bộ giáo dục và đào tạo

trờng đại học nông nghiệp hà nội
---------------------------------

NGUYN TH HNG

NH HNG CA KH NC LấN S SNG
V PHT TRIN CA TRNG, PHễI NG VT
NHIT THP

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Hà nội - 2012


bộ giáo dục và đào tạo

trờng đại học nông nghiệp hà nội
--------------------------------NGUYN TH HNG

NH HNG CA KH NC LấN S SNG
V PHT TRIN CA TRNG, PHễI NG VT
NHIT THP

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành

: Chn nuụi


i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Bùi Xuân
Nguyên, người ñã tận tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện và hướng dẫn trực tiếp ñề tài
luận văn của tôi cho tới khi hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới PGS.TS. Nguyễn
Bá Mùi, người ñã tận tình chỉ bảo và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các cô, chú, anh chị em thuộc
phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới T.S. Nguyễn Thị Ước,
T.S. Nguyễn Việt Linh, T.S. Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thị Hiệp, Nguyễn
Thùy Anh, Nguyễn Thị Thơm, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn
Thị Mến ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hóa sinh và Sinh lý ñộng vật,
tập thể cán bộ, giáo viên khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản trường ðại
học Nông nghiệp Hà Nội.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình ñã ñộng viên, ủng hộ,
khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn Thạc sỹ này.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng năm 20

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hồng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


: Dullbecco’s phosphate-buffered saline

GV

: (geminal vesicle): trứng ở giai ñoạn bóng mầm

MII

: (metaphase II): trứng ở giai ñoạn trung kỳ II

CPAs

: (cryoprotectants) chất bảo quản lạnh

NST

: nhiễm sắc thể

DMSO

: Dimethyl sulfoxide

Gly

: Glycerol

EG

: Ethylene glycol


PHẦN II. TỔNG QUAN................................................................................ 5
2.1. Khử nước - cơ chế chống chịu lạnh và bảo tồn sự sống ........................... 5
2.2. Khả năng khử nước của trứng, phôi ñộng vật thủy sản và ñộng vật có vú...... 11
2.2.1. Cơ chế tác ñộng của khử nước lên trứng, phôi ñộng vật thủy sản và
ñộng vật có vú .............................................................................................. 11
2.2.2. Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật thủy sản .. 13
2.2.3. Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật có vú 15
2.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật có vú
và thủy sản ................................................................................................... 18
2.3.1. Cơ chế tác ñộng của nhiệt ñộ thấp lên trứng, phôi ñộng vật thủy sản và
ñộng vật có vú .............................................................................................. 18
2.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng, phôi cá .............. 19
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv


2.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của trứng lợn...................... 21
2.4. Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật........ 22
2.4.1. Nguyên lý và phương pháp bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật ......... 22
2.4.2. Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi cá............... 26
2.4.3. Ứng dụng của khử nước trong bảo quản lạnh trứng, phôi ñộng vật có
vú, lợn .......................................................................................................... 29
PHẦN III. ðỐI TƯỢNG - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
..................................................................................................................... 33
3.1. ðối tượng, thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu ......................................... 33
3.1.1. ðối tượng nghiên cứu ......................................................................... 33
3.1.2. Thời gian nghiên cứu.......................................................................... 33
3.1.3. ðịa ñiểm nghiên cứu........................................................................... 33
3.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 33

tỷ lệ trứng thành thục.................................................................................... 81
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ.......................................................... 87
5.1. Kết luận................................................................................................. 87
5.2. ðề nghị.................................................................................................. 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 89

