TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y NGUYỄN HUỲNH ĐẢM KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASES
PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN
LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2014

i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh beta –
lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” do sinh
viên Nguyễn Huỳnh Đảm thực hiện tại Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh
Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm
2014. Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Giảng viên hƣớng dẫn ThS. Bùi Thị Lê Minh Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

iii

LỜI CẢM ƠN


iv

TÓM LƢỢC

Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014 nhằm mục tiêu
xác định tỷ lệ hiện diện E. coli sinh beta - lactamases trên gà khỏe xuất thịt từ một
số trại gà công nghiệp ở huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long bằng phương pháp đĩa kết
hợp. Qua khảo sát 440 mẫu gồm 110 mẫu phân, 110 mẫu gan, 110 mẫu phổi và 110
mẫu thịt của 110 con gà khỏe gồm 55 gà thịt và 55 gà đẻ từ 20 trại gà công nghiệp,
kết quả cho thấy tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà là 62,7% trong đó gà thịt có tỷ
lệ hiện diện E. coli ESBL (85,5%) cao hơn ở gà đẻ (40%). Sự hiện diện của E. coli
ESBL trên mẫu thịt, gan, phổi và phân lần lượt là 13,6%; 7,3%; 19,1% và 62,7%.
vi

CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 11
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu 11
3.1.2 Hóa chất 11
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 11
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 11
3.2.2 Phƣơng pháp phân lập E. coli ESBL 12
3.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 14
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15
4.1 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt khỏe 15
4.2 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà đẻ khỏe 16
4.3 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà công nghiệp 18
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 21
5.1. Kết luận 21
5.2. Đề nghị 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO 22
PHỤ CHƢƠNG 24
1. Một số hình ảnh thu thập đƣợc trong thời gian nghiên cứu 24
2. Kết quả xử lí thống kê 26
vii


MR
Methyl Red
NA
Nutrient Agar
VP
Voges Proskauer

viii

DANH MỤC BẢNG
Hình
Tựa hình
Trang
2.1
Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC
4
3.1
Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
13
4.1
So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt
15
4.2
So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà đẻ
17
2

CHƢƠNG 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Giới thiệu vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaeceae đƣợc bác sĩ ngƣời Đức là
Theodor Escherich (1858 - 1911) phân lập đầu tiên và đƣa ra đặc điểm của vi
khuẩn vào năm 1885. E. coli thƣờng xuất hiện rất sớm bên trong đƣờng ruột của
ngƣời và động vật sơ sinh (sau đẻ 2 giờ), chúng thƣờng ở phần sau của ruột, ít khi
xuất hiện ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trƣờng hợp chúng đƣợc tìm thấy ở
niêm mạc của nhiều bộ phận khác nhau trong cơ thể (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Trong các vi khuẩn đƣờng ruột loài Escherichia coli là loài phổ biến nhất, chúng
sinh sống bình thƣờng trong đƣờng ruột của ngƣời và động vật. Khi các điều kiện
nuôi dƣỡng, khẩu phần thức ăn, vệ sinh thú y kém, sức chống đỡ bệnh tật của con
vật yếu, thì E. coli trở nên cƣờng độc và có khả năng gây bệnh (Đào Trọng Đạt,
1999).
Theo Nataro and Kaper (1998) có 6 nhóm E. coli gây bệnh đƣợc biết đến đó là:
Enteropathogenic E. coli (EPEC) mang yếu tố bám dính và có khả năng xâm
nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột, kèm theo biểu hiện sốt và
tiêu chảy. Vi khuẩn thuộc nhóm này thƣờng gây bệnh ở ngƣời, thỏ, chó, mèo, heo
và có thể ở ngựa.

