, đũa thủy tinh, thƣớc đo vòng vô khuẩn, thùng trữ
lạnh, túi nylon, khẩu trang, găng tay và một số dụng cụ khác.
3.2.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm
Hóa chất sử dụng: cồn 70o, 90o, nƣớc cất, Natri clorua, thuốc thử VP1, VP2,
Methyl Red, Kovacs, Bacl2.2H2O 1,175%, H2SO4 1%...
Các môi trƣờng sử dụng: Mac Conkey Agar (MC), Nutrient Agar (NA),
Nutrient Broth (NB), Simmons Citrate Agar, Voges Proskauer (VP), Methyl Red
(MR), Trypton Water (Indol), Glycerol, MHA (Muller- Hilton)…
Các kháng sinh sử dụng: Kanamycin (Kn), Amoxicillin (Ax), Gentamicin
(Ge), Amoxicillin/ clavulanic acid (Ac), Norfloxacin (Nr), Tetracycline (Te),
Cefuroxime (Cu), Trimethoprime/ sulfamethoxazol (Bt), Doxycycline (Dx),


Tổng cộng

56

3.3.2 Phương pháp pha loãng mẫu
Mẫu sau khi đƣợc lấy về tiến hành nuôi cấy phân lập vi khuẩn E.coli ngay
trong ngày. Cân chính xác 1 gram mẫu để đồng nhất với 9ml nƣớc muối sinh lý
9‰ vô trùng ta sẽ có mẫu với độ pha loãng 10 -1. Tiếp tục tiến hành pha loãng đến
các nồng độ 10-5.
1g phân

1ml

1ml

1ml

1ml

9 ml

9 ml

9 ml

9 ml

9 ml


thử VP2 và có kết quả nhƣ sau: Phản ứng dƣơng tính thì trên bề mặt môi trƣờng
không màu sau khi nhỏ xuất hiện vòng đỏ. Phản ứng âm tính thì trên bề mặt môi
trƣờng vẫn giữ nguyên không màu.
Môi trƣờng thạch nghiêng Simmons Citrate Agar: Phản ứng dƣơng tính thì
môi trƣờng sẽ chuyển từ màu xanh lá sang xanh dƣơng. Phản ứng âm tính thì môi
trƣờng vẫn giữ nguyên màu xanh lá.

Hình 5. Vi khuẩn E.coli trên môi trƣờng MC


1

2

3

4

5

6

7

8

Hình 6. Kết quả sinh hóa của E.coli
Ống 1: môi trƣờng Indol dƣơng tính với E.coli
Ống 5: môi trƣờng Indol ban đầu
Ống 2: môi trƣờng MR dƣơng tính với vi khuẩn E.coli

37oC, 24 giờ

Cấy khuẩn lạc từ NA lên môi trƣờng sinh hóa
37oC, 24 giờ

Kiểm tra sinh hóa

Citrate (-)

MR (+)

VP (-)

Indol (+)

E.coli
Sơ đồ 2. Quy trình định lƣợng vi khuẩn E.coli
(Theo TCVN 5155-90)


3.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ
Bảng 2. Bảng tiêu chuẩn đƣờng kính vòng vô khuẩn của kháng sinh
(Theo CLSI, 2012)

Tên kháng sinh

Kí hiệu

Đƣờng kính vòng vô khuẩn(mm)



≤13

Amoxicillin

Ax

10 µg

≥17

14-16

≤13

Amoxicillin/
clavulanic acid

Ac

20/10 µg

≥18

14-17

≤13

Gentamycine


13-16

≤12

Trimethoprime/
sulfamethoxazol

Bt

≥16

11-15

≤10

Cefuroxime

Cu

30 µg

≥23

15-22

≤14

Doxycycline

Dx


≤11

Cefaclor

Cr

30 µg

≥18

15-17

≤14

1,25/
23,75 µg

Chuẩn bị canh khuẩn: chủng vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc chọn làm kháng
sinh đồ đƣợc tăng sinh trong NB khoảng 6 giờ. Canh khuẩn đƣợc so độ đục với
Mac Farland 0,5 tƣơng đƣơng có chứa vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml. Sau đó pha
canh khuẩn có nồng độ 106 CFU/ml.
Chuẩn bị môi trƣờng MHA, độ dày thạch khoảng 4mm. Các đĩa kháng sinh
bảo quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất. Không dùng kháng sinh quá hạn,
kháng sinh ẩm ƣớt. Khi lấy từ tủ lạnh ra phải để ra ngoài 1-2 giờ để cho nhiệt độ
trong lọ bằng nhiệt độ phòng.
Phƣơng pháp tiến hành: dùng tăm bông vô trùng tẩm canh trùng ở 10 6
CFU/ml sau đó trải đều lên khắp mặt thạch MHA. Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng
để đặt từng khoanh đĩa kháng sinh lên đĩa thạch. Đặt các đĩa kháng sinh lên mặt
thạch sao cho 2 đĩa cách nhau 2,5cm – 3,5cm và cách mép hộp thạch 2cm- 2,5cm,