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên các bảng

Trang

Bảng 2.1. Mối tương quan giữa khử nước và nhiệt ñộ cơ thể.......................... 5
Bảng 3.1. Phân loại trứng theo Leibried – Rutledge và cs (1987) trước khi
ñem nuôi ...................................................................................................... 40
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của sự khử nước lên sự phát triển của phôi cá tra ở nhiệt
ñộ phòng (n = 3)........................................................................................... 45
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thấp lên sự sống của phôi cá tra (n = 3).. 47
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của sự khử nước lên sự phát triển của phôi cá tra ở nhiệt
ñộ 0oC (n = 3)............................................................................................... 53
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của sự khử nước lên sự sống và phát triển của phôi cá
tra ở nhiệt ñộ -20oC trong 15 phút (N = 90, n = 3)........................................ 57
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của các chất bảo quản lạnh riêng lẻ (nồng ñộ 3M) ở
nhiệt ñộ phòng và nhiệt ñộ thấp trong 15’ .................................................... 59

STT

Tên các hình ảnh

Trang

Hình 2.1: Biến ñổi nhiệt ñộ theo quy trình ñông lạnh chậm và giải ñông chậm
của Whitingham và cs (Nguyen và cs, 1984 [42]) ...................................... 24
Hình 2.2: Sơ ñồ khử nước, thời gian và biến ñổi nhiệt ñộ trong các kiểu ñông lạnh
chậm, ñông lạnh nhanh và ñông lạnh cực nhanh (Nguyen và cs, 1984 [42])....... 25
Hình 2.3: Nguyên tắc ñông lạnh cực nhanh .................................................. 25
Hình 4.1: Hình ảnh phôi cá tra khử nước và không khử nước ở nhiệt ñộ phòng.... 48
Hình 4.2: Hình ảnh phôi cá tra sống, chết và cá tra nở sống, nở chết ........... 55
Hình 4.3: Hình ảnh trứng lợn ñối chứng, khử nước và trứng thành thục ....... 76
Hình 4.4: Hình ảnh trứng lợn khử nước ở nhiệt ñộ thấp ............................... 83
Hình 4.5: Hình ảnh trứng lợn sau xử lý với các chất bảo quản lạnh ở nhiệt ñộ
phòng, trứng sau MAT – II........................................................................... 86

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ix


DANH MỤC ðỒ THỊ
STT

Tên các ñồ thị

Trang


cao hơn nhiều so với nhiệt ñộ cơ thể.
Trong quá trình tiến hóa, cùng với sự thay ñổi môi trường sống và
phương thức sống, khả năng khử nước ở ñộng vật cũng thay ñổi. Các loài
ñộng vật phát triển hơn, hình thành các cơ chế ñiều khiển nhiệt ñộ cơ thể phức
tạp thay thế cho cơ chế nguyên thủy dựa trên khả năng khử nước (Nguyen,
1989) [80].
Nghiên cứu vai trò khử nước là một hướng nghiên cứu quan trọng trong
bảo quản lạnh giao tử và phôi ñộng vật. Khử nước trước khi làm lạnh giúp
ngăn cản sự tạo thành tinh thể ñá, tác nhân gây phá vỡ tế bào trong quá trình
ñông lạnh – giải ñông, tăng cường bảo vệ cấu trúc tế bào và phôi trong quá
trình ñông lạnh. Ngày nay, các phương pháp bảo quản lạnh trứng và phôi ở
nhiệt ñộ thấp (-196oC) ñã ñược phát triển ở một số loài dựa trên kết quả
nghiên cứu về kết hợp khử nước và xử lý với các chất chống ñông
(Wittingham và cs,1972 [74]; Leibo, 1980 [29]; Mazur và Schneider, 1986
[37]; Nguyen và cs, 1983 [43]; Valdez và cs, 2005 [70]). Các công trình
nghiên cứu này cho thấy trứng và phôi nhiều loài có khả năng chống chịu áp
lực thẩm thấu và biến ñổi hệ số trao ñổi qua màng tế bào khi xử lý với dung

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1


dịch ưu trương, và nhờ ñó có thể duy trì ñược sự sống khi bảo quản trong ni
tơ lỏng ở -196oC.
Mặc dù bảo quản lạnh trứng, phôi nhiều loài ñộng vật có vú ñã thành
công nhưng bảo quản lạnh trứng và phôi các loài ñộng vật thủy sản, ñặc biệt
là phôi cá, ở nhiệt ñộ -196oC còn gặp nhiều thách thức. Phôi cá tra có khối
noãn hoàng lớn và tính thấm màng thấp, ñiều này làm hình thành tinh thể ñá
trong quá trình ñông lạnh khiến phôi cá dễ bị phá hủy.



