TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
VÕ QUỐC NGUYỄN

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN TRẦN ĐỀ TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2014

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN E. coli
SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN
GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC
HUYỆN TRẦN ĐỀ TỈNH SÓC TRĂNG

ii TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli sinh beta lactamase phổ
rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng”, do
sinh viên Võ Quốc Nguyễn thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Thú Y, khoa
Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ. Từ tháng 8 đến
tháng 12 năm 2014. Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Giảng viên hƣớng dẫn Huỳnh Ngọc Trang Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng
TÓM LƢỢC
Đề tại được thực hiện để khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli ESBL
trên gà khỏe tại huyện Trần Đề. Qua khảo sát 22 còn gà khỏe tại 2 trại huyện Trần
Đề tỉnh Sóc Trăng bằng phương pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm kháng sinh đồ, từ
tháng 8 đến tháng 12 năm 2014. Kết quả sự hiện diện E. coli ESBL trên gà khỏe có
tỉ lệ khá cao 50%. Sự hiện diện E. coli ESBL trên phân 50%, thịt 4,54%, phổi
18,18%, không phát hiện E. coli sinh ESBL trên gan. Từ 11 mẫu dương tính E. coli
ESBL chon 23 khuẩn lạc E. coli sinh ESBL để kiểm tra tính nhạy cảm với kháng
sinh ghi nhân được vi khuẩn kháng với ampicillin, cofaclor đồng tỉ lệ 100%,
trimethoprim – sulfamethoxazole 95,65% và cefuroxime 86,96%. Tuy nhiên, vi
khuẩn còn nhạy với amikacin, doxycycline đồng tỉ lệ 100%, fosfomycin 95,65%.
Các chủng E. coli ESBL đa kháng từ 4 đến 9 loại kháng sinh với 14 kiểu hình đa
kháng, trong đó kháng cùng lúc 6 loại kháng sinh 43,47% là phổ biến.

vi

MỤC LỤC

TRANG BÌA .i
TRANG DUYỆT ii
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM LƢỢC iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH SÁCH BẢNG viii
DANH SÁCH HÌNH ix
CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli 2
2.1.1 Đặc điểm hình thái 2
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2
2.1.3 Đặc điểm sinh hóa 3

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25
5.1 Kết luận 25
5.2 Đề nghị 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26
PHỤ CHƢƠNG 29 viii

DANH SÁCH BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
3.1
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
15
3.2
Tiêu chuẩn phân tích kết quả đƣờng kính vô khuẩn của kháng
sinh (CLSI, 2014)
16
4.1
Tỉ lệ gà khỏe dƣơng tính với E. coli ESBL
18
4.2
Tỉ lệ dƣơng tính với E. coli ESBL của phân, gan, thịt, phổi
19
4.3
Tỉ lệ dƣơng tính với E. coli ESBL của phân, gan, thịt, phổi
giữa gà thịt và gà đẻ
20

CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, ngành chăn nuôi nƣớc ta đã có những bƣớc phát triển mạnh mẽ cả về số
lƣợng và chất lƣợng, đặc biệt chăn nuôi gà đang khẳng định một vị trí quan trọng
trong việc cung cấp thực phẩm ở đồng bằng song Cửu Long. Song song với việc
phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi cùng với sự thay đổi của môi trƣờng thì
việc xuất hiện dịch bệnh là không tránh khỏi. Để ứng phó với vấn đề dịch bệnh
cũng nhƣ là hạn chế sự bùng phát của mầm bệnh thì sử dụng kháng sinh và thuốc
thú y trong điều trị ngày càng nhiều, tuy nhiên việc sử dụng rộng rãi kháng sinh tạo
điều kiện để vi khuẩn E. coli có khả năng kháng kháng sinh. Trong đó bệnh nhiễm
khuẩn E. coli là bệnh nhiễm khuẩn phổ biến nhất trên gia cầm. Vi khuẩn E. coli
kháng kháng sinh nhóm beta lactam bằng cách sinh men beta lactamase phổ rộng
(ESBL) là một trong những mối nguy hiểm và ngày càng nghiêm trọng gây nhiều
khó khăn trong điều trị. Sự hiện diện của gene ESBL trong E. coli từ động vật sản
xuất thực phẩm nhƣ gà có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời (Laube,
2013).
Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL đã
xuất hiện trên gà khỏe, theo nghiên cứu của Delphine Girlich (2007) có E. coli
ESBL 10,7% có trong phân manh tràng của gà khỏe ở lò giết mổ tại Pháp. Năm
2013, Gundogan and Avci phân lập 66,6% E. coli ESBL trong thịt gà tại Thổ Nhĩ
Kỳ. Theo kết quả nghiên cứu của Stefan Börjesson et al. (2013) có 44% (44/100)
các mẫu thịt gà ở Thụy Điển phát hiện E. Coli ESBL. Tuy nhiên, ở Việt Nam các
nghiên cứu về E. coli ESBL trên vật nuôi nói chung hay trên gà nói riêng chƣa đƣợc
nghiên cứu nhiều. Trần Đề là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng với
nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên, kinh tế phù hợp để phát triển ngành chăn nuôi gà
và đang hình thành một số trang trại chăn nuôi tập trung, công nghiêp với các mô
hình sản xuất liên doanh, do đó việc nghiên cứu sự hiện diện E. coli ESBL là rất cần
thiết. Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli sinh beta lactamase phổ
rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng” đƣợc
thực hiện.
Mục tiêu của đề tài:

C (Hồ Thị Việt Thu, 2012).
Thân E. coli đƣợc bao phủ bởi những sợi protein có chức năng bám dính và giúp cơ
thể di động. E. coli bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở 2 đầu, khoảng
giữa nhạt. Nếu cố định bằng acid osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế bào
E. coli có nhân, đó là một khối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng (Nguyễn Nhƣ
Thanh, 1997).
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, một số chủng
có thể phát triển đƣợc ở các môi trƣờng tổng hợp đơn giản nên ngƣời ta đã chọn
chúng làm mẫu để nghiên cứu về sinh vật học.
E. coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ từ
5-40
o
C, nhiệt độ thích hợp là 37
o
C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4, có thể phát triển đƣợc
ở pH từ 5 - 8 (Lƣu Hữu Mãnh, 2009).
Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng (NA): sau khi ủ 24 giờ ở 37
o
C hình thành khuẩn lạc
tròn, bóng ƣớt, không trong suốt màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng kính 1-3 mm.
Thời gian ủ kéo dài thì khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc lan rộng ra. Chúng ta có
thể quan sát thấy cả khuẩn lạc khô nhăn và dạng trơn, bóng thƣờng đƣợc dùng làm
môi trƣờng lƣu giữ chủng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
3

Trên môi trƣờng MacConkey vi khuẩn lên men đƣờng lactose và hình thành những
khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy.
Môi trƣờng Mueller-Hinton Agar là môi trƣờng trong, dùng cho thử nghiệm tính
nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trƣờng cũng thƣờng đƣợc dùng để thử

