BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN
SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
LÔNG GIA CẦM CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS MEGATERIUM V1

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

SINH VIÊN THỰC HIỆN
LÂM KIỀU DIỄM
MSSV: 3103948
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

LỜI CẢM TẠ
----------------------Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:
Ban Giám Hiệu, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh
học, cùng tập thể quý Thầy, Cô - trường Đại học Cần Thơ đã dạy bảo, truyền đạt kiến
thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
TS. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và đóng
góp ý kiến quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Cô Nguyễn Thị Pha – Cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học, khóa 36 – trường Đại
học Cần Thơ đã động viên, an ủi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện
và hoàn thành luận văn này.
Tập thể lớp Vi sinh vật học, khóa 36 cùng lớp bạn Công nghệ Sinh học, khóa 36
đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi về mặt vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận
văn tốt nghiệp.
Kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực, luôn có
cống hiến quý báo cho sự nghiệp giáo dục.
Xin chân thành cảm ơn!


Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ......................................................................................................
LỜI CẢM TẠ...............................................................................................................
TÓM LƢỢC................................................................................................................ i
MỤC LỤC ..................................................................................................................ii
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. iv
CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................. vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài................................................................................................... 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 2
2.1. Sơ lược về lông gia súc – gia cầm...................................................................... 2
2.2. Cấu trúc keratin ................................................................................................. 3
2.3. Enzyme keratinase ............................................................................................. 4
2.4 Sơ lược về vi sinh vật phân hủy keratin ............................................................. 5
2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme keratinase của lông
gia cầm..................................................................................................................... 6

sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn ........................... 16
3.2.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự
phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn ................................ 17
3.2.6. Phương pháp phân tích.............................................................................. 18
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 20
4.1. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian ........................................... 20
4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia
cầm của vi khuẩn.................................................................................................... 21
4.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng
phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn ....................................................................... 24
4.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triể n và khả năng phân
hủy lông gia cầm của vi khuẩn ............................................................................... 28
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 31
5.1 Kết luận............................................................................................................ 31
5.2 Đề nghị............................................................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 32
PHỤ LỤC .....................................................................................................................

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG

Hình 4. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến khả năng phân
hủy bột lông của vi khuẩn .............................................................................. 26
Hình 5. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số vi khuẩn 28
Hình 6. Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến khả năng phân
hủy bột lông của vi khuẩn .............................................................................. 29
Hình 7. Biểu đồ ảnh hưởng sự tương tác pH và nhiệt độ đến mật số vi khuẩn.................
Hình 8. Biểu đồ ảnh hưởng sự tương tác pH và nhiệt độ đến khả năng phân hủy bột
lông của vi khuẩn………………………………………………………………..

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CÁC TỪ VIẾT TẮT

B.

Bacillus

NXB

Nhà xuất bản



Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam đang trong quá trình đẩy mạnh công nghiệp hóa – đô thị hóa và cùng
với đó là sự gia tăng các loại rác thải, do vậy công tác quản lý rác thải cần được thực
hiện một cách nghiêm ngặt để tránh ô nhiễm môi trường. Một trong những loại rác thải
khó phân hủy là rác thải được thải ra trong quá trình chăn nuôi và giết mổ gia súc – gia
cầm, phế phẩm lông là khó xử lý nhất do thành phần chính của chúng là keratin, một
loại protein có khả năng chống lại các tác nhân phân hủy cao, cần thời gian rất lâu để
phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên.
Chất thải lông gia súc – gia cầm thường được xử lý bằng cách chôn lấp hoặc đốt
cháy và thậm chí là thải trực tiếp ra môi trường, gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi
trường đất, nước và không khí, cho nên đòi hỏi cần phải có biện pháp xử lý mới tốt
hơn cho các loại phế phẩm này; mục tiêu là vừa có khả năng phân hủy chúng và không
gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. Công nghệ sinh học mà cụ thể là công nghệ vi
sinh vật chính là chìa khóa quan trọng để giải quyết vấn đề này. Do bản chất của lông
là protein nên vi khuẩn hoàn toàn có khả năng phân hủy được chúng thông qua hoạt
động của hệ enzyme keratinase. Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 được Phạm
Minh Triết (2013) phân lập và đánh giá là một trong những chủng vi khuẩn có khả
năng phân hủy lông gia súc – gia cầm đạt hiểu quả cao. Tuy nhiên, sự phát triển cũng
như khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn này phụ thuộc rất nhiều vào
điều kiện môi trường nuôi cấy. Do đó, việc xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy
thích hợp là một nghiên cứu cần thiết trước khi đưa chủng vi khuẩn này vào ứng dụng
thực tế.
Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng
đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn


