Website: Email : Tel : 0918.775.368
Mục lục

Trang
ĐặT VấN Đề
Đặt vấn đề...........................................................................1
Tổng quan...........................................................................4
1.1. Đại cơng về amylase và papain..................................................................4
1.1.1. Amylase ..............................................................................................................................................4
1.1.2. Papain .................................................................................................................................................8
1.2. Một số sản phẩm thuốc có chứa papain và amylase.................13
Thực nghiệm và kết quả..............................................14
2.1. Nguyên liệu và phơng pháp thực nghiệm..........................................14
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu.....................................................................................................................14
2.1.2. Hoá chất và thuốc thử........................................................................................................................15
2.1.3. Dụng cụ máy móc...............................................................................................................................16
2.1.4. Phơng pháp nghiên cứu.......................................................................................................................17
2.2. Kết quả Thực nghiệm và nhận xét.........................................................25
2.2.1. Xây dựng biểu đồ mẫu định lợng protein bằng phản ứng Biuret.................................................25
2.2.2. Xác định hoạt độ Papain trong hỗn hợp bằng PP1 ..........................................................................26
2.2.3. Xác định hoạt độ papain trong các hỗn hợp bằng PP2......................................................................32
2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase trong các hỗn hợp...........................................................................35
2.3. BàN LUậN..................................................................................................................42
Kết luận và đề xuất.....................................................45
3.1. Kết luận..................................................................................................................45
3.2. Đề xuất.....................................................................................................................46
Tài liệu tham khảo........................................................47
Đặt vấn đề
Papain và Amylase là những enzym đã đợc sử dụng từ lâu ở nhiều nớc trên
thế giới dới dạng các thực phẩm hoặc thuốc cổ truyền, thậm chí đã trở thành
những huyền thoại về sự tuyệt diệu của chúng. Papain có trong nớc ép của quả

Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão hoá cấp
tốc với mục tiêu: đánh giá đợc sự biến đổi hoạt tính của các enzym trong hỗn
hợp ở điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời tìm ra những quy luật thay đổi hoạt độ
enzym. Từ đó có những biện pháp cụ thể ổn định hoạt chất và nâng cao độ ổn
định của thuốc, sớm triển khai sản xuất thuốc này thành hiện thực.
-3-
Phần I
Tổng quan
1.1. Đại cơng về amylase và papain
1.1.1. Amylase
Amylase [EC.3.2.1] thuộc nhóm enzym hydrolase có vai trò quan trọng
trong việc thuỷ phân tinh bột trong thức ăn thành các thành phần đơn giản hơn.
Amylase xúc tác sự phân giải liên kết nội phân tử trong các polysaccarid với sự
tham gia của nớc có trong dịch tiêu hoá nh nớc bọt, dịch dạ dày..., đợc mô
phỏng theo phơng trình sau:
R-R' + H-OH RH + R'OH
Amylase có nguồn gốc ở cả động vật và thực vật. ở ngời amylase đợc sinh
ra chủ yếu ở hai tuyến: tuỵ và nớc bọt. Hiện nay, ngời ta đã biết có 6 loại
amylase, trong đó 3 loại: -amylase, -amylase, -amylase (glucoamylase) thuỷ
phân các liên kết -1,4-glucosid của tinh bột, glycogen và các polysaccharid.
Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-
glucanhydrolase và olygodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thuỷ phân
liên kết -1,6-glucosid trong phân tử polysaccharid. Sáu enzym amylase này
cũng có thể đợc chia thành hai nhóm: endoamylase và exoamylase [4]:
- Endoamylase: gồm có -amylase và các enzym khử nhánh. Nhóm
enzym khử nhánh đợc chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay -
dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-
glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các endoamylase thuỷ phân các liên kết
glucosid bên trong của chuỗi polysaccharid.
-4-

