B ộ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
___ *____
rĐ à m ^7h i r~Jltíi 'TôcưựỊ,
GÓP PHẦN NGHIÊN cứu
ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
•
•
•
7
.
VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI
(Ganoderma lucidum (Lyess. ex Fr.) Karst.) Ở VIỆT NAM
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1997- 2002)
Hà Nội, tháng 5 năm 2002
BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
___ *____
Sinh viên (ĩ)àjrvL & h ị ^7liu Tỉỗầntị
ọ
cam/ Ơừv
AX c íi a n tíim a Ắ tổ 1i:
3 5 3 C 3 C iU .T 0 ita .y iU A
J q).
c)liíữlVCỊ n c ịư ơ i đ ã t/LLt1C
Let
12
2.1. Nguyên liệu
12
2.2. Phương pháp nghiên cứu
12
Phần III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
14
3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của nấm Linh chi trồng ở
Việt Nam
14
3 .1 .1. Nghiên cứu về hình thái bên ngoài
14
3.1.2. Quan sál bào tử đảm
15
3.] .3. So sánh với nấm Linh chi hoang dại, Trung Quốc, Hàn
Quốc
3.2.6. Sơ bộ xác định số các chất trong sản phẩm thuỷ phân của
căn B bằng sắc ký lớp mỏng
26
3.2.7. Phân lập các chất trong sản phẩm lliuỷ phân của cắn 13
bằng sắc ký CỘI
28
3.3. Nghiên cứu tác dụng chống oxy lioá của dịch chiết nấm
Linh chi
29
3.3.1. Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp
Blagodorop
3I
3.3.2. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan
theo phương pháp của Jawiga Robak và Misno Tanaka
33
Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
4.1. Kết luận
37
:
Malonyl dialdehyd
MeOH
:
Methanol
POL
:
Peroxy hoá lipid
SKLM
:
Sắc ký lớp mỏng
TT
:
Thuốc thử
ĐẶT VÂN ĐỂ
hành nghiên cứu nấm Linh chi trồng ở Việt Nam vói một số nội dung sau:
1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật.
2. Nghiên cứu về thành phần hoá học.
3. Thử tác dụng chống oxy hoá của nấm Linh chi trồng ở Việt Nam.
2
Phần I
TỔNG QUAN
1.1. Vài nét lịch sử về hệ thông học họ Linh chi (Ganodermataceae Donk)
Nấm Linh chi đã được con người sử dụng từ rất lâu song những nghiên
cứu về chúng thực sự mới chỉ bắt đầu từ cuối thế kỷ XVIII [8].
Năm 1781, w . Curtis mô tả mẫu nấm đầu tiên đặt nền móng cho các
nghiên cứu về nấm Linh chi sau này [8, 12, 16].
100 năm sau (1881) nhà nấm học người Phần Lan - Karste đã tách từ họ
Nấm Lỗ Polyporaceae ra một nhóm đặc biệt, xây dựng nên chi mới độc lập là
Ganoderma Karst.. Chi này có cấu trúc bào tử đảm đặc trưng hình trứng cụt, có
lớp vỏ kép, bề mặt sần sùi mụn cóc. [12, 13, 16].
Song song với chi Ganoderma Karst., vào năm 1905, Murill lại phát hiện
ra một nhóm nấm Polypore nữa và ông đề nghị xác lập một chi mới nữa độc
lập là Amauroderma Murr.. Các loài của chi này cũng có độ đồng nhất cao
trong cấu trúc bào tử đảm tương tự như các loài của chi Ganoderma Karst.,
duy chỉ có lỗ nảy mầm đã tiến hoá rõ rệt, khó nhận ra [12,16].
Sau này, nhà nấm học người Hà Lan - Donk - đã nghiên cứu tỉ mỉ quá
trình phân hoá của hai loài Ganoderma Karst. và Amauroderma Murr. và thấy
được mối quan hệ chặt chẽ giữa chúng về cấu trúc bào tử đảm. Chính vì vậy
đến năm 1948, ông quyết định xây dựng họ Linh chi Ganodermataceae Donk
tách ra từ họ nấm Lỗ (Polyporaceae) với hai chi lổn là Ganoderma Karst. và
đảm
Basidiomycetesy, Ngành nấm đảm (Basidiomycotina) và thuộc Giới nấm
(Mycetaỉia).