phát triển ở môi trƣờng đơn giản. E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy
tiện, có thể sống đƣợc ở nhiệt độ từ 5 - 40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C, pH thích
hợp là 7,2 – 7,4, phát triển đƣợc ở pH 5,5 – 8,0.
Trên môi trƣờng EMB (Eosin Methyl Blue) khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi,
bóng, màu thẫm tím, có ánh kim (Lƣu Hữu Mãnh, 2010).
Trên môi trƣờng NA (Nutrient Agar) và môi trƣờng TSA (Trypticase Soy Agar)
sau 18 – 24 giờ ủ trong tủ ấm 37°C hình thành những khuẩn lạc tròn, màu trắng
nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đƣờng kính 2 – 3 mm (Đào Trọng Đạt, 2001).
Môi trƣờng nƣớc thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trƣờng rất đục, có cặn màu tro
nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trƣờng, môi trƣờng có
mùi phân thối. Trên môi trƣờng Meller Kauffman và môi trƣờng Malasit, E. coli
không mọc, môi trƣờng Vinson Blai thì E. coli bị ức chế (Nguyễn Nhƣ Thanh và
ctv., 1997).
Trên môi trƣờng thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn E. coli hình
thành khuẩn lạc to, ƣớt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thƣớc từ 1 – 2 mm, có
thể có hoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng.
Trên môi trƣờng MC (MacConkey Agar) vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc
tròn đều màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2 – 3 mm (Nguyễn
Ngọc Hải, 2012).
4 Hình 2.1: Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC
(http://www.impe-qn.org.vn)
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
Đặc tính lên men các loại đƣờng: Nhóm Escherichia coli gồm những trực khuẩn
di động hoặc không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đƣờng

Kết quả
Di động
Glucose
Lactose
H
2
S
Indole
Methyl red
Voges Proskauer
Citrate
Dƣơng tính
Dƣơng tính
Dƣơng tính
Âm tính
Dƣơng tính
Dƣơng tính
Âm tính
Âm tính
2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên
Cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp, có 3 loại kháng nguyên: kháng
nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên H (Flagellar) và kháng nguyên vỏ K
(Capsular). Cho đến nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 175 type kháng nguyên O, 80
type kháng nguyên K và 56 type kháng nguyên H.
Kháng nguyên O (Somatic – kháng nguyên thân)
Đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng đƣợc coi là yếu tố độc lực của vi
khuẩn. Kháng nguyên O đƣợc coi là ngoại độc tố, đƣợc tìm thấy màng ngoài vỏ vi
khuẩn và thƣờng xuyên phóng thích vào môi trƣờng nuôi cấy. Tất cả kháng
nguyên O đều cƣ trú bề mặt, do vậy có thể liên kết trực tiếp với hệ thống miễn
dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xãy ra phản ứng

ngân và các chất sát trùng nhƣ hỗn hợp amonium, oxy già, formadehyde và
chlorhexidine (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012).
Các chất tiêu độc bình thƣờng nhƣ phenol, formol, vôi ở nồng độ thông thƣờng
cũng làm E. coli chết rất nhanh. Tuy nhiên, ở môi trƣờng bên ngoài các chủng
E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997).
2.1.6 Độc tố vi khuẩn
E. coli là trực khuẩn thƣờng trú ở đƣờng ruột của ngƣời và loài động vật máu
nóng, hầu hết các chủng E. coli đều vô hại. Tuy nhiên do sự suy giảm miễn dịch
hoặc có sự tổn thƣơng niêm mạc ở đƣờng tiêu hóa mà ngay cả chủng E. coli thông
thƣờng cũng có thể gây bệnh. Vi khuẩn E. coli tạo ra 2 loại độc tố là: nội độc tố và
ngoại độc tố (Lê Văn Tạo và ctv., 2006).
Nội độc tố (Endotoxin): thành phần chính Lypopolysacharid (LSP) và Lipid A cấu
tạo nên thành phần tế bào vi khuẩn, khi tế bào vỡ ra thì các chất này đƣợc giải
phóng và gây độc cho tế bào vật chủ, là độc tố chủ yếu của trực khuẩn đƣờng ruột.
Nội độc tố có thể chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học,
chiết xuất bằng axit trichloaxetic hoặc phenol dƣới tác dụng của enzyme. Nội độc

7

tố có cấu trúc polysaccharide thuộc về kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu
cao đối với các chủng của mỗi serotype.
Ngoại độc tố (Exotoxin): do chính tế bào vi khuẩn tiết ra môi trƣờng xung quanh
vi khuẩn trong quá trình sinh trƣởng phát triển của chúng. Loại độc tố này chỉ có ở
vi khuẩn có độc lực, có khả năng gây bệnh. Ngoại độc tố là một chất không chịu
nhiệt, dễ bị phá hủy ở 56°C trong vòng 15 – 30 phút. Dƣới tác động của formol và
nhiệt độ, ngoại độc tố thành giải độc tố. Ngoại độc tố có hƣớng ngoại thần kinh và
gây hoại tử. Hiện nay việc chiết xuất ngoại độc tố chƣa thành công mà chỉ có thể
phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập đƣợc.
2.1.7 Tính gây bệnh
Vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm là nhóm APEC (Avian Pathogenic E. coli)

