ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HOÀNG THỊ TRANG

SỬ DỤNG CHỈ THỊ SSR ĐỂ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU
TƯƠNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT KHÁC
NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Thái Nguyên - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các

kết quả trình bày trong luận văn là

trung thực, được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn
bố

chưa được ai công

. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ

nguồn gốc.

Tác giả


Hoàng Thị Trang

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN............................................................................................ iii
MỤC LỤC................................................................................................. iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................vi
DANH MỤ.............................................................................................. viii
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................ix
MỞ ĐẦU.................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề.............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu..............................................................................2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3

1.1. NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
CÂY ĐẬU TƯƠNG................................................................................. 3

1.1.1....................................................................................... Cây đậu tương
3
1.1.2.....................................................Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
9
1.2. BỆNH GỈ SẮT VÀ TÍNH KHÁNG BỆNH GỈ SẮT Ở CÂY
ĐẬU TƯƠNG........................................................................................ 10

1.2.1................................................................... Bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
10
1.2.2........................................Tính chống chịu bệnh gỉ sắt của cây đậu tương

2.2.1.............................Phương pháp thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số
27
2.2.2...................Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích mẫu
28
2.2.3................................................................................Phản ứng PCR-SSR
30
2.2.4.............................................Phương pháp điện di DNA trên gel agarose


31

2.2.5...................................Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR
31
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................32

3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR
32
3.1.1.................................Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mầm đậu tương
32
3.1.2.............Kết quả
33

ằng phản ứng PCR- SSR
ỀN CỦA CÁC GIỐ

TƯƠNG KHÁNG BỆ
........................................ 41
......................................................................... 44
KẾT LUẬ................................................................................................. 49



Bp

Base pair

cs

Cộng sự

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium

Bromide DNA Deoxyribonucleic acid
ĐVT

Đơn vị tính

EDTA

Ethylene Diamin

Tretraaxetic Acid EtBr Ethidium
bromide
FAO

Food and Agriculture Organisation – Tổ chức Nông Lương

thế giới ISSR



SSR

Simple Sequence Repeats -trình tự lặp lại đơn


giản STSs Sequence Tagged Site
TAE

Tris – Acetate – EDTA

Tris

Trioxymetylaminometan

XK

Xuất khẩu

USDA

United State Department of Agriculture - Bộ nông nghiệp Hoa

Kỳ UPGMA

Phương pháp phân nhóm

Bảng 1.1. Diện tích thu hoạch đậu tương một số nước trên thế giới......................
4
Bảng 1.2. Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới...............

1.1. Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (20112015)......…9 Hình 1.2.

gỉ sắt

....................................................................................................................
12
ệ

ổng số tách từ mầm đậ

12 giống đậu tương nghiên cứu
....................................................................................................................
32
ới cặp mồi
Satt009- F/Satt009-R
...............................................................................................................................


33
ới cặp mồi
Sat_640 –F
/Sat_640-R
......................................................................................................................
34
với cặp mồi
Sct_187-F
/Sct187-R
......................................................................................................................
35
với cặp mồi

khích phát triển, sản xuất đứng sau lúa, ngô và lạc.
Việt Nam từng là một nước xuất khẩu đậu tương vào những năm
1980, tuy nhiên cho đến nay nước ta đã trở thành nước nhập khẩu đậu
tương với số lượng lớn với hàng triệu tấn khô dầu đậu tương đang được
nhập khẩu hàng năm. Mặc dù diện tích gieo trồng có tăng hàng năm
những năng suất thấp và sản lượng đạt được không ổn định, khả năng
chống chịu bệnh và các stress kém. Sâu bệnh nói chung và bệnh gỉ sắt
nói riêng là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới diện tích gieo trồng và
làm giảm năng suất, chất lượng hạt đậu tương, gây tổn thất lớn về kinh
tế.
Bệnh gỉ sắt ở đậu tương do loài nấm Phakopsora pachyrhizi gây ra
và đang được coi là một trong những mối đe dọa chính trên cây đậu
tương gây thiệt hại đáng kể, làm giảm từ 10-80% năng suất và chất


lượng đậu tương ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam.
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở đậu
tương đã được tiến hành và thu được một số kết quả đáng kể, tuy nhiên
hầu hết các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc giám sát quá
trình phát triển bệnh, nghiên cứu dịch tễ học, đánh giá sự thất thu năng
suất hoặc phân tích phản ứng bệnh mà chưa chú trọng nhiều đến việc tìm
hiểu khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền
của tập đoàn đậu tương có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt không
chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống có khả năng kháng bệnh mà
còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống có chất lượng
cao.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề
tài: “Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của
một số giống đậu tương có khả năng kháng bệnh gỉ sắt khác nhau”.
- Mục tiêu nghiên cứu

súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cải tạo
đất trồng rất tốt.
Về đặc điểm hình thái, đậu tương là cây thân thảo, lá có ba loại: lá
mầm, lá nguyên và lá kép. Hoa đậu tương nhỏ không hương vị, có dạng
cánh bướm. Quả thuộc loại quả giáp, khó tách, hơi cong, lúc quả non có
màu xanh, nhiều lông khi chín có màu nâu. Hạt có nhiều hình dạng: hình
tròn, hình bầu dục, tròn dẹt... có giá trị dinh dưỡng cao. Về đặc điểm di
truyền, đậu tương có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 40 là cây tự thụ
phấn, ít có khả năng thụ phấn chéo. Bộ gen đơn bội của đậu tương có từ


1,29 -1,8 x 109 bp. Thời gian sinh trưởng của đậu tương được chia làm 3
loại: chín sớm, chín trung bình và chín muộn.