acid hữu cơ mà thành hợp chất acetyl methyl carbinol (actoine). Actoine trong môi
trƣờng kiềm cao sẽ bị oxy hóa thành diacetyl. Diacetyl sinh ra sẽ kết hợp với nhóm
guanine của arginine có trong pepton tạo thành phức chất có màu đỏ với thuốc thử α
– naphtol. Khi nhỏ thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ
thì phản ứng dƣơng tính, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì
phản ứng âm tính.
Khả năng sử dụng Citrat trong môi trƣờng có chứa hợp chất sodium citrate, một số
vi khuẩn có khả năng sử dụng đƣợc citrate và làm thừa ra các gốc Na
+
khiến cho
môi trƣờng trở nên chuyển từ xanh lá cây sang màu xanh dƣơng. Trong môi trƣờng
Simmon citrat nguồn cacbon duy nhất là citrat, vi khuẩn sử dụng citrat sẽ kiềm hóa
môi trƣờng làm môi trƣờng đổi từ xanh lục sang xanh lơ. E.coli không có khả năng
sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất, môi trƣờng không đổi màu.
2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh
Vi khuẩn có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 60
o
C trong 30 phút, ở 70
o
C vi khuẩn bị vô
hoạt trong 2 phút, trong điều kiện khô vi khuẩn có thể sống lâu. Vi khuẩn có khả
năng đề kháng với nhiều kim loại nặng nhƣ: arsenic, đồng, kẽm, thủy ngân và các
chất sát trùng nhƣ hỗn hợp ammonium, oxy già, formadehyde và chlorhexidine (Hồ
Thị Việt Thu, 2012).
Các chất sát trùng nhƣ acide phenic, biclorua thủy ngân, formon, hydroperoxid
0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút, nhƣng vi khuẩn đề kháng mạnh với sự sấy khô. Tuy
nhiên, ở môi trƣờng bên ngoài các chủng E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng
(Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Kháng nguyên
Theo Lƣu Hữu Mãnh (2009) cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp bao

bệnh truyền nhiễm kế phát trên cơ sở thiếu vitamin và mắc các bệnh virus và ký
sinh trùng. E. coli thƣờng gây bênh cho gia súc mới đẻ từ 2- 3 ngày hoặc từ 4 – 8
ngày (Lƣu Hữu Mãnh, 2009).
Nguồn lây bệnh E. coli chủ yếu là từ gà bệnh và gà khỏe mang trùng bài xuất mầm
bệnh ra môi trƣờng nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các loài gậm nhấm lây
truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ môi trƣờng ngoài vào
(Nguyễn Xuân Bình, 2005).
2.2 Kháng sinh nhóm beta lactam
2.2.1 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta lactam
Tất cả các kháng sinh nhóm B-lactam đều có vòng B-lactam trong cấu trúc phân tử
Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hóa học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử C và một
nguyên tử N (Nguyễn Thị Vinh, 2007).
2.2.2 Phân loại kháng sinh nhóm beta lactam
Theo Hoàng Tích Tuyền (1998) đƣợc trích dẫn từ Hà Vũ Minh Trang (2012) kháng
sinh nhóm beta lactam gồm có 2 nhóm: peniciliins và cephalosporins.
Phân nhóm peniciliins gồm có: benzylpenicillin, phenoxypenicillin, penicillin
kháng penicillinase, aminopenicillin, carboxypenicillin, ureidopenicillin,
carbapenem.
6

Nhóm kết hợp ức chế beta-lactamase: có tác dụng bất hoạt cầu ESBL. Ví dụ:
Amoxicillin kết hợp clavulanic acid (AMC), ampicillin kết hợp sulbactam (SAM),
hay là piperacillin kết hợp tazobactam (TZP).
Phân nhóm cephalosporin gồm có: Cephalosporins thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và thế
hệ 4. Các Cephalosporins phổ rộng nhƣ cefotazidime, ceftriaxone đƣợc gọi là
oxyimino-beta-lactam. Một số kháng sinh về mặt lý thuyết và thử nghiệm trên
invitro không bị phân hủy bởi ESBL gọi là cephamycin nhƣ: cefoxitin, cefotetan và
cefmetazole. Cephamycin gồm các cephalosporin có chuỗi bên 7a-methoxy bị ngăn
chặn bằng thủy phân do các ESBL và các Beta-lactamase lớp A và lớp D.
2.2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta lactam