khuẩn gram âm. Những vi khuẩn sinh ESBL có thể mắc do lây truyền từ ngƣời này
sang ngƣời khác, hoặc do sự chọn lọc do việc dùng kháng sinh (Paterson, 2005).
Một số nghiên cứu E. coli ESBL trên gà ở nƣớc ngoài cho thấy:
Theo Li Yuan et al. (2009), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên
51 mẫu gan gà thịt bệnh tại 14 trại gà ở tỉnh Hà Nam, Trung Quốc với tỷ lệ dƣơng
tính là 60,8%.
Kết quả nghiên cứu của Sunday Akidarju Mamza et al. (2010), khảo sát sự hiện
diện của vi khuẩn E. coli ESBL tại Nigeria ở 400 con gà trên các cơ quan phổi,
lách, ổ nhớp, ruột chiếm tỷ lệ lần lƣợt phổi 16,9%, lách 15,5%, ổ nhớp 4,9% và
ruột 9,7%.
Theo Leverstein - Van Hall et al. (2011), kiểm tra tỷ lệ dƣơng tính E. coli ESBL
trên 98 mẫu thịt gà bán lẻ tại 12 cửa hàng ở Utrecht, Hà Lan là 94%. Trong đó phát
hiện có 39% kiểu gen thuộc các kiểu gen đƣợc tìm thấy ở ngƣời. Nghiên cứu này
cũng cho thấy các gen E. coli sinh ESBL có thể truyền từ gia cầm sang ngƣời
thông qua các thức ăn bị nhiễm E. coli ESBL.
Kết quả của Ilse Overdevest et al. (2011), phân tích 262 mẫu thịt gà ở Hà Lan cho
thấy có 209 mẫu E. coli ESBL dƣơng tính, chiếm tỷ lệ là 79,8%.
Theo Valeria Bortolaia et al. (2010), E. coli ESBL đƣợc sinh ra trên các yếu tố di
truyền di động do đó có thể truyền qua cả chiều dọc và chiều ngang giữa các dòng
vi khuẩn khác nhau.
Theo kết quả nghiên cứu của Annemieke Smet (2008), phân tích 498 mẫu phân từ
5 trại gà thịt công nghiệp ở Bỉ, phát hiện 133 mẫu E. coli ESBL dƣơng tính, chiếm
tỷ lệ 26,7%.
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, tại Việt Nam bắt đầu quan tâm đến các vi khuẩn
gram âm sinh ESBL, tuy vậy vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. Các
nghiên cứu đa phần đƣợc thực hiện với đối tƣợng là ngƣời ở các bệnh viện lớn. Tỷ
lệ vi khuẩn đƣờng ruột sinh ESBL dao động lớn tùy theo từng khu vực, cao nhất là
ở bệnh viện Chợ Rẫy với 61% các chủng Klebsiella và 52,6% các chủng E. coli
sinh ESBL. Ở bệnh viện Việt Đức nghiên cứu cho thấy tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng
tính là 34,2% (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011).

thấm nƣớc, một mặt đƣợc tẩm kháng sinh với các nồng độ khác nhau. Băng giấy
E-test ESBL là một loại băng E-test đặc biệt, có một phần chứa các nồng độ kháng
sinh cephalosporin phổ rộng đƣợc pha loãng từ thấp đến cao, tính bằng µg/ml,
phần còn lại chứa cephalosporin phổ rộng kết hợp clavulanic acid kết hợp. ESBL
bị ức chế bởi clavulanic acid nên E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL sẽ có vùng
ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần còn lại
không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi
khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức
chế hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh cao (Bradford PA, 1994).