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4


PHẦN II. TỔNG QUAN
2.1. Khử nước - cơ chế chống chịu lạnh và bảo tồn sự sống
Nước ñóng vai trò quan trọng trong duy trì toàn bộ cấu trúc, chức năng
của màng và các ñại phân tử hóa sinh. Tuy nhiên, trong tự nhiên sự sống thiếu
nước ñã ñược Anthony von Leeuwenhoek khám phá ra vào năm 1702 trên
một loài của bdelloid rotifer, Philodina roseola, có thể chống chịu vài tháng
trong trạng thái sấy khô. Sau ñó, giáp xác, một vài rotifer sống ở ñất,
tardigrade, nematodes, hạt giống cây trồng cũng ñược chỉ ra có khả năng sống
ở trạng thái “anhydrobiosis” ñặc trưng cho hiện tượng khử nước gần như toàn
bộ, hay là sống ở trạng thái bào xác (sống thiếu nước) (Crowe J.H. và Crowe
L.M, 1982) [9].
Khả năng khử nước có tương quan với nhiệt ñộ cơ thể của các loài. Dựa
vào bảng 2.1 cho ta có thể nhận thấy trong quá trình tiến hóa, khả năng khử nước
giảm dần theo sự giảm của thang dao ñộng nhiệt ñộ cơ thể có thể thích nghi.
Bảng 2.1. Mối tương quan giữa khử nước và nhiệt ñộ cơ thể
Loài

Khả năng khử nước (%)

Nhiệt ñộ cơ thể (oC)
Tối thiểu

Tối ña

(polypedium vanderplanki )

99 (ANH)

-270

470

Lưỡng cư

50 (Dehydration, DES)

-10

37,5

ðộng vật có vú (chuột nhắt)

34 (DES)

10

Tardigrdes_loài ñi chậm
(macrobiotus hufelandi)
Insect: ấu trùng loài chân ñốt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5




thức hoạt ñộng của AFP cá, tất cả ñều chỉ ra chúng có thể giảm một nhiệt ñộ làm
lạnh quá mức lên tới 1,5oC trong những dung dịch có nước loãng.
Cơ chế thứ hai, hạ ñiểm ñông lạnh, ñược quan sát bởi những côn trùng
sống qua mùa ñông. Cơ chế này dựa trên nhiệt tan chảy, phản ánh sự có mặt
của các chất tan trong nước huyết tương. Huyết tương của loài bọ cánh cứng
Uloma impressa phải chứa nồng ñộ ñáng kể của chất tan, tích lũy trong suốt
thời gian hóa cứng và ñược chuyển hóa trong khi hồi phục hóa cứng; lượng
của chúng cho ñiểm tan chảy của -9,9oC. Glycerol ñã ñược xác ñịnh như một
chất làm giảm nhiệt tan chảy chung, và nồng ñộ ảnh hưởng có thể giải thích
sự giảm nhiệt ñược quan sát.
Hiện tượng tránh ñông lạnh ở những ñộng vật sống trong ñiều kiện khí
hậu tự nhiên ñược cho là chỉ ñông lạnh nước ngoại bào. Quá trình thích nghi
làm tăng sức chống chịu nhiều vì nước không ñông lạnh trong tế bào chất.
Những yêu cầu cho sự thành công của thích nghi ñông lạnh tự nhiên bao gồm:
1/ tinh thể ñá phải ñược giữ với các thành phần ngoại bào, tổn thương từ tinh
thể ñá phải ñược giảm tới mức tối thiểu; 2/ tốc ñộ ñông lạnh phải chậm và ñược
khống chế ñể hạn chế biến ñổi áp lực thẩm thấu lên tế bào, tạo thời gian cho sự
phân phối lại ion và những trao ñổi chất tan khác giữa khoảng trong và ngoài tế
bào, và cho phép khống chế ñộ co của màng tế bào; 3/ sự giảm thể tích tế bào
và khử nước không vượt quá giới hạn tổn thương phải ñược ngăn ngừa; 4/ tế
bào phải sống và duy trì cân bằng nội mô trong tình trạng thiếu máu cục bộ một
thời gian dài bởi sự hình thành ñá bao quanh bên ngoài tế bào.
Một số thích nghi ñông lạnh thành công ñã ñược xác ñịnh: 1/ sử dụng
những protein cấu tạo nhân tinh thể ñặc biệt ñể giảm và khống chế sự hình
thành tinh thể ñá và vai trò có thể của protein trễ nhiệt trong ngăn cản sự kết
tinh lại; 2/ sự thích nghi cho ñiều chỉnh thể tích tế bào và cho sự ñảm bảo cho
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………



