TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
HUỲNH NGỌC HUYỀN
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y
KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2014

KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG

ii

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Khảo sát sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh beta lactamase phổ
rộng trên gà khỏe một số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng”, do sinh
viên Huỳnh Ngọc Huyền thực hiện tại Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh
Học Ứng Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ. Từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014. Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Giảng viên hƣớng dẫn Huỳnh Ngọc Trang Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng


Phân lập Escherichia coli ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm
kháng sinh đồ. Kết quả: Tỉ lệ nhiễm Escherichia coli sinh ESBL trên gà khỏe khá
cao 68,18%. Trong đó Escherichia coli sinh ESBL trên gà thịt 81,82% và gà đẻ
36,36%. Tỉ lệ Escherichia coli sinh ESBL trên các cơ quan phân, gan, phổi lần lượt
là 59,1%, 9,1% và 13,64%, không phát hiện Escherichia coli sinh ESBL trên thịt.
Thử nghiệm kháng sinh đồ 46 chủng Escherichia coli sinh ESBL nhạy cảm với
amikacin 100%, fosfomycin 95,65% và doxycylin 84,78%. Đề kháng cao với
ampicillin 100%, cefuroxime 95,65%, cefaclor, gentamycin, streptomycin,
trimethoprim-sulfamethoxazole 97,83%, kanamycin 78,26%, ofloxacin 93,48%,
norfloxacin 91,3%. Các chủng Escherichia coli ESBL cùng lúc đề kháng từ 3 đến
11 loại kháng sinh là 100% (46/46) với 11 kiểu hình đa kháng. Trong đó kháng
cùng lúc 3 loại kháng sinh chiếm 2,17%, kháng 7 loại chiếm 6,52%, kháng 8 loại
17,39%, kháng 9 loại 30,44%, kháng 10 loại 32,61%, kháng 11 loại 10,87%.

v

MỤC LỤC
TRANG TỰA i
TRANG DUYỆT …ii
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM LƢỢC iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH SÁCH BẢNG viii
DANH SÁCH HÌNH ix
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1. Vi khuẩn Escherichia coli 2
2.1.1 Đặc điểm hình thái 2
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2
2.1.3 Đặc tính sinh hóa 3

5.2 Đề nghị 23
TÀI LIỆU THAM KHẢO 24
PHỤ CHƢƠNG 27

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
CSLI
Clinical and Laboratory Standards Institute
E. coli
Escherichia coli
ESBL
Extended spectrum beta lactamase
EMB
Eosin Methylene Blue
IMViC
Indole, Methy Red, Voges prokauer, Citrate
LT
Heat Labile
MC
MacConkey Agar
MHA
Mueller – Hinton Agar
MR
Methyl Red
NA
Nutrient Agar
PBP

Tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL trên gà khỏe ở huyện Mỹ Tú

16
4.2
Tỉ lệ dƣơng tính E. coli ESBL trên cơ quan gan, thịt, phổi và
mẫu phân
17
4.3
Tỉ lệ kháng của vi khuẩn E. coli ESBL
19
4.4
Tỉ lệ đa kháng và kiều kháng của vi khuẩn E. coli ESBL với
kháng sinh của vi khuẩn E. coli ESBL
21 ix

DANH SÁCH HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1
Vi khuẩn E. coli dƣới kính hiển vi (X=10µm)
2
2
Vi khuẩn E. coli trên môi trƣờng MC
12
3
Sinh hóa xác định E. coli

nuôi khác. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm
trùng, lây truyền qua nhiều thế hệ, hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh
nhƣng đề kháng kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để
truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác (Võ Thị Trà An, 2007). Hiện tƣợng
kháng thuốc của E. coli ở gia cầm là do kháng sinh đƣợc bổ sung thƣờng xuyên vào
thức ăn và nƣớc uống để phòng trị bệnh, cũng nhƣ việc sử dụng kháng sinh không
hợp lí trong chăn nuôi không theo khuyến cáo (Đỗ Võ Anh Khoa và Lƣu Hữu
Mãnh, 2012).
Mỹ Tú là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng tập trung nhiều cơ sở chăn
nuôi gà công nghiệp qui mô lớn. Tuy nhiên chƣa có những nghiên cứu về tỉ lệ
E. coli sinh ESBL trên những trang trại gà của huyện, do đó “Khảo sát sự lƣu
hành của vi khuẩn E. coli sinh beta- lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một
số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng” đƣợc thực hiện.
Mục tiêu đề tài:
- Xác định tỉ lệ E.coli ESBL dƣơng tính trên đàn gà khỏe nuôi công nghiệp tại
huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng.
- Thử tính nhạy cảm vi khuẩn E. coli sinh ESBL với một số loại kháng sinh. 2

CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy
năm 1885 và đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa Đức.
Vi khuẩn E. coli thuộc chi Escherichia họ Anterobacteriaceae, họ vi khuẩn thƣờng
trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh
thƣờng trực đƣờng tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đƣờng ruột và ở các
cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), E. coli đƣợc thải
qua phân với số lƣợng lớn, hầu hết các loài gia cầm đều mẫn cảm với vi khuẩn

Theo Nguyễn Ngọc Hải, (2012) E. coli phát triển dễ dàng trên môi trƣờng nuôi cấy
thông thƣờng ở 37
0
C .Trên môi trƣờng MacConkey, Endo, EMB (Eosin Methylen
Blue) E. coli hình thành nên khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt với các vi khuẩn
khác.
Trên môi trƣờng MacConkey, vi khuẩn lên men đƣờng lactose và hình thành những
khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy. Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc
màu đỏ có ánh kim hoặc không có ánh kim trên môi trƣờng Endo, khuẩn lạc có màu
đen tím trên môi trƣờng EMB (Lê Văn Việt Mẫn, 2006).
Môi trƣờng Mueller-Hinton Agar là môi trƣờng trong, dùng cho thử nghiệm tính
nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trƣờng cũng thƣờng đƣợc dùng để thử
nghiệm sự thuỷ phân tinh bột.
Môi trƣờng NA (Nutrient Agar) thƣờng đƣợc dùng làm môi trƣờng lƣu giữ chủng.
sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ƣớt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng
kính từ 2 – 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc gần nâu nhạt và phát triển rộng ra.
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
E. coli có khả năng lên men đƣờng fructoz, glucose, levulo, galactoz, lactose,
mantose, mannitol, xylose, glycerol, rhamnose, sorbitol và arabinose. Hầu hết các
chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đƣờng lactose nhanh và sinh hơi, đây là một đặc
điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E. coli và Sallmonella. E. coli không lên men
dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin. E. coli không sinh
H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên nitrate thành
nitrite (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Theo Nguyễn Ngọc Hải (2011) để khẳng định E. coli với vi khuẩn đƣờng ruột khác,
ngƣời ta thƣờng sử dụng thử nghiệm IMViC với các phản ứng:
Môi trƣờng Trypton Water dùng để kiểm tra tính sinh indole của vi khuẩn, môi
trƣờng có tryptophan, E. coli nhờ có tryptophan sẽ ly giải tryptophan thành indole
khi nhỏ thuốc thử Kowacs vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng đỏ thì
phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng

