BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
ðINH ðỨC CẢNH
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-------
-------
ðINH ðỨC CẢNH
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
TÌNH HÌNH NHIỄM PORCINE CIRCOVIRUS
TYPE 2 (PCV2) Ở ðÀN LỢN NUÔI TẠI MỘT SỐ
TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành : Thú y
Mã Số
: 60.62.50
Người hướng dẫn khoa học: TS. HUỲNH THỊ MỸ LỆ
HÀ NỘI - 2012
HÀ NỘI - 2012
LỜI CAM ðOAN
Tôi luôn biết ơn tới gia ñình, bạn bè, những người luôn ñộng viên,
giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình
thực hiện ñề tài này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2012
Tác giả luận văn
Học viên
ðinh ðức Cảnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
ii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
ADN
: Axit Deoxyribose Nucleotide
ELISA
: Enzym Linked Immunosorbent Assay
nPCR
: Nested Polymerase Chain Reaction
ORF
: Open Reading Frame
: Pig Kidney 15
PMWS
: Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome
PNP
: Proliferating Necrotizing Pneumonia
PRDC
: Porcine Respiratory Disease Complex
PRRS
: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
TAE buffer
: Tris-Acetate Etilendiamin Tetraaxetic Axit buffer
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ðOAN ...................................................................................0
1.4. Chẩn ñoán ....................................................................................... 17
1.4.1. Chẩn ñoán lâm sàng...................................................................... 17
1.4.2. Chẩn ñoán khẳng ñịnh .................................................................. 18
1.5. Phòng bệnh ..................................................................................... 20
1.5.1. Vệ sinh phòng bệnh ...................................................................... 20
1.5.2. Phòng bệnh bằng vacxin ............................................................... 21
1.6. ðiều trị ........................................................................................... 23
II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ PCV2
VÀ BỆNH DO PCV2 GÂY RA.............................................................. 23
2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................... 23
2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................... 25
PHẦN 3: NỘI DUNG – NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
.............................................................................................................. 30
3.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 30
3.2. ðịa ñiểm nghiên cứu ....................................................................... 30
3.3. Nguyên liệu..................................................................................... 30
3.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 31
3.4.1. Phương pháp tính toán dung lượng mẫu ........................................ 31
3.4.2. Phương pháp thu thập mẫu huyết thanh, mẫu bệnh phẩm ............... 31
3.4.3. Phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng PCV2 .... 31
3.4.4. Phương pháp nested PCR chẩn ñoán PCV2 trong bệnh phẩm............. 35
3.4.5. Phương pháp phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15 ............ 37
3.4.6. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang xác ñịnh PCV2 trong môi
trường tế bào ......................................................................................... 39
3.4.7. Phương pháp xử lý số liệu............................................................. 40
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
v
Hình 2.4. Viêm dính màng phổi với thành lồng ngực .............................. 12
Hình 2.5. Hạch màng treo ruột bị sưng, xuất huyết.................................. 12
Hình 2.6. Thận bị sưng, xuất huyết và có ñiểm hoại tử ............................ 13
Hình 2.7. Phổi bị viêm ở các mức ñộ khác nhau...................................... 13
Hình 2.8. Lợn bị viêm da........................................................................ 14
Hình 2.9. Lợn mắc chứng gày còm và bị viêm da.................................... 15
Hình 2.10. Lợn có triệu chứng rối loạn hô hấp ........................................ 16