922,0

Alanine

28,8

Glycine

51,8

Isoleucine

39,4

Leucine

56,9

Valine

53,0

Phenylalanine

34,6

Arginine

67,6


65,8

Methionine

7,1

(*Nguồn: Latshaw et al., 1994)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Protein chiếm hơn 90% trong thành phần lông vũ, trong đó chủ yếu là  - keratin,
nên chất thải lông được xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những
nguồn protein đắt tiền khác để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi. Nước ta là
nước công nghiệp hóa – hiện đại hóa nhưng việc sản xuất lông vũ làm thành phần bổ
sung trong thức ăn gia súc chưa được ứng dụng rộng rãi do quy trình sản xuất theo
phương pháp vật lý và hóa học còn nhiều hạn chế. Không những tiêu tốn năng lượng
và gây ô nhiễm môi trường, quy trình sản xuất này còn phá hủy một số acid amin, làm
cho sản phẩm khó tiêu hóa và nghèo nàn về giá trị dinh dưỡng (Wang và Parsons,
1997).
Ngày nay, công nghệ vi sinh vật đang trên đà phát triển mạnh mẽ và đã mở ra


Trường ĐHCT

hủy keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính enzyme keratinase tạo ra (Onifade et al., 1998;
Riffel và Brandelli, 2006).

Hình 1. Cấu trúc của keratin
(*Nguồn: http://anthonydynar.blogspot.com/2013/05/science-of-perms.html, ngày 27/08/2013)

2.3. Enzyme keratinase
Keratinase thuộc họ protease có khả năng tấn công các mạch keratin và đóng vai
trò quan trọng trong ứng dụng phát triển các phụ phẩm lông vũ giá thành thấp thành
thức ăn chăn nuôi và phân bón. Keratinase là một loại enzyme ngoại bào, hoạt động
mạnh với khoảng pH và nhiệt độ rộng. Enzyme này có nhiều đặc trưng bề mặt, chúng
có thể phân giải protein có sợi như: fibrin, elastin, collagen và các protein không có sợi
như: casein, albumin trong huyết thanh bò, gelatin,...
Tuy keratin là một dạng protein khó bị phân hủy, nhưng thực tế ngoài tự nhiên
các dạng cơ chất chứa keratin như lông, móng, sừng,… vẫn bị phân hủy. Điều này có
được là do hoạt động của các vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng
sinh ra keratinase. Tuy nhiên, khả năng tạo ra keratinase của vi sinh vật phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như chủng vi sinh vật, nguồn cơ chất và cả điều kiện của môi trường. Đây
được xem như một nguồn enzyme quan trọng có khả năng ứng dụng vào nhiều lĩnh
vực khác nhau như công nghiệp thuộc da, phân bón, thức ăn chăn nuôi, y dược,…

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


rất đa dạng. Khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám.
Trong số các chủng Bacillus sp., Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis được
mô tả có khả năng phân hủy keratin tốt (Manczinger et al., 2003). Bacillus
licheniformis là vi khuẩn Gram dương, được tìm thấy nhiều trong đất, nhiệt độ tăng
trưởng tối ưu khoảng 30°C, sinh enzyme tối đa ở 37°C và có khả năng sinh bào tử ở
môi trường khắc nghiệt.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hình thành bào tử, hô
hấp hiếu khí và nó được tìm thấy trong đất. Bacillus megaterium phát triển ở nhiệt độ
từ 3 – 45oC, tối ưu khoảng 30oC. Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã
được tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên đến 63oC. Bacillus megaterium đã được sử
dụng trong công nghiệp hơn 50 năm, vì nó sở hữu một số enzyme rất hữu ích và là
nguồn sản xuất exoenzymes dồi dào, vi khuẩn này được chọn lọc về khả năng của
chúng để phân giải các chất hữu cơ và khả năng chuyển hóa các protein, carbohydrate,
các chất béo, các chất dầu và các acid hữu cơ. Nó được ứng dụng rộng rãi trong xử lý
môi trường.
Các dòng vi khuẩn mới được phân lập có khả năng phân giải keratin được tìm
thấy là các vi khuẩn Gram dương như: Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003),
Microbacterium sp. (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006). Một số


biệt theo loài và vì thế thay đổi tùy theo từng dòng vi sinh vật. Các giá trị pH kiềm
nằm trong khoảng từ 6 – 9 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase và sự phân hủy lông gia
cầm ở hầu hết các vi khuẩn. Giá trị pH kiềm được cho là kích thích sự phân hủy
keratin do làm biến đổi các cystine thành lathionine khiến cho keratinase dễ dàng tiếp
cận cơ chất. Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase nằm trong khoảng từ 28 – 50oC
ở hầu hết các vi khuẩn. Dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp. kr6 phát triển tối ưu ở
nhiệt độ 30oC và pH 8,0 và hoạt động phân hủy lông vũ cũng biểu hiện tối đa ở nhiệt
độ này (Riffel et al., 2003). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn
thuộc họ Vibrionaceae từ một cơ sở sản xuất gia cầm ở Brazil được ghi nhận là 30oC,
và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme và các protein hòa tan được tạo ra cực đại
(Sangali et al., 1999). Theo Sinoy et al. (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng
Bacillus sp. phát triển thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30oC – 40oC và pH tối ưu là 6 –
8, hoạt độ keratinase cũng thu được cao nhất trong khoảng nhiệt độ, pH này.
2.5.2 Các yếu tố dinh dƣỡng