Trên thế giới cây đậu tương được coi là một trong những cây
lương thực chiến lược của nhiều quốc gia như Mỹ, Brazil, Argentina,
Trung Quốc, Thái Lan...do khả năng thích nghi rộng với các điều kiện
khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả
năm châu lục, tập chung nhiều tại Châu Mỹ, sau đó là Châu Á. Hoa Kỳ
là nước có diện tích trồng cây đậu tương lớn nhất thế giới và được đầu
tư sản xuất cây đậu tương với quy mô công nghiệp. Diện tích đậu tương
của các quốc gia những năm gần đây luôn biến động, các nước như
Hoa Kỳ, Barazil, Argentina tăng theo từng năm, còn các nước thuộc lục
địa Châu Á lại giảm như Nhật Bản, Việt Nam, Trung Quốc lại giảm trong
các năm gần đây được thể hiện qua bảng 1.1.
Bảng 1.1. Diện tích thu hoạch đậu tương một số nước trên thế giới

Quốc gia

Diện tích thu hoạch (Nghìn ha)

137700

136700

131100

128800

Argentina

18130799

18746227

17577320

19418825

Ấn Độ

9554190

10180000

10840000

12200000

Trung Quốc



hợp quốc (FAO) ().

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, là cây cung cấp dầu quan trọng nhất
trong các cây lấy dầu. Hiện nay qua thống kê của FAO cho thấy từ năm
1980 trở lại đây sản lượng đậu tương thế giới đã tăng lên 2 lần chủ yếu
nhờ vào tăng năng suất và diện tích, tuy có biến động qua các năm.
Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, năng suất bình
quân tăng khá cao 23 tạ/ha. Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu thế
giới: Mỹ, Brazin, Argentina và Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng
sản lượng đậu tương trên thế giới.
Bảng 1.2. Sản lượng sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế
giới

Quốc gia

Sản lượng ( nghìn tấn)
Năm 2010

Năm 2011

Năm 2012

Năm 2013

Hoa Kỳ

227932,4

224594


13050,2

12500,2

Ấn Độ

12736,8

12214

14666

11948

Indonesia

907

843,8

843,2

780

Thái Lan

177,1

176,2


Quốc gia

Năng suất (tấn/ha)
Năm 2010

Năm 21011

Năm 2012

Năm 2013

Brazil

2947,5

3121,4

2636,6

2932,0

Hoa kỳ

2922,4

2819,9

2664,2


1893,9

Indonesia

1372,6

1359,0

1484,8

1416,1

Ấn Độ

1333,0

1199,8

1353,0

979,3

Việt Nam

1509,6

1469,4

1451,7


nhu cầu thấp hơn so với dự kiến, lƣợng xuất khẩu cũng giảm xuống còn

so với năm 2012 do sản lƣợng thấp.
Bảng 1.4. Diện tích, năng suất, tổng sản lượng của đậu tương của
nước ta trong năm 2011, 2012, 2013 và dự báo trong các năm tiếp
theo 2014 -2015

Năm
(nghìn ha)
Năng suất (tấn/ha)
Tổng sản lượng
(nghìn tấn)

2011

2012

2013

2014*

2015*

181,1

119,6

117,8

120

gieo trồng đậu tƣơng năm 2013 và 2014 lần lƣợt đạt 120 nghìn và 130

héc-ta, với mức sản lƣợng tăng nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn. Khả

héc-ta trồng đậu tƣơng thấp hơn so với trồng ngô. Khu vực trồng đậu

1.1: Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt
Nam
(2011-2015)
* Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo

Sự biến động sản lượng, năng suất hay diện tích đậu tương của
nước ta là không cao, dự kiến các năm tiếp theo 2014 và 2015 cũng


tăng không đáng kể, nguyên nhân là người dân và nhà nước vẫn chưa
đầu tư sâu sắc tới cây đậu tương, bên cạnh đó bệnh dịch hại cây hay
điều kiện khí hậu....làm thiện hại đáng kể sản lượng đậu tương.
1.1.2. Đặc điểm hóa sinh của cây đậu tương
Hạt đậu tương có thành phần chủ yếu là protein, lipid,
glucid, các vitamin và các chất khoáng. Trong hạt đậu tương, hàm
lượng protein chiếm từ 30-55%. Protein được dự trữ trong bào
quan có chức năng cung cấp nguồn amino acid và nitơ hoặc là các
enzyme tham gia vào quá trình nảy mầm của hạt. Loại potein được dự
trữ chủ yếu ở hạt đậu tương là globulin..
Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12-25% khối lượng khô.
Chất lượng lipid của hạt đậu tương rất tốt, cho nên nó được sử dụng
rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Hạt đậu tương còn có
các loại vitamin tan trong lipid, đặc biệt là vitamin E. Ngoài ra, trong
hạt đậu tương còn chứa một số chất khác như carbohydrade, muối