Cấu trúc kháng nguyên của E. coli gồm kháng nguyên thân O (somatic), kháng
nguyên lông H (flagellar), kháng nguyên vỏ K (capsular):
Kháng nguyên O (kháng nguyên thân) đƣợc phân bố trong vách tế bào bao gồm
hỗn hợp lipid – polysaccharide – protein, lipid xác định độc tính colitoxin,
polysaccharid xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính kháng
nguyên (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006).
Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ bọc) kháng nguyên giáp mô K (capsular
antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trƣớc khi xâm lấn đƣờng tiêu hóa hay
đƣờng tiết niệu.
Kháng nguyên H (kháng nguyên lông) cấu tạo bởi protein và có tính chất không
chịu nhiệt khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng
kết H. Có ý nghĩa trong xác định giống loài vi khuẩn (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006).
Độc tố gồm có hai loại: nội độc tố và ngoại độc tố, ngoại độc tố gồm hai loại: loại
chịu nhiệt Stabile toxin (ST) và loại không chịu nhiệt Labile toxin (LT).
Nội độc tố: gồm 2 loại Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, LT gây hoạt hoá
adennylcylase trong tế bào biểu mô ruột, làm tăng lƣợng AMP (adenosine
monophosphate) vòng, ức chế tái hấp thụ Na+, hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất
nƣớc. Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên.
ST tác động lên ruột bằng sự hoạt hoá emzyme guaylate cyclate làm tăng GMP
(guanosine monophosphate) vòng dẫn đến kích thích bài tiết nƣớc muối gây tiêu
chảy.
Tính gây bệnh của E. coli đƣợc chia thành 2 loại: Trong đƣờng ruột và ngoài đƣờng
ruột. Trong đƣờng ruột gồm có ETEC (Enterotoxigenic E. coli), EIEC
(Enteroinvasive E. coli), EPEC (Enteropathogenic E. coli), EHEC
(Enterohemorrhagic E. coli), EAEC (Enteroaggregative E. coli), DAEC (Diffusely
adhering E. coli). Ngoài đƣờng ruột gồm MAEC (Meningitidis-associated E. coli),
UPEC (Uropathogenic E. coli)
5

2.2 Kháng sinh nhóm beta- lactam

tốt nhất sẽ gây hiệu ứng Eagle (hiệu ứng ngƣợc), nghĩa là giảm khả năng sát khuẩn.
Đây là một khái niệm quan trọng để tránh sử dụng quá liều kháng sinh nhóm này
(Võ Thị Trà An, 2010).
2.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh
Theo Võ Thị Trà An, (2010) vi khuẩn kháng kháng sinh nhờ vào các cơ chế chủ yếu
sau: sản xuất enzym làm vô hoạt kháng sinh; tạo ra enzym thay thế enzym mà
kháng sinh tác động vào; đột biến hoặc sửa đổi ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết
của kháng sinh với điểm tiếp nhận; giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn,
đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào
6

giảm. Khi gen kháng thuốc của vi khuẩn nằm trên nhiễm sắc thể thì sẽ có khả năng
bảo tồn sự đề kháng. Ngƣợc lại khi yếu tố di truyền nằm trên plasmid nhất là
plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn
khác của cùng loài hay khác loài. Từ đó sự kháng kháng sinh tăng dần lên trong
quần thể vi khuẩn.
2.3 Men beta- lactamase phổ rộng
Men beta- lactamase phổ rộng (ESBL) đƣợc tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại
Đức, thƣờng gặp trong các chủng vi khuẩn đƣờng ruột đặc biệt là E. coli, khi các
chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các
kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin. Đây là trở ngại thực sự trong điều trị
nhiễm trùng trực khuẩn Gram âm (Nguyễn Tuấn Minh, 2008).
Men beta- lactamase có thể đƣợc phân loại dựa vào khả năng thủy phân các cơ chất
thuộc kháng sinh beta- lactam và mức độ bị ức chế bởi acid clavulanic, nhƣng các
đột biến đơn giản có thể làm thay đổi sự phân loại này. Ví dụ TEM -1 là một
penicillinase đơn giản và hoạt động của chúng có thể bị ức chế bởi acid clavulanic
và tazobactam. Tuy nhiên, do đột biến điểm các enzyme TEM có phổ hoạt động
rộng hơn dẫn đến sự đề kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3. Sự bất hoạt của
aztreonam, ceftazidime, cefotaxime hoặc ceftriaxone đƣợc xem là chỉ thị cho sự
hiện diện của các men beta-lactamase có phổ rộng (Võ Thị Trà An, 2010).

