Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
Lời cảm ơn
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô
PGS.TS . Đinh Thị Kim Nhung và thầy ThS. Nguyễn Khắc Thanh
đã tận tình hướng dẫn em trong thời gian qua.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong
khoa Sinh-KTNN đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài.
Cảm ơn tất cả các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi để tôi hoàn
thành khoá luân một cách tốt đẹp.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2008
Sinh viên
Nguyễn Thị Huệ
Trường ĐHSP Hà Nội 2
1
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
BảN CAM ĐOAN
Chương 1: Tổng quan tài liệu ...................................................................... 11
1.1. Khái quát chung về rượu vang.............................................................. 11
1.1.1.Thành phần của rượu vang. ................................................................ 11
1.1.2. Các loại rượu vang ............................................................................. 11
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang ở nước ta. ....................................... 11
1.1.4. Tàng trữ rượu vang ............................................................................ 11
1.2. Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae.
..................................................................................................................... 12
1.2.1. Sơ lược về nấm men........................................................................... 12
1.1.2. Hình thái và kích thước của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
..................................................................................................................... 12
1.1.3. Cấu tạo của tế bào nấm men.............................................................. 13
1.2.4. Sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae ................. 14
1.3. Những biến động sinh lý sinh hóa, vi sinh khi lên men rượu vang, khả
năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae .................................. 15
1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang. ..... 18
1.4.1. Nấm men ........................................................................................... 18
1.4.2. Nấm mốc ........................................................................................... 18
Trường ĐHSP Hà Nội 2
3
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
1.4.3. Vi sinh vật làm hỏng vang................................................................. 18
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
2.4.1.1. Phương pháp phân lập , tuyển chọn chủng nấm men ..................... 24
2.4.1.2. Phương pháp hoạt hoá giống. ......................................................... 25
2.4.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men. ................. 25
2.4.1.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào nấm men. .......................... 25
2.4.1.5. Xác định khả năng kết lắng ............................................................ 26
2.4.1.6. Quan sát hình dạng tế bào nấm men trên kính hiển vi ................... 26
2.4.2. Phương pháp hoá học ........................................................................ 26
2.4.3. Phương pháp toán học. ...................................................................... 26
2.5. Phạm vi nghiên cứu. ............................................................................. 27
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài ..................................................................... 27
2.7. Thời gian thực hiện đề tài. .................................................................... 27
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận ............................................... 28
3.1. Thành phần hoá học của táo mèo, dâu và mơ. ..................................... 28
3.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo,
dâu và mơ. ................................................................................................... 28
3.2.1. Tiêu chuẩn chọn chủng ..................................................................... 28
3.2.2. Phân lập chủng nấm men từ dịch quả................................................ 28
3.3. Tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo, dâu và mơ. ........ 31
3.3.2. Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao. ...................................... 32
3.3.3. Khả năng kết lắng của hai chủng nấm men. ..................................... 33
3.3.4. Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng nấm men Saccharomyces
cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống. ................................. 33
3.3.5. Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men TD5 và TD7. .............. 34
Kết luận và đề nghị ...................................................................................... 46
1. Kết luận. .................................................................................................. 46
2. Đề nghị. ................................................................................................... 46
Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 47
Trường ĐHSP Hà Nội 2
6
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
Dang mục chữ viết tắt, bảng và hình vẽ
1. Danh mục chữ viết tắt
Nxb: nhà xuất bản
HLTB : Hàm lượng tế bào.
2. Danh mục các bảng
Bảng 3.1. Thành phần hoá học của táo mèo, dâu và mơ.
Bảng 3.2 . tỉ lệ phối hợp nguyên liệu.
Bảng 3.3. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 72h lên men của hai chủng nấm
men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7.
Bảng 3.4. khả năng lên men ở hàm lượng đường cao.
Bảng 3.5. ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan trong quá trình nhân giống.
Bảng 3.6. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống của hai
chủng nấm men TD5 và TD7.
Bảng 3.7. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men của chủng TD5.
TD7.
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn số lượng tế bào trung bình sau 28h nuôi cấy ở
các giá trị pH khác nhau.
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các
nồng độ KH2PO4 khác nhau.
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng cồn sinh ra trong dịch lênmen ở các
nồng độ KH2PO4 khác nhau.
Trường ĐHSP Hà Nội 2
8
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
đặt vấn đề
1. Lý do chọn đề tài
Rượu vang (wine) đã được biết đến từ thời Hy Lạp Cổ ại, khi con
người lần đầu tiên biết sử dụng đồ uống lên men tự nhiên từ dịch trái nho.