 Nguồn carbon
Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2,
NaHCO3, CaCO3,...) hoặc chất hữu cơ. Fructose, glucose, sucrose, lactose, galactose,
starch, glycerol, maltose và dextrose là những nguồn carbon tốt nhất đối với quá trình
sản sinh ra enzyme keratinase bằng vi sinh vật. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ
các nguồn thức ăn carbon khác nhau phụ thuộc vào 2 yếu tố: một là thành phần hóa
học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi
sinh vật. Trên thế giới hầu như không có hợp chất carbon hữu cơ nào mà không bị
hoặc nhóm vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải. Không ít vi sinh vật
có thể đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu
mỏ, parafin, khí thiên nhiên.
Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử
quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân
để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấu thụ. Người ta thường sử dụng đường


Nước

20

17 – 25

Saccharose

35

30 – 40

Glucose

7

4–9

Fructose

9

5 – 12

Các chất khử khác

3

1–5


Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường được chia thành 3 phần: đường, chất hữu cơ
không đường và chất khoáng. Các loại glucide hòa tan (đường đôi và đường đơn) là
thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu. Bên cạnh
đó, rỉ đường là một nguồn giàu chất khoáng, vitamin – kích thích sự sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Theo kết quả nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), bổ sung nồng độ rỉ đường
với 1% thúc đẩy sự hoạt động của enzyme phân hủy lông gia cầm ở dòng vi khuẩn
Bacillus licheniformis MZK-3.

 Nguồn nitơ
Các nguồn nitơ hữu cơ như: bột ngô, bột đậu nành, cám mì, casein, peptone,
tryptone, yeast extract, sữa không béo,... và các nguồn nitơ vô cơ như: urea, NH4NO3,
NH4Cl, NO2-, NO3-,... thích hợp cho các vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, sản sinh
nhanh enzyme thúc đẩy quá trình phân hủy lông gia cầm. Brandelli (2000) sử dụng
nguồn nitơ bổ sung là yeast extract và NH4Cl cho hiệu quả phân hủy keratin đáng kể.
Các dạng nitơ hữu cơ không những là nguồn dinh dưỡng nitơ mà còn là nguồn dinh
dưỡng carbon cho vi sinh vật. Theo nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), NH4Cl

Tro tan trong acid clohidric

Không quá 1,8%

(*Nguồn: http://www.dost-bentre.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=1246,
ngày 26/11/2013)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Trong bã đậu nành vẫn giữ được khá đầy đủ các acid amin của đậu nành; 1kg bã
đậu nành có 0,8g canxi, 0,6g phosphate. Bã đậu nành thường dùng trong chế biến thức
ăn gia súc, gia cầm và thức ăn thủy sản, vì vậy đây là nguồn nguyên liệu giá rẻ thích
hợp dùng làm chất cảm ứng sinh enzyme keratinase.
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin còn rất
hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu về phân lập vi sinh vật phân hủy lông vũ và vẫn
chưa có nghiên cứu ứng dụng vào thực tế. Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan
Hương (2001) đã tiến hành phân lập được từ đất cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ
khuẩn và 15 chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng
xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng phân giải lông gà mạnh.