cefotazim và ceftazidime cho xét nghiệm này. Thêm 10µg acid clavulanic vào đĩa
kháng sinh oxymino- cephalosphorin, nếu có sự gia tăng lớn hơn 5mm đƣờng kính
vòng vô khuẩn so với đĩa kháng sinh oxymino-cephalosphorin không có acid
clavulanic thì xét nghiệm dƣơng tính, xác nhận có sự sinh men ESBL của vi khuẩn.
Ngoài ra theo Nguyễn Sâm (2009), một số phƣơng pháp khác nhƣ phƣơng pháp
ChromID ESBL agar, phƣơng pháp E – test, phƣơng pháp Vitek ESBL test, phƣơng
pháp Micro scan panels .
ChromID ESBL agar
Môi trƣờng chứa kháng sinh cefpodoxime và chất màu. Chất màu đƣợc thêm
vào để dễ dàng phát hiện các phản ứng do enzyme của vi khuẩn nếu có trong môi
trƣờng. Vì vậy có thể đồng thời vừa định danh vi khuẩn vừa phát hiện vi khuẩn
đề kháng. Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime và có khả
năng phát triển trên môi trƣờng ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có
màu sắc khác nhau, đặc trƣng cho một số loài vi khuẩn.
Ƣu điểm: dễ dàng tiến hành, giá thành rẻ dễ triển khai ở tất cả các cơ sở vi sinh lâm
sàng có nuôi cấy vi khuẩn đặc biệt nhanh chóng sàng lọc các vi khuẩn
đƣờng ruột sinh ESBL đồng thời định danh sơ bộ đƣợc một số loài vi
khuẩn nhƣ E. coli và K. pneumoniae.
Hạn chế: một số vi khuẩn kháng kháng sinh cefpodoxime không phải do sinh
ESBL mà theo cơ chế khác hoặc sinh cephalosporinase, penicillinase có thể mọc
trên môi trƣờng này. Một số vi khuẩn màu sắc khuẩn lạc không điển hình, không
màu hoặc nhiều loài vi khuẩn có thể có màu sắc khuẩn lạc giống nhau. Vi khuẩn
sinh ESBL chậm hoặc yếu có thể không mọc trên môi truờng này sau 18 - 48h nuôi
cấy.
Phương pháp đĩa đôi (double disk diffusion test)
Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhƣng bị ức chế bởi
acid clavulanic, dẫn đến xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh
giấy kháng sinh AMC và mở rộng vùng ức chế giao thoa giữa AMC với
CAZ và CTX .
Ƣu điểm: phƣơng pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, độ nhạy và đặc hiệu cao > 95% .

quả, nếu ESBL (+) vi khuẩn sẽ không mọc ở giếng có cephalosporin kết hợp
clavulanic acid.
2.4. Những nghiên cứu vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên thế giới
Một nghiên cứu của Duru Carissa et al, 2013 đƣợc thực hiện tại Owerri, Nigeria,
nhằm xác định sự hiện diện của E. coli sinh ESBL từ các trang trại chăn nuôi gia
cầm bằng phƣơng pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn đối
với kháng sinh. Kết quả có 22,2% E. coli ESBL từ 45 E. coli dƣơng tính phân lập
từ 159 mẫu phân của gà tây, gà giò và gà địa phƣơng. Các E. coli ESBL phân lập từ
E. coli hoàn toàn nhạy cảm với imipenem, nhƣng kháng với cefepime, ceftriaxone,
nalidixic acid, cefotaxime, ceftazidime, ampicillin, sulphamethoxazole-
trimethoprim và ticarcillin.
Annemieke Smet et al, 2008, nghiên cứu sự đa dạng của ESBL và Class C beta-
lactame phân lập trên ổ nhớp gà từ các trại gà thịt tại Belgian. Trong 489 mẫu có
295 mẫu dƣơng tính với E. coli, trong đó có 45% (133/295) E. coli ESBL. Ngoài ra,
kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn E. coli ESBL kháng với: gentamycine
7,5%, kanamycine 4%, streptomycine 30,2%, trimethoprim 64,4%, tetracyline
48,1%. Kiểm tra sự đa kháng: 4% kháng trên 8 loại kháng sinh, 76% kháng từ 1-2
kháng sinh và 5% kháng với 1 kháng sinh bổ sung.
9