Ở Việt Nam, nấm Linh chi phân bố chủ yếu ở miền Bắc nước ta đặc biệt
là những nơi có rừng Lim xanh [16]. Ngoài ra còn có ở một số vùng của miền
Nam. Các mẫu đều được sưu tầm từ tháng 3 đến tháng 12 ở miền Bắc và vào
mùa mưa ở miền Nam. Theo những nghiên cứu của các nhà khoa học trong
nước như Trần Văn Mão, Trịnh Tam Kiệt, Đàm Nhận, Phạm Quang Thu, Lê
Xuân Thám... đã phát hiện được trên 40 loài Linh chi ở lãnh thổ nước ta trong
đó chiếm ưu thế và thường gặp nhất là nấm Linh chi (Ganoderma lucidum
(Lyess. ex Fr.) Karst.).
1.2. Đặc điểm hình thái cơ bản của họ Ganodermataceae Donk
Nấm Linh chi là một loài thực vật bậc thấp thuộc ngành Nấm
(Basidiomycotina) nên có đặc điểm chung của ngành là được cấu tạo bởi các
tế bào có nhân thật không có diệp lục, nhận thức ăn từ môi trường bên ngoài
bằng cách hấp thu (sống dị dưỡng) [1]. Ngoài ra còn có các đặc điểm riêng:
4
+ Sợi nấm gồm nhiều đoạn ngăn cách với nhau bởi các vách ngang. Mỗi
đoạn được coi như một tế bào có một hay nhiều nhân. Trên các vách ngang
đó có lề nhỏ, từ đó chất nguyên sinh và cả nhân có thể đi qua [11].
+ Cuống thể quả biến dị lớn: Các loại đa niên thường không cuống còn
các loài có cuống thì rất phong phú: Từ loài có cuống rất ngắn (0,5 cm), rất
mảnh (0,2 cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hoặc rất dài (20-25 cm), to và mập
(đường kính có thể tói 3,3 cm) [11, 13]. Cuống nấm có thể phân nhánh hoặc
không, màu sắc thay đổi khác nhau tuỳ từng loài. Cuống thường đính bên, đôi
khác [12, 18].
Hình 1 : Chu trình sống của nấm Linh chi
Nấm Linh chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ Đậu Fabales)
sống hay đã chết. Thể quả gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 11), có
thể mọc trên thân cây, quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây, thích hợp với
6
bóng rợp, ánh sáng khuyếch tán nhẹ với nhiệt độ ôn hoà. Nên ở các vùng núi
đồi cao trên 1000 m so với mực nước biển, thường có các chủng thích hợp nhiệt
độ thấp từ 21- 26° như các vùng Đà Lạt, Sapa, Tam Đảo, Tây Nguyên ở nước ta
[12].
1.3. Thành phần hoá học của nấm Linh chi
Trong khi ở Tây Âu, các nhà khoa học hầu như chỉ đi sâu vào nghiên cứu
hệ thống học, điều tra cơ bản và các đặc điểm sinh học của các nấm Linh chi
thì ở các nước châu Á, các nhà khoa học lại dẫn đầu về nghiên cứu thành phần
hoá học, trồng và bào chế các loại thuốc từ nấm Linh chi. Thực tế một số tác
giả đã quan tâm phân tích thành phần cấu tạo lớp vỏ láng ở các loài
Ganoderma và Amauroderma vào những năm cuối của thập niên 20 đã phát
hiện các ergosterol và các enzym phenoloxydase, peroxydase ở G. lucidum
(Krebs. G., 1911; Subramanian s., 1961) [12].
Đặc biệt, trong khoảng 20 năm gần đây, nhiều cơ sở nghiên cứu của một
số nước đã xác định thành phần và cấu trúc hoá học của nấm Linh chi và thu
được một số kết quả sau:
- Về định tính: Trong thể quả của nấm Linh chi có polysacarid, acid
amin, họp chất steroid, saponin, protein, alcaloid, dầu béo [5]. Ngoài ra còn
có thành phần / ỉavonoid, song theo những tài liệu chúng tôi tham khảo được
thì flavonuid trong nấm Linh chi còn chưa được nghiên cứu nhiều.
Lanosporeric acid A
Steroid
Lanosterol II, III, IV
Steroid
Ganoderan A, B, c
Polysaccharid
ị3 - D - glucan
Polysaccharid
BN - 3B: 1,2,3,4
Polysaccharid
D-6
Polysaccharid
Ganoderic acid A,
Triterpenoid
B, D,F, H, K, Y, R,s
là Lin%zhi - 8 do các nhà khoa học Nhật Bản (Kino K.et al.19'89 - 1991) tìm ra
đã được chứng minh là một tác nhân chống dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn
dịch rất hữu hiệu [12].