8


Glycerol ñã ñược sản xuất trong giai ñoạn sớm của mùa thu, không thể
bị chuyển hóa và duy trì trong huyết tương qua mùa ñông, có lẽ vì sự có mặt
của enzyme glycerol kinase. Ngược lại, sorbitol là một chất bảo quản có thể
biến ñổi: trong suốt thời kì ấm ngắn ngủi, nó ñược biến ñổi lại thành glycogen.
Sự thích nghi với tinh thể ñá trong khoảng dịch ngoại bào tạo thành
một phần của chiến lược sống qua mùa ñông của những loài ñộng vật từ
những nhóm phát sinh loài khác nhau. Gồm có nhiều loài của côn trùng sống
trên cạn, một vài loài hai mảnh, chân bụng, giun ñốt, giun tròn sống ở vùng
bờ biển nơi thủy triều lên xuống, một vài loài ếch ngủ ñông trên cạn.
Sự thích nghi lạnh xuất hiện ở 3 nhóm chính: ñộng vật không xương
sống ở biển, côn trùng và ếch.
ðộng vật không xương sống ở biển:
Trong suốt mùa ñông, sự sống ở vùng bờ biển nơi thủy triều lên xuống
có thể ñưa vào nhiệt ñộ âm trong không khí 2 lần/ ngày tác ñộng lên những
ñộng vật không xương sống cư trú.
Sự chống chịu lạnh ở ñộng vật không xương sống ở biển phải cung cấp
những nhân tố của sự sống và sinh lý trong môi trường tại ñó, chẳng hạn tính
thích nghi lạnh là một chiến lược logic. ðộng vật không xương sống ở biển là
những loài thích nghi thẩm thấu (osmocomformer), cho nên cả việc khử nước
lẫn việc tích lũy ở nồng ñộ cao các chất chống ñông có khối lượng phân tử
thấp ñều không giúp gì trong việc nâng cao khả năng thích ứng với ñông lạnh
hoặc ñề kháng với những tác ñộng của ñông lạnh. Tuy nhiên, tế bào ñược
thích ứng tốt với cách cư xử với stress thấm lọc và có những cơ chế ñiều
chỉnh thể tích tế bào cái mà có thể ñặt sử dụng hiệu quả trong giải quyết với
nồng ñộ ñông lạnh.
Côn trùng:

trọng, bởi vì chúng dường như không làm giảm số lượng rõ rệt nước trong
suốt sự thích nghi lạnh (Karl Erik Zachariassen, 1985 [26]).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10