- Giai đoạn dextrin hoá:
Tinh bột dextrin phân tử lợng thấp (4-8 liên kết glucosid)
- Giai đoạn đờng hoá:
Dextrin tetra- và trimaltose di- và monosaccharid
Tổng quát :
-5-
Amylose oligosaccharid polyglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
Khả năng dextrin hoá của -amylase rất cao, do đó ngời ta còn gọi -
amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá.
Tính chất: -amylase là một protein phức tạp có chứa Ca
2+
. -amylase
có nguồn gốc khác nhau, thờng có thành phần acid amin không hoàn toàn giống
nhau và mỗi loại -amylase từ một nguồn gốc cũng thờng có một tổ hợp các
acid amin đặc hiệu riêng. Thành phần chung của các -amylase có chứa nhiều
tyrosin, trytophan, acid glutamic và acid aspartic. Các acid amin có tính acid là
glutamic và aspartic chiếm khoảng 1/4 lợng acid amin của phân tử enzym, nhng
ngợc lại, -amylase có rất ít methionin và chỉ có 7 10 gốc cystein. Các -
amylase có nguồn gốc khác nhau cũng có KLPT rất khác nhau: -amylase từ
tuỵ động vật có KLPT là 4500 Da, trong khi đó -amylase từ Bacillus subtilis
có tác dụng giống -amylase từ tuỵ động vật mà KLPT lại gấp đến 2 lần là
9900 Da [4], [6].
Nhìn chung, -amylase có một số đặc tính nh:
+ Protein của -amylase có tính acid yếu; dễ tan trong nớc, trong các dung
dịch muối và cồn thấp độ.
+ Điểm đẳng điện của -amylase nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7 [3].
+ -amylase là một metaloenzym, mỗi phân tử -amylase đều có chứa 1-
30 nguyên tử gam Ca/mol, nhng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca
tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc ba của enzym, duy trì hoạt

iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, các kim loại nặng nh Ag
+
, Hg
2+
, Cu
2+
,
các thuốc thử có chứa nhóm SH. pH tối thích 4,0 5,0 [4]. -amylase chịu
nhiệt kém hơn -amylase nhng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ 70
o
C
[4].


-amylase (glucoamylase,

1,4

glucan

4

glucanohydrolase, EC.3.2.1.3)
-amylase là enzym này có khả năng thuỷ phân liên kết -1,4 lẫn -1,6
glucosid. Khi thuỷ phân liên kết -1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharid,
glucoamylase tách lần lợt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của
mạch polysaccharid. Ngoài các liên kết -1,4 và -1,6 glucosid, glucoamylase
còn có khả năng thuỷ phân các liên kết -1,2 và -1,3 glucosid. Do đó,
glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin, dextrin, maltose... thành glucose mà không cần có sự tham gia của

Thành phần chính của papain cha hoạt hoá là hỗn hợp protein cystein
disulfid. Khi hoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của phân
tử enzym và -thiocyanatalanin do sự tơng tác giữa cyanid và cystein. Sau đó,
-thiocyanatalanin khép vòng tạo thành -iminothiazolidin. Khi có không khí,
cơ chế trên xảy ra theo chiều ngợc lại tạo thành sản phẩm không hoạt hoá. Quá
trình hoạt hoá papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó [4].
SSCH
2
CH

SH + S
HCNH
2
S NH
H
2
C CH

Hình1: Sơ đồ cơ chế hoạt hoá papain bằng cyanid
b- Cấu trúc không gian của papain:
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thớc của các trục chính trong cấu
trúc không gian 3 chiều là: 36ì48ì36
o
A
, mạch polypeptid chính bị gấp khúc
thành hai phần riêng biệt tạo nên một hốc đặc biệt. Trung tâm hoạt động nằm
-9-
COO

thiocyanatalanin

tại bề mặt của khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên
trái khe và nhóm histidin 159 nằm bên phải khe. Phần có cấu trúc xoắn
chiếm khoảng 20% toàn bộ acid amin có trong phân tử [4].
c- Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:
Đặc điểm quan trọng nhất của papain là khả năng thuỷ phân protein đến
tận acid amin. Papain thuỷ phân protein thành các polypeptid và các acid amin,
đóng vai trò vừa nh một endopetidase vừa nh một exopeptidase [4].
Các endopeptidase thuỷ phân proein chủ yếu thành peptid:

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)
n
+ (HOH) (-NH-CH-COOH)
i
+ (H
2
N-CH-CO-)
k
i + k = n
Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành amino acid:

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)
n
+ (HOH) (NH
2
-CH-COOH)
n'
+ (H
2
N-CH-CO-)
k'

enzym.
Cơ chế của sự hoạt hoá papain:
PaSSPa 2 PaSH
(bất hoạt) (hoạt động)
PaS

+

SPa {2 PaS

}Me
2+
(hoạt động) (bất hoạt)
e- Sự ức chế papain:
Papain bị kìm hãm (ức chế) bất thuận nghịch bởi các chất oxy hoá nh: O
2
,
ozon, H
2
O
2
, Iodid acetat, iodid acetamid, thuỷ ngân chlobenzoat, cystin và một
số dẫn chất disulfid khác. Các chất này ức chế hoạt tính của papain bằng phản
ứng với nhóm SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà làm thay
đổi cấu trúc tâm hoạt động của nó [4].
Papain bị ức chế thuận nghịch bởi không khí, cystein ở nồng độ thấp, các
ion kim loại nặng nh Cd
2+
, Zn
2+

gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì đợc 90% [4].
Papain ở dạng tinh sạch và ở dạng tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain
ở trong nhựa mủ, do trong nhựa mủ còn chứa các protein khác có tác dụng bảo
vệ nó [4].
Khi thuỷ phân các protein khác nhau, tuỳ thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ
phản ứng thích hợp (nhiệt độ tối u) cho papain cũng khác nhau. Đối với cơ chất
casein, nhiệt độ phản ứng tối u là 37
o
C [4].
pH: Papain hoạt động ở khoảng pH tơng đối rộng từ 4,5 - 8,5 và hầu
nh bền ở khoảng pH này, nhng lại dễ biến tính trong môi trờng acid có pH < 4,5
hoặc trong môi trờng kiềm mạnh có pH > 12. Đặc biệt papain dạng ổn định có
thể chịu đợc ở pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút.
Tuỳ thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối u của papain sẽ khác nhau,
chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối u là 7 - 7,5; với albumin ở pH tối
u là 4,5 - 7,1 và với gelatin ở pH tối u là 5,2 - 6,0 và 6,4. Điểm đẳng điện của
papain là pI = 9 [4].
g- C ông dụng :
Papain có tác dụng làm mềm thịt, thuỷ phân protein làm trong đồ uống,
làm mềm và sạch da. Trong Y Dợc, papain là enzym đợc dùng để phòng chống
dính, làm tróc vẩy và xử lý làm sạch vết thơng [9]; chế phẩm uống papain có tác
dụng tiêu hoá protein có trong thức ăn và có tác dụng chống viêm phi steroid
(theo cơ chế enzym).
-12-
1.2. Một số sản phẩm thuốc có chứa papain và amylase
Hiện nay các chế phẩm enzym đang đợc sử dụng ở Việt Nam vẫn chủ yếu
là nhập của nớc ngoài. Một số chế phẩm chứa Papain và Amylase sử dụng với
mục đích điều trị rối loạn tiêu hoá thông dụng nh [8]:
- Pantyrase, Panthicone, Panticone F, Dailase,
Gastal, Korzym, Pandual, Panwoodi, Sancase, Stilase,

Alpha amylase IP 96
Papain IP 96
Dimethicone IP 96
Lactose
100 mg
100 mg
30 mg
vđ 500 mg
Alpha amylase (fungal) IP 96 100 mg
Papain IP 96 100 mg
Simethicon DĐVN III 30 mg
Calci tribasic phosphat vđ 500 mg
b) Hỗn hợp dung dịch papain và alpha amylase (PA D):
PA D1 PA D2
Alpha amylase IP 96 200 mg
Papain IP 96 100 mg
Tinh dầu Dill IP 96 20 mg
Tinh dầu Anise IP 96 20 mg
Tinh dầu Caraway IP 96 20 mg
Nớc cất vđ 10 ml
Alpha amylase (fungal) IP 96 200 mg
Papain IP 96 100 mg
Tinh dầu hồi DĐVN III 30 mg
Tinh dầu cam DĐVN III 30 mg
Saccarose DĐVN III 200 mg
Hỗn hợp Nipazin/Nipazon
(tỷ lệ 9/2) 0,2 mg
Nớc cất vđ 10 ml
Trong đó:
-14-