Kola et al, 2012 nghiên cứu tỷ lệ beta-lactamase ở vi khuẩn đƣờng ruột trong thịt gà
Đức. Nghiên cứu thực hiện trên 399 mẫu thịt gà lấy từ siêu thị, bốn cửa hàng thực
phẩm và cửa hàng bán thịt ở Berlin và Greifswald. Kết quả tổng cộng có 185 chủng
ESBL phân lập đƣợc từ 175 mẫu. Phần lớn các chủng E. coli sinh ESBL và 73,0%
các E. coli ESBL kháng với tetracycline, 35,7% với trimoxazole và 7,6% với
ciprofloxacin.
Nghiên cứu của Felix Reich et al, 2010 tại Đức, nghiên cứu phân tích trên 70 mẫu
thân thịt và 51 mẫu manh tràng gà cho kết quả tƣơng ứng 88,6% và 72,5% E. coli
sinh ESBL.
Nghiên cứu khác tại Bỉ của Garcia-Graells et al. (2013), thực hiện trên 396 mẫu thịt

ceftriaxone (8,9%), amoxcillin/acid clavulanic (6,7%), gentamicin (6,7%) và
amikacin (4,4%).
10

Ba mƣơi (66,7%) E. coli phân lập kháng với một hoặc hai kháng sinh, và khả năng
kháng ba đến mƣời bốn kháng sinh là 37,8% .
Stefan Börjesson et al.(2013) 44% (44/100) các mẫu thịt gà ở thụy điển phát hiện
E. coli ESBL ở Thụy Điển, gà hiếm khi điều trị bằng thuốc kháng sinh và không sử
dụng các cephalosporin trong năm 2010 nhƣng đáng ngạc nhiên khi 34% gà Thụy
Điển đã đƣợc xác định là mang E. coli ESBL năm 2010. E. coli phân lập từ thịt gà
nhập khẩu từ Đan Mạch và Phần Lan là tƣơng đồng nhau và liên quan chặt chẽ đến
phân lập từ Thụy Điển. Điều đó cho thấy sự xuất hiện của E. coli sinh ESBL trong
gà Thụy Điển là do lây truyền dọc từ nhập khẩu con giống.
Delphine Girlich et al. (2007), trong 112 mẫu manh tràng gia cầm khỏe mạnh tại cơ
sở giết mổ của bảy huyện ở Pháp vào năm 2005, trong đó có 10,7% (12/112) mẫu
dƣơng tính với E. coli ESBL.
Cindy et al. (2013) đã nghiên cứu về sự hiện diện của E. coli ESBL/ AmpC trên gà
thịt và thịt gà. Mẫu bệnh phẩm ổ nhớp gà 1 ngày tuổi, 18 và 31 tuần tuổi, gà thịt từ
giống gà GPS và mẫu gạt môi trƣờng đƣợc kiểm tra. Kết quả tất cả các mẫu kiểm
tra đều dƣơng tính với E. coli ESBL. Nghiên cứu đƣa ra đề nghị để giảm thiểu tỉ lệ
E. coli sinh ESBL/ AmpC nên tập trung vào việc ngăn chặn truyền ngang và truyền
dọc, đặc biệt là chuồng trại chăn nuôi.
Germany), MHA (Merck KgaA, Germany).
Kháng sinh sử dụng
Ceftazidime 30µg , ceftazidime 30µg/clavulanic acid 10µg, cefotaxime 30µg,
cefotaxime 30µg/clavulanic acid 10µg, ampicilline 10µg, cefuroxime 30µg,
cefaclor 30µg, gentamycine 10µg, streptomycine 10µg, kanamycin 30µg, amikacin
30µg, tetracyline 30µg, doxycyline 30µg, norfloxacin 10µg, fosfomycin 200µg,
trimethoprim 5µg, ofloxacin 5µg của Nam Khoa.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Đề tài khảo sát 22 con gà khỏe tại 2 trại gà tại huyện Mỹ Tú, trong đó có 11 gà đẻ
và 11 gà thịt. Mỗi gà lấy 4 loại mẫu gồm gan, thịt, phổi và phân.
Mẫu phân gà đƣợc lấy trực tiếp từ lỗ huyệt. Dùng bông thấm cồn 70
o
sát trùng xung
quanh hậu môn, đƣa que tăm bông khô, vô trùng vào trong lỗ huyệt, lấy nhẹ phân
sau đó cho tăm bông vào trong ống nghiệm chứa môi trƣờng Cary-Blair để bảo
quản mẫu, ghi kí hiệu mẫu và trữ lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Mẫu phủ tạng gồm: gan, thịt, phổi trƣớc khi lấy mẫu sát trùng vị trí lấy mẫu bằng
cồn 70
0
dùng kéo vô trùng cắt nhẹ bề mặt phủ tạng tại vị trí đã vô trùng, dùng kẹp
vô trùng lấy một ít mô bên trong cho vào túi nylon vô trùng, ghi kí hiệu mẫu trữ
lạnh để vận chuyển về phòng thí nghiệm.