Hình 2.11. Lợn bị gày còm, tiêu chảy ..................................................... 17
Hình 4.4. Máy ñọc ELISA xác ñịnh kháng thể kháng PCV2 .................... 53
Hình 4.5. Phản ứng ELISA xác ñịnh kháng thể kháng PCV2 ................... 54
Hình 4.6. Kết quả nested PCR trên mẫu ADN dương chuẩn và mẫu bệnh phẩm.. 56
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Bảng so sánh các khung ñọc mở của PCV1 và PCV2.................7
Bảng 2.2. Những nghiên cứu về PCV2 trên thế giới ................................ 28
Bảng 3.1. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm ........................................................... 32
Bảng 3.2. Trình tự cặp mồi dùng trong chẩn ñoán và xác ñịnh genotype PCV2 . 35
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chẩn ñoán và ñịnh type PCV2 .... 37
Bảng 4.1. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh kháng thể
kháng PCV2 .......................................................................................... 41
Bảng 4.2. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 42
Bảng 4.3. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 42
Bảng 4.4. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 42
Bảng 4.5. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu huyết thanh xác ñịnh ............ 43
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại các ñịa. 44
sản ở lợn (porcine reproductive disorders); gây tác ñộng lớn tới sức sản xuất của
ñàn lợn. Trong số các bệnh do circovirus gây ra, PMWS ñược coi là nguyên
nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn; danh từ Hội
chứng 30kg (The 30kg syndrome) cũng ñôi khi ñược dùng ñể chỉ bệnh này do
lợn bệnh chỉ ñạt khối lượng khoảng 30kg trong khi lợn bình thường cùng lứa
tuổi có thể ñạt 100kg. Thiệt hại kinh tế do PCV2 gây ra ước tính khoảng 600
triệu Euro/năm ñối với khối EU (Segalés và cộng sự, 2005). Tại Mỹ, người ta tính
toán và cho biết PCVAD gây thiệt hại kinh tế trung bình 3 - 4 ñô la/lợn, thậm chí
có ñàn lên ñến 20 ñô la/lợn (Gillespie và cộng sự, 2009) và PCV2 ñược coi là virus
gây bệnh quan trọng nhất trong ngành chăn nuôi (Opriessnig và cộng sự, 2007).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
1
Hiện tại, PCV2 và các hội chứng bệnh liên quan ñược phát hiện ở ñàn lợn
tại nhiều nước trên thế giới. Một số quốc gia trong khu vực ðông Nam Á như
Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan … ñều công bố về sự xuất hiện của
PCVAD. Cho ñến nay, việc nghiên cứu porcine circovirus trên thế giới ñã có
nhiều thành tựu về hệ gen, các ñiểm quyết ñịnh kháng nguyên, phương pháp
chẩn ñoán và thậm chí ñã có vacxin thương mại ñể phòng chống bệnh.
Tại Việt Nam, bằng kỹ thuật miễn dịch Peroxidase trên tế bào một lớp
(Immuno Peroxidae Monolayer Assay - IPMA) ñối với các mẫu máu của một số
tỉnh thành phía Nam bảo quản từ năm 2000, Nguyễn Thị Thu Hồng cho biết
PCV2 xuất hiện ở Việt Nam ít nhất từ năm 2000 với tỷ lệ nhiễm 38,97% và tăng
dần ñến 90,26% (năm 2005). Lâm Thị Thu Hương và ðường Mai Chi (2006)
khảo sát tại một số trại lợn công nghiệp ở thành phố Hồ Chí Minh và vùng phụ
cận cho biết tỷ lệ nhiễm PCV2 trên lợn khá cao, 7/9 trại nhiễm trên (77,77%) và
tỷ lệ nhiễm ở các trại biến ñộng cao 12,5- 83,33%.
+ Xác ñịnh sự có mặt của kháng thể kháng PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại một
số tỉnh miền Bắc Việt Nam,
+ Phân lập virus nhằm xây dựng ngân hàng giống virus phục vụ cho các
nghiên cứu khác như chẩn ñoán và sản xuất vacxin phòng bệnh do PCV2 gây ra
ở ñàn lợn.
* Ý nghĩa khoa học:
- ðây là nghiên cứu ñầu tiên về sự lưu hành kháng thể kháng PCV2 ở ñàn
lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
- Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp
theo về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra.
* Ý nghĩa thực tiễn:
- Nghiên cứu cung cấp quy trình chẩn ñoán xác ñịnh PCV2 trong bệnh
phẩm của lợn mắc bệnh.
- Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ sự tồn tại của PCVAD ở ñàn lợn
tại ñịa bàn nghiên cứu giúp xây dựng ñược biện pháp phòng chống bệnh phù hợp.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I. GIỚI THIỆU VỀ PCV2 VÀ BỆNH DO PCV2 GÂY RA
Porcine circovirus (PCV) thuộc họ Circoviridae, bao gồm Porcine
circovirus type 1 (PCV1) và Porcine circovirus type 2 (PCV2).
