MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ
T V N ĐẶ Ấ ĐỀ............................................................................1
T NG QUANỔ ...........................................................................4
1.1. i c ng v amylase v papainĐạ ươ ề à ...............................................................4
1.1.1. Amylase ..............................................................................................................................................4
1.1.2. Papain .................................................................................................................................................8
1.2. M t s s n ph m thu c có ch a papain v amylaseộ ố ả ẩ ố ứ à ...................14
TH C NGHI M V K T QUỰ Ệ À Ế Ả................................................15
2.1. NGUYÊN LI U V PH NG PH P TH C NGHI MỆ À ƯƠ Á Ự Ệ .....................................15
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu.....................................................................................................................15
2.1.2. Hoá chất và thuốc thử........................................................................................................................16
2.1.3. Dụng cụ máy móc..............................................................................................................................17
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................................18
2.2. K T QU TH C NGHI M V NH N XÉTẾ Ả Ự Ệ À Ậ ........................................................26
2.2.1. Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng protein bằng phản ứng Biuret....................................................26
2.2.2. Xác định hoạt độ Papain trong hỗn hợp bằng PP1 ...........................................................................27
2.2.3. Xác định hoạt độ papain trong các hỗn hợp bằng PP2......................................................................33
2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase trong các hỗn hợp...........................................................................36
2.3. B N LU NÀ Ậ ..................................................................................................................43
K T LU N V XU TẾ Ậ À ĐỀ Ấ ........................................................46
3.1. K t lu nế ậ ..................................................................................................................46
3.2. xu tĐề ấ .....................................................................................................................47
T I LI U THAM KH OÀ Ệ Ả ..........................................................48
ĐẶT VẤN ĐỀ
Papain và Amylase là những enzym đã được sử dụng từ lâu ở nhiều
nước trên thế giới dưới dạng các thực phẩm hoặc thuốc cổ truyền, thậm chí đã
trở thành những huyền thoại về sự tuyệt diệu của chúng. Papain có trong nước
ép của quả đu đủ xanh đã cứu sống một em bé người Ấn Độ bị ngạt thở do

hỗn hợp Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão
hoá cấp tốc” với mục tiêu: đánh giá được sự biến đổi hoạt tính của các enzym
trong hỗn hợp ở điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời tìm ra những quy luật thay
đổi hoạt độ enzym. Từ đó có những biện pháp cụ thể ổn định hoạt chất và
nâng cao độ ổn định của thuốc, sớm triển khai sản xuất thuốc này thành hiện
thực.
-3-
PHẦN I
TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về amylase và papain
1.1.1. Amylase
Amylase [EC.3.2.1] thuộc nhóm enzym hydrolase có vai trò quan trọng
trong việc thuỷ phân tinh bột trong thức ăn thành các thành phần đơn giản
hơn. Amylase xúc tác sự phân giải liên kết nội phân tử trong các polysaccarid
với sự tham gia của nước có trong dịch tiêu hoá như nước bọt, dịch dạ dày...,
được mô phỏng theo phương trình sau:
R-R' + H-OH  RH + R'OH
Amylase có nguồn gốc ở cả động vật và thực vật. Ở người amylase được
sinh ra chủ yếu ở hai tuyến: tuỵ và nước bọt. Hiện nay, người ta đã biết có 6
loại amylase, trong đó 3 loại: α-amylase, β-amylase, γ-amylase
(glucoamylase) thuỷ phân các liên kết α-1,4-glucosid của tinh bột, glycogen
và các polysaccharid. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase,
amylopectin-6-glucanhydrolase và olygodextrin-6-glucanhydrolase (hay
dextrinase) thuỷ phân liên kết α-1,6-glucosid trong phân tử polysaccharid.
Sáu enzym amylase này cũng có thể được chia thành hai nhóm: endoamylase
và exoamylase [4]:
- Endoamylase: gồm có α-amylase và các enzym khử nhánh. Nhóm
enzym khử nhánh được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay
α-dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-
1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các endoamylase thuỷ phân các

Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của α-amylase:
- Giai đoạn dextrin hoá:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp (4-8 liên kết
glucosid)
- Giai đoạn đường hoá:
Dextrin tetra- và trimaltose di- và monosaccharid
-5-
α-amylase
 Tổng quát :
Amylose oligosaccharid polyglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
Khả năng dextrin hoá của α-amylase rất cao, do đó người ta còn gọi α-
amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá.
∗ Tính chất: α-amylase là một protein phức tạp có chứa Ca
2+
. α-
amylase có nguồn gốc khác nhau, thường có thành phần acid amin không
hoàn toàn giống nhau và mỗi loại α-amylase từ một nguồn gốc cũng thường
có một tổ hợp các acid amin đặc hiệu riêng. Thành phần chung của các α-
amylase có chứa nhiều tyrosin, trytophan, acid glutamic và acid aspartic. Các
acid amin có tính acid là glutamic và aspartic chiếm khoảng 1/4 lượng acid
amin của phân tử enzym, nhưng ngược lại, α-amylase có rất ít methionin và
chỉ có 7 – 10 gốc cystein. Các α-amylase có nguồn gốc khác nhau cũng có
KLPT rất khác nhau: α-amylase từ tuỵ động vật có KLPT là 4500 Da, trong
khi đó α-amylase từ Bacillus subtilis có tác dụng giống α-amylase từ tuỵ động
vật mà KLPT lại gấp đến 2 lần là 9900 Da [4], [6].
Nhìn chung, α-amylase có một số đặc tính như:
+ Protein của α-amylase có tính acid yếu; dễ tan trong nước, trong các
dung dịch muối và cồn thấp độ.
+ Điểm đẳng điện của α-amylase nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7 [3].

maltose khỏi đầu không khử của chuỗi polysaccarid bằng cách phân cắt liên
kết α-1,4-glucosid.
KLPT của β-amylase là 152.000 Da và 215.000 Da, bị ức chế bởi
iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, các kim loại nặng như Ag
+
, Hg
2+
,
Cu
2+
, các thuốc thử có chứa nhóm –SH. pH tối thích 4,0 – 5,0 [4]. β-amylase
chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ
70
o
C [4].

γ
-amylase (glucoamylase,
α−
1,4
−
glucan
−
4
−
glucanohydrolase, EC.3.2.1.3)
γ-amylase là enzym này có khả năng thuỷ phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6
glucosid. Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharid,
glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của
mạch polysaccharid. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucosid,

carboxyl là asparagin, phân tử có 3 liên kết disulfua (S−S) được tạo bởi 6 gốc
cystein và một nhóm –SH (sulfhydryl) tự do ở vị trí 25, các liên kết này
không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc [4].
Thành phần chính của papain chưa hoạt hoá là hỗn hợp protein cystein
disulfid. Khi hoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của phân
tử enzym và β-thiocyanatalanin do sự tương tác giữa cyanid và cystein. Sau
đó, β-thiocyanatalanin khép vòng tạo thành α-iminothiazolidin. Khi có không
khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại tạo thành sản phẩm không hoạt
hoá. Quá trình hoạt hoá papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó
[4].
SSCH
2
CH

SH + S
HC−NH
2
S NH
H
2
C CH

Hình1: Sơ đồ cơ chế hoạt hoá papain bằng cyanid
b- Cấu trúc không gian của papain:
-9-
COO
−
β−thiocyanatalanin
CN
−

o
A
, mạch polypeptid chính bị gấp
khúc thành hai phần riêng biệt tạo nên một “hốc đặc biệt”. Trung tâm hoạt
động nằm tại bề mặt của “khe” này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein
25 nằm bên trái “khe” và nhóm histidin 159 nằm bên phải “khe”. Phần có cấu
trúc xoắn α chiếm khoảng 20% toàn bộ acid amin có trong phân tử [4].
c- Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:
Đặc điểm quan trọng nhất của papain là khả năng thuỷ phân protein đến
tận acid amin. Papain thuỷ phân protein thành các polypeptid và các acid
amin, đóng vai trò vừa như một endopetidase vừa như một exopeptidase [4].
Các endopeptidase thuỷ phân proein chủ yếu thành peptid:

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)
n
+ (HOH) (-NH-CH-COOH)
i
+ (H
2
N-CH-CO-)
k
i + k = n
Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành amino acid:

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)
n
+ (HOH) (NH
2
-CH-COOH)
n'