Rượu vang có độ cồn thấp, nhiều vitamin và các chất khoáng có mùi thơm dễ
chịu, có hương vị đặc trưng cho từng loại quả. Rượu vang kích thích tiêu hóa,
tuần hoàn, thần kinh...[3].
ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang mới thực sự bắt đầu những năm
80 của thế kỷ XX, được đánh dấu bằng sự hiện diện của vang Thăng Long.
Sau đó một số cơ sở sản xuất rượu vang khác như vang Gia Lâm, vang Thanh
Ba, vang Đà lạt...[8].
2. Mục tiêu của công trình
Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho lên men vang phối
hợp táo mèo, dâu và mơ.
Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men
Lên men phối hợp với quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình
lên men vang táo mèo, dâu và mơ.
3. Đối tượng nghiên cứu
Quả táo mèo (Docynia indica), quả Dâu (Morus alba L.) [5], quả mơ
(Prunus armeniaca L.)
Chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo, dâu và mơ.
4. ý nghĩa lý luận và thực tiễn của công trình.
Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng
lên men vang phối hợp, góp phần bổ sung cho các nghiên cứu về nấm men và
ứng dụng của nấm men trong đời sống.
Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có của địa phương nhằm sản suất
một loại vang phù hợp thị hiếu người tiêu dùng góp phần làm phong phú thị
trường vang trong nước.
Trường ĐHSP Hà Nội 2
10
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
Chương 1
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
vang trắng chuyển sang vang vàng thậm chí đỏ nâu. Thành phần axit tăng, độ
cồn giảm, este và hương vị tăng lên. Do vậy, trong công nghệ cổ truyền thì
người ta cần tránh can thiệp nhân tạo khi bắt buộc điều chỉnh ở mức độ tối
thiểu một số chỉ tiêu lý hóa. Ngược lại trong thực tế cơ chế thị trường đã thúc
đẩy nhà sản xuất phải sử lý tăng tốc độ tàng trữ bằng các giải pháp công nghệ
lọc, ly tâm, lạp khí co2 làm lạnh.
1.2. Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae
nấm men đóng vai trò quyết định trong sản xuất rượu vang vì quá trình
trao đổi chất của tế bào nấm men là quá trình chuyển hóa nguyên liệu thành
sản phẩm.
1.2.1. Sơ lược về nấm men
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản
chủ yếu bằng nảy chồi. Nấm men phân bố khá rộng trong tự nhiên (đất, nước,
không khí, trong lương thực thực phẩm, hoa quả ....) nhiều loại nấm men có
khả năng lên men rượu vì vậy từ lâu con người đã biết sử dụng nấm men để
nấu rượu, bia, sản xuất cồn....
Nấm men sinh sản theo lối nảy chồi lên sinh sản nhanh chóng, sinh
khối của chúng giàu protein, vitamin và lipit. Vì vậy nấm men được sử dụng
để sản xuất thức ăn bổ sung cho con người, gia súc , gia cầm, đặc biệt trong
ngành công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát, nước
chấm, ....
Tuy nhiên, bên cạnh một số nấm men có ích cũng còn một số loại có
Chất nguyên sinh: Màng chất nguyên sinh là lipoprotein, chúng ăn sâu
vào chất nguyên sinh tạo thành mạng lưới nội chất gồm 2 lớp và rầy 30 40
Ao. Màng chất nguyên sinh có chức năng chủ yếu là chủ động điều hòa việc
hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào và nhờ có hệ enzym pecmease mà có chất
dinh dưỡng được hấp thụ và tích lũy lại trong tế bào. Chất nguyên sinh của tế
bào nấm men có một số bào quan như:
Ty thể: có hình bầu dục hoặc dạng hạt và có thể thay đổi tùy thuộc
vào điều kiện của môi trường cũng như trạng thái sinh lý của tế bào. Ty thể có
màng trong suốt, mỏng (60-80 A0) có tính thấm cao, màng có cấu tạo 2 lớp,
lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lược, lớp ngoài có cấu
trúc bằng nhiều đơn vị hình thái. Có khoảng 10 20 ty thể trong một tế bào
nấm men, chúng tham ra vào quá trình sinh trưởng tế bào, sự hình thành và
nảy chồi của bào tử.
Trường ĐHSP Hà Nội 2
13
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
Phức hệ golgi: Là nơi giải phóng các sản phẩm của quá trình dị hóa,
đồng thời tổng hợp oligosaccarit từ monosaccarit cho màng tế bào
Lizoxom: Có chứa nhiều loại enzym có khả năng phân giải protein,
lipit, polysaccarit.