Nhóm Nucleosid có các dẫn xuất của Adenosin vói tác dụng thư giãn cơ,
giảm đau và ức chế sự kết dính tiểu cầu [12, 16].
Nhóm Aỉcaloid có hàm lượng rất đáng kể trong thể quả của G.lucidum.
Alcaloid và Glucosid'. 1,82 - 3,06% [16].
Nhóm Steroid rất phong phú ở nấm Linh chi với tác dụng chủ đạo ức chế
sinh tổng hợp cholesterol. Đặc biệt từ bào tử đảm ngoài 2 lacton A và B còn 5
sterol đã được xác định chính xác công thức phân tử [12].
Nhóm Polysaccharid cũng rất phong phú ở nấm Linh chi và có hoạt tính
cao. Tăng tính miễn dịch, hạ đường huyết.[12]
Bên cạnh đó, các tài liệu tham khảo cho thấy nhiều acid béo tạo nên
thành tố chính của nấm Linh chi đã được định danh. Những acid này có đặc
tính bảo vệ hồng cầu và ngừa được ung loét [3].
Đa dạng nhất và tác dụng dược lý mạnh là nhóm Saponine - trierpenoid.
Trong nhóm này, người ta đã chứng minh được tác dụng giảm đau đến 37,9%
trên chuột thực nghiệm của các acid ganoderic A, B, c và H [23]. Mặt khác,
các kết quả nghiên cứu cho thấy từng Trierpenoỉd tinh khiết riêng rẽ thể hiện
9
hoạt lực thấp hơn khi dùng các phân đoạn tách chưa tinh chế, nghĩa là tổ hợp
các đồng phân của chúng có hiệu quả hơn. Do vậy, ngưòi ta thường dùng dịch
chiết toàn phần từ nấm Linh chi [6, 24].
1.4. Tác dụng trị liệu cơ bản của nấm Linh chi
Theo kinh nghiệm truyền thống của người phương Đông, các tác dụng
chi tiết, cụ thể của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng sau
đây : Kiện não, bảo can, cường tâm, kiện vị, giải cảm, trường sinh [16].
hydroxyl với đặc tính antioxydant, chống lão hoá của G. lucidum [4]. ở Việt
Nam, Tiến sĩ Nguyễn Quang Thường và cộng sự - Trường Đại học Dược Hà
Nội đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng nấm Linh chi có chứa các hoạt
chất chống oxy hoá, chúng có khả năng ức chế quá trình oxy hoá ở chuột
khi gây stress ở nhiệt độ cao, đã làm giảm 25,5% lượng MDA ở não chuột
(P < 0,01). Đây chính là cơ sở để khẳng định giá trị của nấm Linh chi - vị
thuốc trường sinh đối với bệnh của người già và kéo dài tuổi thọ [21].
Hiệu quả chống ưng thư của nấm Linh chi đã được chứng minh từ lâu,
với các bệnh nhân ưng thư phổi, ưng thư vú và ưng thư dạ dày... được điều trị
bằng các phương pháp xạ trị, hoá trị và giải phẫu được kết hợp với trị liệu
nấm. Những bệnh nhân này thòi gian sống kéo dài, tỷ lệ người sống trên 5
năm cao hơn nhóm không sử dụng nấm. Hiệu quả chống ưng thư cũng thể
hiện rõ với các tế bào ưng thư khoang miệng, ưng thư gan, đặc biệt kết hợp với
taxol từ cây Thông đỏ [16].
11
Phần II
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Nguyên liệu
- Nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst. trồng ở Đà Lạt.
- Nấm Linh chi hoang dại thu hái được ở miền Bắc Việt Nam.
- Nấm Linh chi Trung Quốc và Hàn Quốc mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
* Quan sát mô tả hình thái nấm Linh chi nuôi trồng, so sánh với hình thái
của nấm Linh chi hoang dại, nấm Linh chi Trung Quốc, Hàn Quốc theo
phương pháp ghi trong tài liệu Thực tập Thực vật [20] và Thực tập Dược liệu
Tanaka (tại phòng Đông y thực nghiêm - Viện Y học cổ truyền).