Trong những năm cuối thập niên 1990, một loại circovirus mới (Porcine
Circovirus) gây bệnh ñã ñược phát hiện ở lợn. Virus này khác với PCV thích
ứng trên môi trường tế bào thận lợn PK15 ñã biết trước ñó. Người ta ñã ñề nghị
- Giống Circovirus: gồm các virus ñã phát hiện ñược từ ñộng vật như
porcine circovirus type 1 và 2 (circovirus ở lợn), canary circovirus (circovirus ở
chim hoàng yến), bovine circovirus (circovirus ở bò), goose circovirus (circovirus
ở ngỗng), ostrich circovirus (circovirus ở ñà ñiểu), raven circovirus (circovirus ở
quạ) và human circovirus (circovirus gây hội chứng mệt mỏi mạn tính ở người).
Các chủng PCV2 phân lập ñược trên thế giới có cùng nguồn gốc với mức
ñộ tương ñồng về kiểu gen khoảng 93% (Larochelle và cộng sự, 2002).
Hiện nay, dựa vào kết quả giải trình tự gen, PCV2 ñược chia thành 5
genotype, ký hiệu từ PCV2a-2e. Genotype PCV2a và PCV2b lại có thể ñược
chia thành các cluster khác nhau (ví dụ PCV2a có 5 cluster 2A-2C; PCV2b có 3
cluster 1A-1C).
1.1.2. Hình thái, cấu trúc
PCV mang bộ gen là ADN virus sợi ñơn vòng chứa khoảng 1759
nucleotide (PCV2) và khoảng 1767 - 1768 nucleotide (PCV2) (Guo và cộng sự,
2010; Olvera và cộng sự, 2007). ðây là một virus trần không có vỏ bọc bên ngoài.
Hình 2.1: Cấu trúc PCV2 (Gillespie và cộng sự, 2009)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
5
Bộ gen của PCV2 gồm 11 khung ñọc mở ORFs (open reading frame) mã
hóa cho các phân tử protein của virus, trong ñó hai khung ñọc mở chính (ORF1
và ORF2) theo hướng ngược nhau. Hiện nay trên thế giới các nghiên cứu về
PCV thường tập trung vào ba ORF là ORF1, ORF2 và ORF3.
ORF1 mã hóa cho các protein liên quan ñến sự nhân lên của virus (viral
replication protein – Rep), có khối lượng phân tử 35,8 kDa. Sự tương ñồng amino
acid của phân tử protein quy ñịnh bởi ORF1 giữa PCV1 và PCV2 khoảng là 85%.
ORF2 mã hóa cho các protein liên quan ñến sự hình thành vỏ capsid của
8
9
10
11
51–995
1735–1034
671–357
565–386
1016–1177
1611–1530
1682–1741
753–688
92–1732
1524–1631
1033–989
Số aa
314
233
104
59
53
27
19
21
42
35
14
1,9
2,3
4,6
4,1
1,8
47–985
1723–1022
658–38
552–205
1163–1450
1518–1330
1670–81
740–627
968–873
1642–1755
648–719
312
233
206
115
95
62
56
37
31
3.7
23
nhân lên trong nhân tế bào, nhưng không gây bệnh tích tế bào. Tischer và cộng
sự (1987) cho biết tế bào PK15 ñược xử lý với glucosamine sẽ giúp cho sự nhân
lên của PCV2 tốt hơn. Do PCV2 không gây bệnh tích tế bào nên ñể khẳng ñịnh
sự nhân lên của virus cần phải làm phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoặc PCR.
ðể phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15 thường mất rất nhiều
công sức và thời gian do phải cấy chuyển nhiều lần, thường chỉ áp dụng trong
nghiên cứu ñể sản xuất vacxin phòng bệnh.