tất cả các chủng của cùng một loài, và đƣợc biết ngay từ lúc đầu khi nghiên cứu xác
định hoạt tính của kháng sinh và xác định phổ tác dụng của thuốc kháng sinh.
*Kháng mắc phải
Do đột biến: vi khuẩn có chu kỳ phát triển từ vài giây đến vài phút nên chúng rất
linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi trƣờng, đề kháng do
đột biến xảy ra từ từ và là một tiến trình tích lũy (Võ Thị Trà An, 2012). Việc đột
biến nhiễm sắc thể liên quan tới nhiều kháng sinh mới. Việc xuất hiện các đột biến
có tần suất thay đổi theo vi khuẩn và theo kháng sinh.
Do plasmid: nhiều plasmid khác nhau có thể trùng hợp trong cùng một vi khuẩn và
phối hợp với một sự đề kháng nội tại dẫn đến đa đề kháng
Do transposon các plasmid đề kháng có thể tiến triển in vitro do tiếp thu hay mất đi
lần lƣợt những đặc tính đề kháng, hệ quả của tính chất chuyển giao đƣợc của phần
lớn các gene. Các transposon là hệ quả của ADN có thể đổi chỗ các replicon lẫn
nhau (chuyển vị nội phân tử) hay tại một nơi của cùng một replicon (chuyển vị
ngoại phân tử), mặc dù không có sự tƣơng đồng giữa các ADN mà chúng tác dụng.
Tuy nhiên, đôi khi có những vùng gián tiếp riêng.
2.3.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh
Theo Võ Thị Trà An (2012) các vi khuẩn đề kháng có thể sinh ra một enzym phá
hủy hoặc làm bất hoạt thuốc. Ví dụ: β-lactamase phá vỡ các vòng β-lactam của
penicillin và các phân tử tƣơng tự, biến nó thành dạng không hoạt động. Các tác
nhân gây bệnh đề kháng có thể làm chậm hoặc ngăn ngừa sự xâm nhập của thuốc
vào tế bào. Cơ chế này thƣờng có liên quan đến những sự thay đổi trong cấu trúc
hoặc điện tích của các protein màng tế bào chất tạo nên các kênh hay các lỗ. Các
protein này nằm trong màng ngoài của vi khuẩn Gram âm gọi là các porin. Các
protein porin bị thay đổi bắt nguồn từ những thay đổi trong các gene nhiễm sắc thể.
Các thế bào đề kháng có thể làm thay đổi thụ thể đối với thuốc do vậy nó không thể
gắn vào hoặc liên kết một cách hiệu quả tới đích của nó. Các tế bào đề kháng có thể
làm thay đổi hóa học trao đổi chất của chúng hoặc chúng có thể từ bỏ toàn bộ các
bƣớc trao đổi chất mẫn cảm. Các tế bào đề kháng có thể bơm thuốc ra khỏi tế bào
trƣớc khi thuốc có thể gây tác dụng.

hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm.
Tiêu chuẩn CLSI, 2014 yêu cầu với phƣơng pháp này cần phải thực hiện đồng thời
trên cả hai hệ thống là : cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg);
ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg)
Phƣơng pháp E – test: Dùng que E – test một đầu là dãy chứa nồng độ của
cephalosporin và đầu kia là dãy nồng độ của cephalosporin/ clavulanic acid. ESBL
sẽ có vùng ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần
còn lại không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức
chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh
ức chế. Vi khuẩn sinh ESBL dƣơng tính sẽ có vùng ức chế hình eclip và nồng độ
MIC ở vùng kháng sinh không kết hợp với clavulanic acid tăng gấp 8 lần phần còn
lại.
Phƣơng pháp ChromID ESBL agar môi trƣờng ChromID ESBL chứa kháng sinh
cefpodoxime và chất màu, nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime có
9

khả năng phát triển trên môi trƣờng ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có
màu sắc khác nhau, đặc trƣng cho một số loài vi khuẩn.
Phƣơng pháp Vitek ESBL test phƣơng pháp này dựng card MIC có chứa
cephalosporin nồng độ bắt đầu từ 0,5µg/ml trộn với clavulanic acid nồng độ 4
µg/ml. Kết quả nếu vi khuẩn có ESBL sẽ cho MIC cephalosporin >= 8 µg/ml.
Phƣơng pháp Micro scan panels tấm panel nhựa có 4 giếng chứa môi trƣờng
kháng sinh cephalosporin và cephalosporin/clavulanic acid, cấy vi khuẩn vào các
giếng rồi để vào tủ ấm 18 – 24 giờ đọc kết quả, nếu ESBL dƣơng tính, vi khuẩn sẽ
không mọc ở giếng có cephalosporin kết hợp clavulanic acid.
Phƣơng pháp máy định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ BD Phoenix với 5
hàng giếng có chứa kháng sinh gồm 2 hàng đầu cefodoxime, ceftazidime, và các
hàng sau là ceftazidime kết hợp clavulanic acid, cefotaxime kết hợp clavulanic acid,
ceftriaxone kết hợp clavulanic acid. Nếu vi khuẩn sinh ESBL dƣơng tính, máy sẽ tự
động báo kết quả và cho thông tin liên quan.