Ngoài ra, trong tế bào nấm men còn chứa một hệ thống không bào hình
thành từ thể golgi hay mạng lưới nội chất. Không bào có tính thấm cao và là
Nguyễn Thị Huệ
cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ để tạo ra một tập hợp tế bào nấm men
hình cành cây gọi là khuẩn ty giả.
Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi:
Nấm men có khả năng hình thành bào tử túi. Bào tử túi của nấm men là
những bào tử được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi chứa 4
- 8 bào tử túi. Nấm men được tạo thành theo phương thức sinh sản đơn tính, là
quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử
túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men.
1.3. Những biến động sinh lý, sinh hóa, vi sinh khi lên men rượu vang,
khả năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae
Lên men là quá trình sinh lý phức tạp được diễn ra dưới tác dụng xúc
tác của hệ enzym tế bào nấm men mà con đường chính là từ glucoza biến đổi
thành rượu etylic và co2 bên cạnh đó còn nhiều sản phẩm phụ như glyxerin,
axit axetic, axit lactic, ete và rượu bậc cao.
C6H12O6
2C2H5OH
+
2CO2
+
Q
Quá trình lên men rượu xảy ra theo 5 giai đoạn
nhờ
enzim
photphofructokinase chuyển thành fructo-1,6- điphotphat
Trường ĐHSP Hà Nội 2
15
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
ATP
ADP
Fructo 6- photphat
fructo-1,6- điphotphat
Giai đoạn 2: Cắt mạch cacbon
fructo-1,6- điphotphat dễ dàng biến đổi thành 2 phân tử trioz photphat
(đihiđroxiaxetonphotphat và Glyxerandehit- 3 photphat) nhờ enzym aldolase.
hai trioz photphat này có thể chuyển hóa lẫn nhau nhờ một enzym đồng phân
( trioz photphat izomerase).
Aldolase
Fructo-1,6- điphotphat
Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit pyruvic
Trường ĐHSP Hà Nội 2
16
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
Dưới tác dụng của enzym photphat Glyxeratmutase mà axit 3 photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 photphoglyxeric. Sau đó axit 2photphoglyxeric chuyển thành axit photphoenolpyruvic nhờ enzym Enolase.
Dưới tác dụng của enzym pyruvatkinase mà axit 2- photphoenolpyruvic
chuyển thành axit pyruvic.
photphat Glyxeratmutase
Axit 3 photphoglixeric
Axit 2 photphoglyxeric
Enolase
H2O
ATP
Dạng xeton
ADP
Dạng enol
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
- glyxero P đehidrogenase
Đihiđroxiaxeton P
L - - Glixero P
NADH+H+
H2O
NAD+
PV
Glixerin
Phương trình tổng quát của quá trình lên men là:
C6H12O6 + 2ADP +2H3PO4
2C2H5OH
+ 2CO2 + 2ATP+ H2O
Như vậy, sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy quá trình oxi hóa
khử có enzym trong tế bào nấm men tham gia.
1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang
1.4.1. Nấm men
Nấm men được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng nấm men
ngon [3].
do vậy, để bảo quả rượu vang người ta có thể thanh trùng Pasteur nhưng nó
lại làm giảm chất lượng vang. Ngoài ra còn dùng phương pháp vi lọc hoặc
dùng một số chất bảo quả phổ biến như SO2 ( 75-120mg/l) [9].
1.4.4. Bệnh vang
bệnh vang đã được Pasteur nghiên cứu và khám phá. Bệnh vang luôn là
vấn đề quan tâm của các nhà sản xuất rượu vang. Đó là hiện tượng vang bị
chua chất lượng rượu vang bị giảm rất nhanh. Nguyên nhân do rượu vang bị
tiếp xúc với không khí và do dưới tác dụng của vi khuẩn lactic đã biến cồn
thành axit axetic hoặc có thể do vi sinh vật lên men trong điều kiện kị khí gây
ra.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men
nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là các hợp chất hữu cơ ở dạng rễ
hấp thu và các chất vô cơ ngoài ra còn cần một lượng nhỏ chất kích thích sinh
trưởng và nguyên tố vi lượng.
1.5.1. Nguồn Cacbon
Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng
enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất.vì vậy những hợp chất
cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men. Nguồn thức ăn chủ
yếu của nấm men là hiđratcacbon nó đáp ứng 3 nhu cầu [6].
Sản sinh năng lượng
Tạo tiền chất
Thực hiện các quá trình oxi hóa khử
Trường ĐHSP Hà Nội 2
19
K30C - Sinh
micromol/l thì hệ thống xitocrom b, c1, c, a, a3 sẽ vắng mặt [2].