dung dịch vào bình định mức, thêm nớc vừa đủ 100ml. Pha loãng 10ml dung
dịch này với dung dịch đệm acetat pH 5,0 thành 100ml dung dịch cơ chất tinh
bột.
Hoá chất và thuốc thử:
- Dung dịch cystein hydroclorid 5%: Hoà tan 5,0g cystein hydroclorid
trong 90ml nớc cất, chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N, thêm nớc vừa
đủ 100ml (pha trớc khi dùng).
- Dung dịch cystein 0,04M: Hoà tan 0,49g cystein vào 90ml dung dịch
đệm pH 7,2, sau đó thêm dung dịch đệm pH 7,2 vừa đủ 100ml (pha trớc khi
dùng).
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,2:
-15-
Na
2
HPO
4
.12H
2
O.........................................55,132g.
Acid citric.....................................................4,853g.
Nớc cất vừa đủ.............................................1000ml.
- Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hoà tan 6,8g natri acetat và 2,5ml acid
acetic băng vào khoảng 400ml nớc cất, sau đó thêm nớc vừa đủ 500ml. Điều
chỉnh đến pH 5,0 nếu cần.
- Dung dịch Iod 0,1N: Hoà tan 7g Iod và 18g Kali Iodid vào 50ml nớc cất.
Thêm 3 giọt acid hydroclorid và pha loãng với nớc thành 500ml.
- Dung dịch Iod 0,02N: Pha loãng 10ml dung dịch Iod 0,1N bằng nớc cất
thành 50ml.
- Dung dịch acid trichloroacetic 10%
Acid trichloroacetic...........................................10g.

các enzym trên các biểu đồ riêng biệt thông qua theo dõi phần trăm (%) hoạt độ
enzym (HđE) còn lại và tốc độ (v) giảm HđE theo tuần (HđE/t) cho mỗi hỗn
hợp enzym.
2.1.4.2. Kỹ thuật định lợng protein bằng phản ứng Biuret [10]
Nguyên tắc : Protein có liên kết peptid cho tác dụng với CuSO
4
và NaOH
tạo thành phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ so với biểu đồ mẫu để
định lợng protein.
Xây dựng biểu đồ mẫu để định l ợng protein bằng phản ứng Biuret :
Cân 1,00g Albumin bò tinh khiết, hoà tan với dung dịch NaCl 0,9% vừa
đủ để có dung dịch 1%. Từ dung dịch này ta thực hiện phản ứng theo bảng sau:
Thuốc thử
ống nghiệm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dd albumin 1% (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Dd NaCl 0,9% (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Thuốc thử Gornall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo quang ở bớc sóng = 530nm.
Từ kết quả đo quang phổ hấp thụ thu đợc của các dung dịch dựng biểu đồ
nồng độ protein (mg/ml) mật độ quang (D).
-17-
2.1.4.3. Phơng pháp xác định hoạt độ Papain
a) Phơng pháp 1 (PP1): Xác định hoạt độ papain dựa theo nguyên tắc
của phản ứng Biuret.
Nguyên tắc: Cơ chất protein đợc ủ với enzym ở điều kiện thích hợp trong
thời gian nhất định. Lợng protein còn lại đợc xác định bằng cách cho tủa với
acid trichloroacetic, tủa này phản ứng với thuốc thử Gornall tạo phức màu tím
hồng. Đo quang phổ hấp thụ ở bớc sóng = 530nm, cuvet 1cm.
Tiến hành:


D
cơ chất
HđP =
mT)10(236
20910BA
2
6
ììì
ììì
(nanoKatal)
Trong đó: A : Lợng protein (mg) bị thuỷ phân (xác định theo biểu đồ).
B : Độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym.
23600 : Trọng lợng phân tử gam của casein (g).
209 : Số liên kết peptid của một phân tử casein.
T : Thời gian thuỷ phân (giây).
m : Lợng chế phẩm enzym đem thử (mg).
Hoạt độ papain theo % (hoạt độ protease tơng đối) đợc tính theo công
thức:
HđP (%) = ì 100%
Trong đó: D
cơ chất
: Mật độ quang của ống cơ chất.
D
thử
: Mật độ quang của ống thử.
D
chứng
: Mật độ quang của ống chứng.
b)Phơng pháp 2 (PP2): Xác định hoạt độ papain theo IP 96 [11]