12

3.2.2 Phân lập vi khuẩn E. coli sinh ESBL
Phƣơng pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn E. coli ESBL đƣợc thực hiện bằng
phƣơng pháp đĩa kết hợp, so sánh đƣờng kính vòng vô khuẩn với đƣờng kính vòng
ức chế chuẩn theo CLSI, (2014).

C, nhỏ
vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn. Phản ứng dƣơng tính khi có vòng đỏ
xuất hiện trên bề mặt, phản ứng âm tính khi không có vòng đỏ này.
Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl red vào canh khuẩn trong
môi trƣờng MR-VP, lắc đều. Phản ứng dƣơng tính khi canh khuẩn chuyển sang màu
đỏ, phản ứng âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu.
13

Thử nghiệm Voges prokauer: cho 0,2 – 0,3ml KOH 40% vào canh khuẩn MR-VP,
lắc mạnh. Sau đó cho 0,2ml thuốc thử α – naphthol 5%, lắc mạnh. Quan sát trong 1
giờ, phản ứng dƣơng tính khi canh chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi canh
khuẩn không chuyển màu.

cefotaxim/ clavulanic acid – cefotaxim ≥5mm

Hình 3 Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL

37
0
C/24 giờ
37
0
C/24 giờ
Tạo huyễn dịch vi khuẩn
(nồng độ 10
8
vi khuẩn/ml)
37
0
C/18 - 20 giờ
14 Thử nghiệm Citrate: Quan sát trên môi trƣờng simmon citrate agar, phản ứng dƣơng
tính khi môi trƣờng có xuất hiện sinh khối và chuyển sang màu xanh da trời. Phản
ứng âm tính khi môi trƣờng không có sinh khối và không có chuyển màu.
Sau khi khẳng định là vi khuẩn E. coli ta dùng que cấy lấy 1 ít khuẩn lạc cho vào
9ml ống nƣớc muối sinh lý vô trùng và trộn đều. Độ đục của huyễn dịch vi khuẩn
đƣợc so sánh với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5 nếu huyễn dịch vi khuẩn không có
cùng độ đục với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách
cho thêm nƣớc muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn, dùng tăm bông thấm huyễn
dịch cấy đều lên mặt thạch MHA , sau đó đặt vào tủ ấm 15 phút trƣớc khi đặt kháng
sinh. Ta dùng kẹp đầu nhọn vô trùng đặt từng đĩa kháng sinh ceftazidime 30 µg,

sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm nhƣ là: nhạy cảm ,
trung bình và kháng .
15 Bảng 3.2 tiêu chuẩn phân tích kết quả đƣờng kính vô khuẩn của kháng sinh
(CLSI, 2014)

Đĩa kháng sinh

Hàm lƣợng
(µg)
Đƣờng kính(mm)
Nhạy
Trung gian
Kháng
≥

≤
Ampicillin (Am)
10
17
14 - 16
13
Cefuroxime (Cfx)
30
18

11 - 13
10
Norfloxacin (Nor)
10
17
13 - 16
12
Ofloxacin (Of)
5
16
13 - 15
12
Trimethoprim-
sulfamethoxazole (SXT)
1,25/23,75
16
11 - 15
10
Streptomycin (Str)
10
15
12 - 14
11
Fosfomycin (Fo)
200
16
13 - 15
12
3.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý kết quả bằng phần mềm Exel 2010 và phân tích thống kê bằng