ngày càng tăng hiện đang là vấn đề làm hạn chế đáng kể sự lựa chọn điều trị trong
cả y học trên con ngƣời và thú y. Sự hiện diện của gene ESBL trong E. coli từ động
vật sản xuất thực phẩm nhƣ gà có thể gây nguy hiểm sức khỏe con ngƣời. Khảo sát
140 mẫu phân manh tràng trên gà ( 20 mẫu của mỗi trang trại ở 3 thời điểm khác
nhau) và 20 mẫu phân sàn, 21 mẫu chất đệm chuồng, 21 mẫu swab ủng, 83 swab
phân, 21 mẫu rạt bụi (200g phân và 200g rác, khoảng 2 g gộp các mẫu bụi) đƣợc
thu thập từ ít nhất 10 điểm khác nhau trên mỗi lần lấy mẫu từ 7 trang trại khác nhau
ở Đức 2013. Kết quả tỉ lệ E. coli dƣơng tính với ESBL từ mẫu phân manh tràng gà
1-2 ngày tuổi 36,42 % (51/140), gà 14-18 ngày tuổi 53,57% (75/140), gà 26-35
ngày tuổi 54,28% (76/140). Phân sàn 100% (20/20), ổ rơm 95.2% (20/21), swab
ủng 90.4% (19/21), swab phân 54.2% (45/83), mẫu bụi 71.4% (15/21) .
Theo Cindy Dierikx et al. (2012) lấy 25 hoặc 41 bệnh phẩm manh tràng đƣợc thu
thập từ gà thịt ở mỗi 26 trang trại và 18 mẫu phân từ 18 nông dân gà thịt đƣợc phân
tích để xác định sự hiện diện của ESBL. Kết quả gà từ tất cả các trại phân lập
E. coli ESBL có tỉ lệ ≥80% trong 22/26 trại và 33% (6/18) mẫu phân từ nông dân
dƣơng tính với E. coli ESBL. Nghiên cứu này cho thấy một tỷ lệ cao E. coli ESBL
trên gà thịt ở các trang trại Hà Lan và trên nông dân, đây là điều không mong muốn
ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời.
Valeria Bortolaia et al. (2010) thử nghiệm sự nhạy cảm của vi khuẩn E. coli ESBL
với kháng sinh của 67 E. coli ESBL từ 1 trang trại gà giống và 4 trang trại gà thịt
nằm ở Đông Bắc Italy . Lấy 18 mẫu thử kháng sinh đồ trong đó trại 1: gà thịt 12
ngày tuổi (n=3), trại 2: gà thịt 35 ngày (n=2), trại 3: gà thịt 70 ngày (n=8), trại 4:
(n=1) gà thịt 35 ngày tuổi, trại 5: gà giống (n=4). Kết quả 94% (17/18) phân lập
đƣợc kháng với tetracycline, và 83% (15/18) phân lập đƣợc kháng với nalidixic
axit, 44% (8/18) trong số đó đã kháng ciprofloxacin. Sulfon-amide kháng hoặc kết
hợp với trimethoprim đƣợc phát hiện là 22% (4/18) và 55% (10/18) tƣơng ứng.
Nhạy với amikacin, colistin, và imipenem. Đa kháng với 4-5 loại kháng sinh
(33,3%), kháng với 6 loại kháng sinh (5,5%), trên 7 loại kháng sinh (39%).
Theo Nghiên cứu của Randall et al. ( 2011) về tỷ lệ nhiễm E. coli mở rộng phổ
beta-lactamase (CTX-M và TEM-52) từ gà thịt và gà tây trong Vƣơng quốc Anh từ