10

2.3.4 Phƣơng pháp đĩa kết hợp
Sử dụng một khoanh giấy kết hợp cephalosporin với acid clavulanic 30µg và một
khoanh giấy cephalosporin 30µg. Nếu đƣờng kính ức chế ở khoanh kết hợp lớn
hơn khoanh còn lại 5 mm thì kết luận vi khuẩn sinh ESBL.
Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu với phƣơng pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên
cả hai hệ thống là: ceftazidime 30µg, ceftazidime – acid clavulanic 10µg;
cefotaxime 30µg, cefotaxime – acid clavulanic 10µg (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011).
, nƣớc cất, Natri clorua, thuốc thử VP1 (α-napthol
5%), VP2 (KOH 40%), Kovac’s, BaCl
2
.2H
2
O 1%, H
2
SO
4
1%. MacConkey Agar
(MC), Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Simmons Citrate Agar, Voges
Proskauer (VP), Methyl Red (MR), Trypton Water (Indol), Glyceryl, Muller -
Hilton Agar (MHA).
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Máy autoclave, microwave, tủ lạnh, tủ sấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy khô, cân điện tử,
máy lắc vortex, đĩa petri, đèn cồn, ống hút, ống đong các loại, bếp đun cách thủy,
ống nghiệm, que cấy, que chang, pipet, micropipet các loại, cốc thủy tinh, bình
định mức, cân điện tử, kéo, kẹp, tampon vô trùng, đũa thủy tinh, thƣớc đo vòng vô
khuẩn, thùng trữ lạnh, túi nylon, khẩu trang, găng tay và một số dụng cụ khác.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Số lƣợng gà thu thập là 110 con gồm 55 gà thịt và 55 gà đẻ từ 20 trại gà công
nghiệp tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long.
Mỗi con gà thu thập 4 loại mẫu gồm gan, thịt, phổi và phân.
Số lƣợt phân tích mẫu 110 × 4 = 440 lƣợt. 12

Bảng 3.1: Dung lƣợng mẫu khảo sát

màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2 – 3 mm. Sau đó làm thuần vi
khuẩn bằng cách chọn 10 khuẩn lạc dùng que cấy ria trên môi trƣờng NA đem ủ ở
37
o
C trong 24 giờ. Vi khuẩn E. coli sau khi đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA,
tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trƣờng Trypton
(Indol), MR - VP, Simmons citrate.
Vi khuẩn E. coli thƣờng sinh Indole, khi thử với thuốc thử Kovac’s thì xuất hiện
vòng màu đỏ trên bề mặt.
Phản ứng Methyl Red dƣơng tính, có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng.
Phản ứng Voges Proskauer âm tính, môi trƣờng không đổi màu.
Phản ứng Citrate âm tính, môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây.
Sau khi khẳng định vi khuẩn E. coli, tiến hành pha huyễn dịch vi khuẩn có độ đục
tƣơng ứng với độ đục chuẩn MacFarland 10
8
CFU/ml. Các đĩa kháng sinh bảo
quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất. Không dùng kháng sinh quá hạn, kháng
sinh ẩm ƣớt. Khi lấy từ tủ lạnh ra phải để ra ngoài 1-2 giờ để cho nhiệt độ trong lọ
bằng nhiệt độ phòng.

13

Phƣơng pháp tiến hành: dùng tăm bông vô trùng tẩm huyển dịch vi khuẩn rồi dàn
đều vi khuẩn lên khắp mặt thạch MHA. Chờ mặt thạch khô, dùng kẹp vô trùng để
đặt từng đĩa kháng sinh ceftazidime 30µg, ceftazidime 30µg + acid clavulanic
10µg, cefotaxime 30µg và cefotaxime 30µg + acid clavulanic 10µg lên đĩa thạch.
Đem ủ ở 37
o
C trong 16-18 giờ.
Đọc kết quả: Nếu đƣờng kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh kết hợp với acid

37
0
C/16
h
-18
h
Đo đƣờng kính vòng vô khuẩn

Khẳng định E. coli ESBL (≥ 5mm)

Giữ giống
Hình 3.1: Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
Ceftazidime + acid clavulanic
- ceftazidime ≥ 5 mm

Cefotaxime + acid clavulanic
- cefotaxime ≥ 5 mm
37
0
C/24
h14

3.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
So sánh sự khác nhau giữa các tỷ lệ E. coli sinh men beta – lactamases phổ rộng
bằng phép thử Chi bình phƣơng sử dụng phần mềm Minitab version 16 và Chi
square yates.


Bảng 4.1: Tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng tính trên gà thịt khỏe
Loại mẫu
Số mẫu khảo sát (n=55)
Số mẫu dƣơng tính
Tỷ lệ dƣơng tính (%)
Thịt
15
27,3
ab
Gan
7
12,7
b
Phổi
19
34,5
a
Phân
47
85,5
c
Những chữ số a, b, c trong cùng một cột giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05).
Những chữ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Hình 4.1: So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt khỏe