Virus không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
1.1.4. Sức ñề kháng
PCV2 rất bền ở nhiệt ñộ cao và chịu ñược trong ñiều kiện pH dao ñộng
lớn, có khả năng sống ñược 72 giờ ở 800C, 30 phút ở nhiệt ñộ 70 - 750C và 1 giờ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
7
ở 560C; bị bất hoạt ở pH 3 và bởi chloroform. Ở nhiệt ñộ phòng, khi bị tác ñộng
trong 10 phút bởi một số chất sát trùng như chlorhexidine, formol, iodine và cồn
thì hiệu giá của virus sẽ giảm.
Có thể phân lập ñược PCV2 trong bệnh phẩm của lợn bảo quản ở -700C.
1.2. Bệnh do PCV2 gây ra
1.2.1. Loài vật mắc bệnh
Tất cả các giống lợn ñều mẫn cảm với bệnh, kể cả lợn nuôi và lợn hoang
dã, nhưng các loài vật khác không mẫn cảm với PCV2. Khả năng mẫn cảm với
bệnh thay ñổi tùy theo tính biệt, giống lợn, có liên quan ñến sự nhân lên của
PCV2 trong ñại thực bào phế nang. Ví dụ, thường lợn ñực mẫn cảm với bệnh
hơn so với lợn cái; lợn giống Landrace mẫn cảm hơn giống Duroc và ðại Bạch.
Gần ñây, nghiên cứu Potter và cộng sự (2012) ñã khẳng ñịnh bản chất di truyền
của từng giống lợn có ảnh hưởng ñến mức ñộ mẫn cảm với PCVAD.
Chen và cộng sự (2007) cho biết chỉ xác ñịnh ñược kháng thể kháng
tượng giảm sản sinh interferon nhưng tăng lượng IL-10 ở những lợn thực
nghiệm bị nhiễm PCV2 cũng ñã ñược chứng minh. Cho ñến nay, ảnh hưởng của
PCV2 ñến hệ miễn dịch của lợn vẫn còn nhiều tranh cãi và cần phải có các
nghiên cứu ñể làm sáng tỏ. Nghiên cứu cần tập trung làm rõ tác ñộng qua lại
giữa giai ñoạn sau nhiễm trùng và trước khi biểu hiện triệu chứng lâm sàng ñể
giải thích hiện tượng nhiễm trùng cấp tính hoặc/và mạn tính.
Opriessnig và cộng sự (2006) cho biết mặc dù hầu hết lợn trong ñàn có
thể bị nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 – 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu
chứng. Có bốn yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là
cấu trúc và ñộc lực virus, giống lợn, sự ñồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của cơ
thể. Việc sử dụng một số loại vacxin, trong ñó chất bổ trợ sẽ khiến cho tỷ lệ lợn
có triệu chứng PCVAD tăng lên. Ở lợn cùng tiêm một loại vacxin nhưng có chất
bổ trợ khác nhau (ñặc biệt bổ trợ dầu) sẽ làm cho thời gian nhiễm virus cũng
như số lượng PCV2 trong huyết thanh và mô bào tăng lên, tế bào lympho bị tổn
thương nặng hơn so với những lợn ñược tiêm vacxin bổ trợ là keo phèn. Một thí
nghiệm khác cũng cho thấy khi lợn ñược tiêm vacxin phòng bệnh do M.
hyopneumoniae hoặc A. pleuropneumoniae, sau ñó gây nhiễm PCV2 thì thời
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
9
gian PCV2 có trong máu sẽ lâu hơn và các bệnh tích vi thể sẽ trầm trọng hơn so
với những lợn không tiêm phòng vacxin.
ðiểm ñặc biệt trong cơ chế sinh bệnh của PCV2 là hiện tượng ña nhiễm
hoặc bội nhiễm với nhiều loại mầm bệnh khác. Pallares và cộng sự (2002) khi
nghiên cứu trên 484 mẫu bệnh phẩm từ các ca bệnh PMWS chỉ xác ñịnh 1,9%
số mẫu ñơn nhiễm PCV2; 51,9% số mẫu nhiễm kép PRRSV; 35,5% nhiễm kép
với M. hyopneumoniae; 5,4% nhiễm kép với virus cúm lợn và 15% nhiễm kép
với PPV (porcine parvovirus). Bên cạnh ñó, trong trường hợp bại huyết, thường
(PCVAD)”.