* Nguyên tắc của phương pháp:
Đánh giá hoạt tính chống oxy hoá của chất thử (dịch chiết nước toàn
phần của nấm Linh chi) bằng khả năng ức chế quá trình peroxy hoá lipid
(POL) trên cơ chất (gan chuột) khi so sánh với quá trình POL không có mặt
chất thử ở cùng điều kiện. Thực hiện phản ứng POL trên dung dịch đồng thể
gan chuột ở những nồng độ khác nhau của chất thử. Định lượng MDA tạo
thành trên nguyên tắc cho MDA phản ứng với acid Thiobarbituric tạo hợp chất
Trimethin màu hồng, đo cường độ màu của dung dịch sau phản ứng ở bước
sóng X = 532 nm. Hoạt độ chống oxy hoá được tính bằng phần trăm (%) MDA
bị ức chế ở mẫu thử so với mẫu đối chứng (coi HTCO của mẫu đối chứng
bằng không).
13
Phần III
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của nấm Linh chi trồng ở Việt Nam
3.1.1. Nghiên cứu về hình thái bên ngoài:
* Khi quan sát về hình thái bên ngoài của nấm Linh chi nuôi trồng ở Việt
Nam cho thấy một số đặc điểm sau:
- Thể quả có cuống.
- Mũ nấm:
+ Màu nâu đỏ, láng bóng như vécni.
+ Khi còn non có dạng u lồi, hơi tròn, sau này phát triển thành dạng
thận hay hình quạt, kích thước mũ nấm dao động từ 6 đến 1 lcm.
+ Trên mặt mũ nấm có những vân vòng đồng tâm ít lượn sóng và có tia
rãnh phóng xạ xuất phát từ tâm.
Bảng 2: So sánh hình thái bên ngoài và cấu tạo bào tử đảm của nấm Linh chi
nuôi trồnẹ ở Việt Nam với nấm Linh chi hoang dại, Hàn Quốc, Trung Quốc
Đặc điểm
Linh chi trồng
ở Việt Nam
Linh chi
VN hoang dại
Linh chỉ
Trung Quốc
Linh chi
Hàn Quốc
* Mũ nấm :
- Hình dạng
- Kích thước
Dạng thận, quạt Dạng thận
Dạng thận
Hầu như tròn
hay gần tròn
hay gần tròn
Vàng nâu
Mặt dưới vàng
Mặt dưới trắng
Mặt dưới vàng Mặt dưới vàng
kem
đục
Có vân tròn,
Có vân tròn
Có vân tròn
Mũ nấm có
mép lượn sóng
và các nếp nhăn
nhăn nheo
vòng đổng tâm
lưu huỳnh
không phân nhánh, hình trụ tròn
khi đính tâm,
hay hơi dẹt
hình trụ tròn
hình trụ tròn
Hình trứng
Hình trứng
Hình trứng
Hình trứng
Màu nâu
Màu nâu
Màu nâu
Màu nâu
phân nhánh,
hơi dẹt
* Bào tử đảm
(a) Bào tử đảm nấm Linh chi trổng ở Việt Nam; (b) Bào tử đảm nấm Linh chi
3.2. Nghiên cứu vê thành phần hoá học của nấm Linh chi trồng ở Việt Nam
3.2.1. Dùng các phản ứng hoá học xác định sơ bộ các nhóm chất chính
Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3: Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong nấm Lỉnh chi
STT
Alcaloid
1.
Saponin
2.
Flavonoid
3.
Phản ứng
Tên nhóm chất
Tạo tủa với thuốc thử chung:
T.T Mayer
T.T Dragendoff
T.T Buchardat
Anthraglycosid
Phản ứng Bortraeger
Vi thăng hoa
-
Không
5.
Acid amin
Phản ứng Ninhydril
+
Có
6.
Glycosid tim
Phản ứng Legal
Phản ứng Keder
Phản ứng Baljet
-
Không
+
Có
*
Nhân xét: Kết quả ở bảng 3 cho thấy trong thành phần của nấm Linh
chi có một số nhóm chất chính: Saponin, Flavonoid, Sterol, Alcaloid,
Polysaccharid, Acid amin.
18
3.2.2. Sơ đồ chiết xuất các hợp chất trong nấm Linh chi
Từ kết quả định tính ở phần 3.2.1, chúng tôi xây dựng sơ đồ quy trình
chiết xuất một số nhóm chất trong nấm Linh chi như sau:
19
Copyright: Tài liệu đại học ©