Trường ĐHSP Hà Nội 2
20
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
1.6.1. ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men
và ảnh hưởng đến quá trình lên men cũng như chất lượng của rượu thành
phẩm. Nhiệt độ < 200C sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp; Nhiệt
độ 350C
quá trình lên men dừng lại lượng đường sót cao vi khuẩn hoạt động, đặc biệt là
vi khuẩn chuyển hóa đường thành axit axetic gây chua và giảm chất lượng
vang. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 20 280C.
1.6.2. ảnh hưởng của nồng độ cồn
quá trình lên men luôn sinh ra một lượng cồn. Nồng độ cồn thích hợp
cho rượu vang là 9-14% tính theo thể tích. Nếu nồng độ cồn cao sẽ làm tê liệt
hoạt động sống của tế bào nấm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hóa
hiđratcacbon và nitơ.
1.6.3. ảnh hưởng của pH
Ban đầu pH của dịch lên men giảm do hình thành các axit hữu cơ, sau đó
nhiều hay ít ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu hàm lượng giống
thấp thì thời gian nhân giống và lên men sẽ kéo dài hơn dễ bị nhiễm khuẩn.
Ngược lại, nếu hàm lượng giống cao thì thời gian lên men ngắn hơn, hạn chế
được khả năng nhiễm khuẩn nhưng nó lại làm thay đổi thành phần môi trường
lên men và sẽ không có lợi cho qúa trình lên men và chất lượng rượu vang.
hàm lượng giống thích hợp nhất trong dịch lên men là 8-10%.
1.6.6. ảnh hưởng của SO2
Nấm men có khả năng chịu đựng được sự ức chế bởi so2 làm tăng hiệu
suất lên men.
1.6.7. ảnh hưởng của nồng độ oxi
Nồng độ oxi hòa tan giúp nấm men sinh sản và phát triển quyết định
đến hiệu suất lên men và chất lượng của vang, việc cung cấp oxi cho quá trình
lên men vang làm mất đi một số sản phẩm lên men không cần thiết.
Khi môi trường có đầy đủ oxi thì tế bào nấm men sẽ sử dụng đường làm
nguồn năng lượng để tăng sinh khối. Khi môi trường thiếu oxi thì nấm men
tiến hành hô hấp kỵ khí và chuyển thành rượu.
Trường ĐHSP Hà Nội 2
22
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
Chương 2
đối tượng và phương pháp nghiên cứu
: 1g
Thạch Agar
: 20g
Nước cất
: 1000ml
2.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) g/l
Đường glucoza : 50g
Pepton
: 5g
Trường ĐHSP Hà Nội 2
23
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
MgSO4.7H2O
: 0,5g
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Các phương pháp vi sinh
Để có được chủng nấm men tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn theo các
bước sau:
2.4.1.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn chủng nấm men
2.4.1.1.a. Xử lý nguyên liệu và tạo nguồn nấm men để phân lập
Nguyên liệu để sản xuất rượu vang là táo mèo, dâu và mơ. Cả 3 loại quả
trên thu hoạch về cần phải được chọn những quả chín, không dập nát. Sau đó
đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh rồi để ráo nước. Cho các quả
đó vào các ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1. Riêng đối với táo mèo nên
khía các đường nhỏ quanh quả, khoảng 2 ngày khuấy trộn 1 lần. Sau 1 tháng
ta thu được một thứ siro nước quả có nồng độ đường khoảng 60-80% và nhiều
chất khác được chiết ra từ thịt quả. theo dõi dịch lên men, để giữ màu sắc tự
nhiên của dịch siro quả nên bổ sung chút cồn vào và tiến hành phân lập.
2.4.1.1.b. Phân lập giống nấm men
Dịch quả đã được pha loãng 10-1-10-10 bằng nước cất. Nhỏ 1-2 giọt
huyền phù với độ pha loãng 10-9 lên trên bề mặt thạch, dùng bàn trang thuỷ
tinh vô trùng dàn đều, gói kín và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 24-280C trong 2
Trường ĐHSP Hà Nội 2
24
K30C - Sinh
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Huệ
VLT : Nồng độ cồn tính theo lý thuyết
2.4.1.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào nấm men
Để đếm số lượng tế bào nấm men sử dụng buồng đếm hồng cầu
Goriaev. Cấy giống vào môi trường nhân giống nuôi ở nhiệt độ 280C lắc đều
Trường ĐHSP Hà Nội 2
25
K30C - Sinh
Copyright: Tài liệu đại học ©