ứng dụng trƣờng Đại học Cần Thơ.
Đối tƣợng nghiên cứu mẫu gan, thịt, phổi, phân gà đẻ và gà thịt khỏe.
3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, autoclave, máy dập mẫu, cân điện
tử.
Dụng cụ xét nghiệm: khay inox, dao mổ, kéo mổ, pen thẳng, kẹp, pen cong, thùng
bảo ôn, túi nylon, găng tay, tâm bông, cồn , đĩa petri, ống nghiệm, que cấy,
micropipette, đĩa.
Hóa chất Nutrient Agar (Merck KgaA, Germany), MacConkey Agar (Merck KgaA,
Germany), Voges Proskauer (Merck KgaA, Germany), Simmons Citrate Agar
(Merck KgaA, Germany), Methyl Red (Merck KgaA, Germany), Trypton Water
(Merck KgaA, Germany), MHA (Merck KgaA, Germany).
Loại kháng sinh sử dụng:
Ceftazidime (Caz) ( 30µg , ceftazidime 30µg + clavulanic acid 10µg, cefotaxime
(Ctx) 30µg, cefotaxime 30µg + clavulanic acid 10µg, ampicillin (Am) 10µg,
cefuroxime 30µg, cefaclor (Cf) 30µg, tetrecyline (Tc) 30µg, doxycyline (Dc) 30µg,
fosfomycin (Fo) 200µg, trimethoprim - sulfamethoxazole (SXT) 1,25/32,75 µg,
ofloxacin (Of) 5µg, norfloxacin (Nor) 10µg, amikacin (Ak) 30µg, gentamycin (Gm)
10µg, kanamycin (Km) 30µg, streptomycin (Str) 10µg của công ty Nam Khoa.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Chọn ngẫu nhiên 22 con gà khỏe, trong đó có 11 gà đẻ và 11 gà thịt xuất chuồng
không có dấu hiệu của bệnh từ một số trang trại ở huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng
Mẫu phân đƣợc lấy trực tiếp từ lỗ huyệt của gà, dùng bông thấm cồn 70
o
sát trùng
xung quanh hậu môn, dùng que tăm bông vô trùng lấy phân ở lỗ huyệt của gà sau
đó cho vào ống chứa môi trƣờng Cary-Blair để bảo quản mẫu và trữ lạnh để vận
chuyển về phòng thí nghiệm.
Mẫu nội tạng trƣớc khi lấy mẫu sát trùng vị trí lấy mẫu bằng cồn 70


Hình 2 Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL

37
0
C/24 giờ
Tạo huyễn dịch vi khuẩn
(nồng độ 10
8
vi khuẩn/ml)
37
0
C/18 - 20 giờ
37
0
C/24 giờ
37
0
C/24 giờ
14

Mẫu đƣợc cấy lên môi trƣờng MC có kháng sinh ceftazidime 2mg/l . Đối với mẫu
phân ta cấy trƣợc tiếp lên môi trƣờng MC có kháng sinh. Sau khi cấy mẫu lên môi
trƣờng MC ủ ấm ở 37
o
C trong 24 giờ. Trên môi trƣờng MC vi khuẩn E. coli hình
thành khuẩn lạc to, tròn, màu hồng, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2-3mm, ta
chọn 3 – 5 khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli tiến hành cấy trên đĩa thạch môi trƣờng NA
ủ ấm ở 37
o

khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng que cấy, môi trƣờng
xung quanh trong. Trên môi trƣờng VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu
trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton.
Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không
có khả năng sinh aceton.
15

Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt
môi trƣờng vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất
hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại.
Môi trƣờng Simmons’ citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn
carbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính khi
màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lục sang xanh dƣơng.
Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
Thử nghiệm
Kết quả
Glycose
Dƣơng tính
Lactose
Dƣơng tính
H
2
S
Âm tính
Simoms Citrate
Âm tính
Indole