1.3.1. Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (PMWS)
PMWS thường xảy ra ở lợn từ 7 – 16 tuần tuổi. Tỷ lệ ốm thường dao
ñộng từ 4 - 30% (ñôi khi lên ñến 50 - 60%), tỷ lệ chết khoảng từ 4 - 20% nhưng
cũng có thể 50%. Do khi lợn mắc bệnh thường còi cọc và giảm hiệu quả kinh tế
nên khoảng 70 – 80% lợn có triệu chứng PCVAD bị giết thịt.
PMWS ñặc trưng bởi hiện tượng còi cọc, da nhợt nhạt, thở khó, ñôi khi bị
ỉa chảy (phân sẫm màu) và có chứng hoàng ñản. Giai ñoạn ñầu bị bệnh các hạch
lympho dưới da ñều bị sưng to.
Bệnh tích ñặc trưng thường quan sát ñược là các hạch lympho bị sưng to
trong giai ñoạn ñầu của bệnh. Bệnh tiến triển, hạch lympho trở lại kích thước
bình thường và thậm chí bị teo nhỏ, tuyến ức bị teo. Phổi có thể sưng to, dai
chắc như cao su, tương ứng với bệnh tích vi thể viêm kẽ phổi. Nhiều trường hợp
phế quản bị viêm tơ huyết.
Gan bị sưng to hoặc teo nhỏ, nhạt màu, cứng, bề mặt có các hạt nhỏ. Một
số lợn bị hoàng ñản trong giai ñoạn cuối của bệnh.
Thận có nốt hoại tử màu trắng (viêm kẽ thận không có mủ).
Bệnh tích vi thể cho thấy lợn mắc PMWS bị giảm tế bào lympho và thâm
nhiễm tế bào khổng lồ ña nhân và tế bào mô (histiocyte). Phần vỏ tuyến ức bị
teo nhỏ. Ngoài ra còn quan sát ñược các tiểu thể virus trong tế bào tua (dendritic
cell) và tế bào mô.
Một số triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc chứng PMWS ñược minh họa
trong hình 2.2 – 2.7.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
11
Hình 2.2. Lợn mắc chứng gày còm
chứng rõ nhất là trên da xuất hiện những ñám phát ban có màu ñỏ tía, không có
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
13
hình dạng nhất ñịnh, bắt ñầu ở vùng chân sau và mông, có trường hợp nốt ban
lại phân tán khắp cơ thể. Bệnh tiến triển, hình thành ñám vẩy sẫm ở những nơi
có bệnh tích, sau ñó nhạt màu dần, ñôi khi ñể lại sẹo.
Bệnh tích ñại thể là hiện tượng hoại tử và xuất huyết mô bào, tương ứng
với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử mạch máu. Hạch lympho, ñặc biệt là hạch
sau bụng có màu ñỏ, sưng to và có thể có chất lỏng chứa trong bụng.
Khi lợn chết thể cấp tính, hai bên thận sưng to, trên bề mặt có nốt màu
trắng, phù thũng bể thận, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử có mủ
tiểu cầu thận và viêm kẽ thận.
Thường thì bệnh tích ở da và thận ñều xuất hiện khi lợn mắc PDNS, tuy
nhiên có những trường hợp chỉ biểu hiện một trong hai bệnh tích trên.
Hạch lympho thường bị sưng to, có màu ñỏ. Lách bị nhồi huyết.
Hình 2.8. Lợn bị viêm da
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
14
Hình 2.9. Lợn mắc chứng gày còm và bị viêm da
1.3.3. Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (PCV2 – Associated Reproductive
Failure)
Hội chứng này ñược mô tả lần ñầu tiên tại Canada năm 1999, chủ yếu ảnh
bẩm sinh và viêm màng não không có mủ. Một số nghiên cứu gần ñây cho biết
lợn bị nhiễm PCV2 có thể gây viêm mạch quản tiểu não và viêm xuất huyết
màng não. PCV2 còn liên quan ñến triệu chứng opisthotonus, chứng giật cầu
mắt và co giật ở lợn từ 6 – 8 tuần tuổi (trích theo Gillespie và cộng sự, 2009).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
16
Copyright: Tài liệu đại học ©