việc sản xuất đậu tương ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ, Phòng thí
nghiệm Nghiên cứu Bệnh Thực vật và Trung tâm Nghiên cứu và Phát
triển Rau Châu Á (AVRDC) đã khởi động một dự án hợp tác vào
năm 1978 để nghiên cứu dịch tể học của bệnh gỉ sắt đậu tương. Dự án
hợp tác này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt
đậu tương được tiếp tục tiến hành ở AVRDC cho đến năm 1992.
Ngoài ra, FAO đã thiết lập một mạng lưới nghiên cứu về bệnh gỉ
sắt đậu tương liên kết các nước Châu Á. Chương trình quốc gia của
Thái Lan đã và đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương
với các chương trình lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua
[34]. Ở Indonesia, bệnh gỉ sắt được xem là loại bệnh nghiêm trọng


nhất trên cây đậu tương, xuất hiện cả ở mùa mưa và mùa khô. Các
hoạt động nghiên cứu ở Indonesia bao gồm cải thiện tính kháng , thử
nghiệm thuốc trị nấm, sự tồn lưu của hạ bào tử trên đồng ruộng, quản
lý bệnh gỉ sắt thông qua trồng thử nghiệm và các nghiên cứu về sự
phát tán bào tử.
Dấu hiệu và triệu chứng bệnh: là những chấm màu trong ở phiến
lá, cỡ 1mm, sau lớn dần và chuyển màu vàng rồi nâu, đạt tới kích
thước từ 2-5mm với hình đa dạng, có góc cạnh. Ở mặt dưới phiến lá
xuất hiện lớp bột màu nâu đó là các bào tử hạ của nấm, khi bệnh phát
triển rộng ra trên các lá nó sẽ làm rách phiến lá, các bào tử được phát
tán nhờ gió. Ở điều kiện thích hợp (15-300C), ẩm ướt nó sẽ nảy mầm
và xâm nhập vào lá qua các lỗ khí khổng. Vết bệnh có thể hình thành ở
các bộ phận của cây. Bệnh thường phát triển mạnh vào thời điểm cây
đậu tương ra hoa, từ lá tầng thấp rồi lan lên lá tầng trên, làm lá vàng
khô rồi rụng hàng loạt. Bệnh này xảy ra quanh năm và gây thiệt hại tới
40-50% năng suất hạt.




chọn tạo nhiều giống đậu tương có tính kháng bệnh gỉ sắt cao và năng
suất vợt trội như: giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các
giống khác. Các nước đã đầu tư rất nhiều kinh phí và thời gian vào các
dự án nghiên cứu, có dự án kéo đài tới chục năm như: Mỹ, Brazil,
Trung Quốc… Ở Đài Loan và Thái Lan, nhiều dòng đã được chọn và
sàng lọc thử nghiệm tính chống chịu bệnh gỉ sắt [34]. Dựa trên phần
trăm gia tăng năng suất khi so sánh giữa các dòng, người ta đã xác
định được các dòng tính chống chịu cao hoặc có thể kháng một
phần.Thiệt hại năng suất của các dòng chống chịu này thường ít hơn
so với các dòng có năng suất cao khác. Xu hướng tương tự cũng xảy
ra ở những dòng bị giảm sút ở chỉ tiêu trọng lượng 100 hạt. Các dòng
mang khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt có diện tích lá bị bệnh nhỏ nhất
hoặc có tính kháng một phần dựa trên số lượng vết bệnh trên mắt lá.
Gần đây, cùng với mức độ phần trăm tăng năng suất thì chỉ tiêu chống
chịu stress đã được áp dụng trong đánh giá tính chống chịu bệnh gỉ sắt
bằng cách sử dụng các ô ba chiều để chia các nguyên liệu khảo nghiệm
ra thành bốn nhóm. Mặt phẳng X -Y (X: tính độc bệnh, Y: năng suất
phần trăm) được chia thành bốn đoạn bằng cách vẽ các đường phần
cắt tại điểm chính giữa của trục X và trục Y. Trục Z thể hiện mức độ
chống chịu stress mà một dòng có được ở bất kỳ nhóm nào trong bốn
nhóm.
Bằng kỹ thuật phân tử, những biến đổi ở mức độ alen và tính di
truyền được tìm thấy ở đậu tương. Verma và cộng sự (1996) đã công
bố về những biến đổi alen của SSR ở mức độ cao trong sinh chất
mầm đậu tương [41]. Theo ông, có 28 alen SSR được nhắc lại trong
nhóm 96 kiểu gen đậu tương. Akkaya và cộng sự(1992) đã lập bản đồ
40 locus SSR ở đậu tương cùng với 118 chỉ thị RFLP và RAPD [20]..