Nguyễn Thu Hiền et al.(2010), viện khoa học và công nghệ Việt Nam, cũng đã
phân lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân giải lông vũ.
Nguyễn Đình Quyến và Lê Thị Thu Huyền (2012) cũng thực hiên một nghiên
cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis dòng Kr2 có khả năng phân giải lông gà, pH tối
ưu cho sự phát triển và sinh enzyme keratinase tối ưu của dòng này là 7 – 8, nhiệt độ
35C, nồng độ lông là 20g/l.
2.6.1 Tình hình nghiên cứu ở nƣớc ngoài
Gupta và Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về keratinase từ vi khuẩn và
ứng dụng của enzyme này. Trong đó, keratinase chỉ được sinh ra trong điều kiện môi
trường có sự hiện diện cơ chất có chứa keratin như lông, tóc, móng,… cơ chế phản
ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy phân protein.
Keratinase được ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm sạch và
làm giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp.
Mohammad et al. (2007) nghiên cứu sự phát triển và hoạt tính keratinase của
dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 phân lập từ chất thải gia cầm. Dòng vi
khuẩn này phát triển và sinh enzyme tốt nhất ở điều kiện pH 8,0 và nhiệt độ 40°C. Khả
năng phân hủy keratin tăng 12% trong môi trường có bổ sung NH 4Cl với tỉ lệ 0,1%
(w/v) và tăng 30% khi bổ sung rỉ đường với tỉ lệ 1% (w/v).
Bo Xu et al. (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là
Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90oC) và pH rộng (6 – 10).
Nhiệt độ tối ưu là 60oC và pH tối ưu từ 7,5 – 8.
Onuoha et al. (2011) đã chọn ra dòng vi khuẩn Bacillus sp. D4 có khả năng phân
hủy lông vũ cao, pH tối ưu của dòng vi khuẩn này là 10 và phát triển tốt nhất ở nồng
độ bột lông từ 6 – 7% (w/v).
Hai dòng vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis có khả năng phân
hủy tóc, móng và lông gia súc đã được phân lập bởi Savitha et al. (2010). Enzyme của
chúng có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thịt, đồng thời enzyme được sản xuất từ
các dòng vi khuẩn này cũng được sử dụng để xử lý các loại rác thải chứa keratin.
Kết quả nghiên cứu của Riffel et al. (2003) cho thấy vi khuẩn Chryseobacterium
sp. dòng kr6 có khả năng phân hủy hoàn toàn lông vũ trong quá trình nuôi cấy. Dòng


Trường ĐHCT

CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm - Thời gian
- Thời gian thực hiện: từ tháng 08/2013 đến 11/2013.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Giống vi khuẩn
Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium V1 được Phạm Minh Triết (2013) phân lập
từ nguồn chất thải lông gia súc, gia cầm do phòng thí nghiệm SHPT Thực Vật tại Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp.
3.1.3. Vật liệu
- Lông gia cầm được thu mua tại các chợ và cơ sở giết mổ gia cầm tại thành phố
Vĩnh Long.
- Lông gia cầm (tỉ lệ lông gà – vịt 1:1) đã được chọn lọc và rửa sạch. Sau đó, cắt
các mẫu lông thành mảnh nhỏ và sấy khô ở 80 oC trong 48 giờ trong tủ sấy. Tiến
hành nghiền mẫu thành bột lông thông qua máy nghiền lông.
- Dịch rỉ đường được lọc qua vải lọc, loại bỏ các phần xác bã mía, bảo quản trong
bình thủy tinh ở nơi khô mát.
- Bột đậu nành, bã đậu nành và bột bắp được nghiền mịn, sấy khô ở 80°C trong 48
giờ, bảo quản trong ống nghiệm.
3.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Bảng 4. Thành phần hóa chất môi trƣờng bột lông vũ lỏng
Hóa chất

Nồng độ (g/l)

MgSO4.7H2O

Trường ĐHCT

Bảng 5. Thành phần hóa chất môi trƣờng bột lông vũ rắn
Hóa chất

Nồng độ (g/l)

MgSO4.7H2O

0,1

KH2PO4

0,4

K2HPO4

0,3

NaCl

0,5

Bột lông gia cầm

10

Agar

20

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống
Giống vi khuẩn ròng trữ lạnh trong ống nghiệm được cấy chuyển sang đĩa petri
chứa môi trường bột lông vũ rắn, ủ ở 37oC trong hai ngày. Sau đó cấy vào bình chứa
100ml môi trường bột lông vũ lỏng đã được khử trùng ở 121ºC trong 15 phút, nuôi
tăng sinh khối trên máy lắc (120 rpm) ở 37oC trong 48 giờ. Rút 1ml dịch nuôi cấy tiến
hành đếm mật số vi khuẩn. Mật số cần đạt khoảng 108 CFU/ml. Trữ lạnh bình nuôi
tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4oC.
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian
 Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời
gian nuôi cấy thích hợp của dòng vi khuẩn B. megaterium V1.
 Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là thời gian: ngày
1, ngày 2, ngày 3, ngày 4, ngày 5, ngày 6, ngày 7.
- Số lần lặp lại: 3 lần.
- Số nghiệm thức: 7 nghiệm thức.
- Số đơn vị thí nghiệm: 21
 Các bước thực hiện:
 Chuẩn bị 3 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng.
 Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
 Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn, ủ trên máy lắc (120
rpm) với nhiệt độ 37ºC.
 Mỗi ngày rút 100µL trong mỗi bình tiến hành pha loãng đếm mật số vi khuẩn.
Thực hiện liên tục đến ngày thứ bảy.
 Chỉ tiêu theo dõi: Mật số của vi khuẩn.
3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và