Ếch:
Bốn loài ếch Bắc Mỹ ngủ ñông trên ñất thích nghi với ñông lạnh ngoại
bào. Sự giới hạn sự sống ñông lạnh của những loài ếch sống trên cạn là khá
hẹp nhưng ñủ cho sự sống của những loài ñược chọn trong vùng ngủ ñông
ñược bảo vệ.
Khử nước là một phản ứng thích nghi giúp các loài ñộng vật bậc thấp
có thể tồn tại trong ñiều kiện sống khắc nghiệt khi nhiệt ñộ môi trường thấp
hoặc cao hơn nhiều so với nhiệt ñộ cơ thể. Trong quá trình tiến hóa, khả năng
khử nước của các loài ñộng vật giảm dần theo chiều tiến hóa. Các loài ñộng
vật bậc cao có những hình thành những cơ chế khác ñể ñiều tiết cơ thể chống
lại nhiệt ñộ thấp.
Các loài ñộng vật thủy sinh, chẳng hạn cá, hình thành những peptide
chống ñông (AFP) ñể ngăn cản dịch cơ thể ñóng băng trong ñiều kiện nhiệt ñộ
của môi trường thấp. Tuy nhiên, ñộng vật có vú không có khả năng này, thay
vào ñó là một loạt cơ chế phức tạp ñiều khiển nhiệt ñộ cơ thể.
2.2. Khả năng khử nước của trứng, phôi ñộng vật thủy sản và ñộng vật có vú
2.2.1. Cơ chế tác ñộng của khử nước lên trứng, phôi ñộng vật thủy sản và
ñộng vật có vú
Những nghiên cứu (Oda và cs, 1992 [45]; Agca và cs, 2000 [1]) ñã chỉ
ra rằng sock áp lực gây chết tế bào và cần ñược xem xét khi chuẩn bị một
chuẩn ñông lạnh. Sock áp lực xuất hiện khi một tế bào nhanh chóng ñược
chuyển từ dung dịch ưu trương sang dung dịch ñẳng trương. Tế bào sẽ phình
ra khi nước vào nhanh chóng và ñiều này có thể gây tan tế bào. Phản ứng sinh

khác nhau (35, 75, 150, 225, 290, 700, 1100, 1500,1900, 2300, 2700, và 3150
mOsm) trong 10’/ 38oC ñể tránh ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên thoi vô sắc. Sau
ñó, trứng ñược ñưa lại vào dung dịch ñẳng trương khoảng 10’ ñể cho phép thu
ñược thể tích thông thường, sau ñó ñưa vào môi trường nuôi. Kết quả chỉ ra
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12


khi nồng ñộ của dung dịch càng chênh lệch với dung dịch ñẳng trương thì làm
tăng tỷ lệ trứng có thoi vô sắc MII bất thường. Hầu hết trứng có thể duy trì
cấu trúc thoi vô sắc bình thường khi nhúng vào dung dịch có nồng ñộ từ 150 –
1900 mOsm. Kết quả chỉ ra rằng tỷ lệ cao (gần 80%) trứng có thể duy trì cấu
trúc thoi vô sắc thông thường sau khi nhúng vào các dung dịch có nồng ñộ
150 – 1100 mOsm.

2.2.2. Ảnh hưởng của khử nước lên sự sống của trứng, phôi ñộng vật thủy sản
Shinsuke Seki và cs (2011) [63] ñã nghiên cứu khả năng ñông lạnh
trứng cá ngựa vằn giai ñoạn III (zebrafish) ñánh giá bởi khả năng thụ tinh và
khả năng nở. Khi trứng ñược nhúng vào dung dịch nhược trương 60’ ở 25oC,
tỷ lệ thành thục, thụ tinh và nở giảm trong dung dịch có nồng ñộ 0,16Osm/kg
hoặc thấp hơn. Khi trứng cá ñược nhúng vào dung dịch ưu trương (chứa
sucrose) ở 25oC trong 30’, tỷ lệ thành thục giảm ở dung dịch có nồng ñộ
osmol là 0,51Osm/kg, nhưng tỷ lệ nở giảm ở dung dịch có nồng ñộ osmol
thấp hơn 0,40Osm/kg.
Khử nước làm giảm sự phát triển của trứng cá khi xử lý với dung dịch
không ñẳng trương. Tuy nhiên, tính nhạy cảm của trứng và phôi ñộng vật thủy
sản với xử lý khử nước phụ thuộc loài và giai ñoạn phát triển.
Trái lại, một xu hướng kích thích sự phát triển của phôi cá dưới ñiều
kiện khử nước ñã ñược chỉ ra bởi nghiên cứu của Tingaud-Sequeira A và cs