ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

---?&@----

HÀ THỊ PHƢỢNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU
HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.)
Merrill]

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2010


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

---?&@----

HÀ THỊ PHƢỢNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP
GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU
HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.)
Merrill]
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70


nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận
văn
Cuối cùng tôi rất biết ơn những ngƣời thân trong gia đình, các ban cua
tôi đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên
cứu.
Thái Nguyên, tháng 8 năm 2010
Tác giả luận văn


Hà Thị Phƣợng


MỤC LỤC
Trang phu bia

Trang

Lơi cam ơn
Nhƣng chƣ viêt tăt
Danh muc cac bang trong luân an
Danh muc cac hinh trong luân an
MỞ ĐẦU…………………………………………………………..................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………….. .........4
1.1. CÂY ĐÂU TƢƠNG VA ĐĂC TINH CHIU HAN
CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG .............................................................................4
1.1.1. Cây đậu tƣơng……………………………...................…………….....4
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng………… ……….............….. .....8
1.2. CHÂT ƢC CHÊ CYSTATIN VA GEN CYSTATIN
Ở THỰC VÂT VA CÂY ĐÂU TƢƠNG ....................................................12
1.2.1. Chât ƣc chê Cystatin ............................................................................12


3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thƣớc và khối lƣợng hạt
5 giống đậu tƣơng nghiên cứu ......... ............................................................38
3.1.2. Khả năng chịu hạn của 5 giống đậu tƣơng ..........................................39
3.2. KÊT QUA PHÂN LÂP VA XAC ĐINH TRINH TƢ
GEN CYSTATIN Ơ ĐÂU TƢƠNG............................................................40
3.2.1. Tách chiết ARN tông sô ................................................................... 40
3.2.2. KÕt qu¶ RT-PCR ..................................................................................43


3.2.3.. KÕt qu¶ biÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn
E.coli DH5α ............................................................................... ..................44
3.2.4.. Kết quả chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp ........ ..................46
3.2.5. Kết quả tách chiết ADN plasmid ........................................................
47
3.2.6. Kết quả kiểm tra các dòng plasmid ...................................................48

3.2.7. Kết quả giải trình tự nucleotit ................................................. ...........49
KÊT LUÂN VA ĐÊ NGHI……………….........………………. ….......... 58
CÔNG TRINH CÔNG BÔ LIÊN QUAN ĐÊN LUÂN VĂN ..................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 60


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Axit deoxyribonucleic

ARN


Docosa Hexaenoic Axit

EDTA

Ethylendiamin tetraacetic axit

EPA

Eicosa Pentaenoic axit

HSP

Heat shock protein - Protein sốc nhiệt

HSG

Heat Shock Granules

HSPL

Hệ số pha loãng

Kb

Kilo bazơ = 1000 bp

LEA

Late embryogenesis abundant


24

2.3

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

37

2.4

Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector
tách dòng pBT

38

3.1

Màu sắc, sô lƣơng và khối lƣợng hạt của 6 giống đậu

42

tƣơng nghiên cứu
3.2

Đanh gia kha năng chiu han cua

6 giông đậu tƣơng

45


Hình ảnh cây đậu tƣơng 3 lá trƣớc khi xử lý hạn

44

3.3

Hình ảnh cây đậu tƣơng 3 lá sau khi xử lý hạn

44

3.4

Kết quả tách chiết RNA tổng số

46

3.5

KÕt qu¶ PCR nhân gen cu a giông đâu tƣơng Thai

48

Nguyên
3.6

Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả
biến E. coli DH5α

49



cystatin cua 10 giông đâu tƣơng
3.12

Trình tự

axit amin cua mâu nghiên cƣu Thai

Nguyên va 4 mâu giông đâu tƣơng đa công bô trên
genbank

60


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Đậu tƣơng Glycine max (L.) Merrill là loại cây có vị trí quan trọng trong
cơ cấu cây trồng nông nghiệp, có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao.
Hạt đậu tƣơng chứa 30%- 46% protein, 12%-25% lipit, và nhiều loại vitamin
(B1, B2, C,D, E, K…), chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin,
triptophan, metionin, xystein, lizin…), là nguồn năng lƣợng cần thiết cho con
ngƣời.
Cây đậu tƣơng có thời gian sinh trƣởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi
khuẩn cố định đạm, tạo khả năng cố định nitơ không khí thành chất hữu cơ
nên cây đậu tƣơng thƣờng đƣợc trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và
cải tạo đất bạc màu. Vì vậy trồng đậu tƣơng góp phần cải tạo đất và bảo vệ
môi trƣờng. Với những giá trị to lớn đó, mà cây đậu tƣơng đƣợc trồng phổ
biến ở nhiều nƣơc trên thế giới, phát triển mạnh ở Mỹ, Braxin, Argentina
, Trung Quốc va Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây đậu tƣơng đƣợc gieo trồng ở cả
7 vùng nông nghiệp trên cả nƣớc với nguồn gen rất đa dạng và phong phú,

rễ cây dẻ (Castanea sativan) gặp lạnh, sốc muối, stress nóng thì mức độ phiên
mã tăng mạnh ở cả tế bào rễ và tế bào lá. Cystatin ở cây dẻ không chỉ liên
quan đến phản ứng tự vệ với các mầm bệnh và sâu hại mà còn liên quan đến
khả năng chống lại tác động bất lợi của các nhân tố môi trƣờng. Cystatin và
gen mã hóa cystatin cũng đã đƣợc nghiên cứu ở cây đậu xanh (Nguyễn Vũ
Thanh Thanh và cs, 2008), ở lúa (Ngô Mạnh Dũng và cs 2008) và ở một số
loài cây nhƣ đậu đũa, cỏ dại… Đối với cây đậu tƣơng việc nghiên cứu về
cystatin và gen mã hóa protein này vẫn còn là vấn đề mới mẻ.


Từ những lý do trên tôi đã chọn và tiến hành đề tài luận văn thạc sĩ là:
''Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính
chịu hạn ở cây đậu tương"
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định khả năng chịu hạn và phân nhóm khá c nhau vê mƣc đô chiu
hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu;
- Phân tich đăc điêm cua gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn
của cây đậu tƣơng.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích khả năng phản ứng đối với hạn của các giống đậu tƣơng ở
giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo;
- Tách chiết ARN tổng số từ hạt đậu tƣơng ở giai đoạn hạt non;
- Thu thâp thông tin vê gen cystatin , thiết kế và tổng hợp cặp mồi để
nhân gen cystatin;
- Tạo dòng cADN từ mARN băng phan ƣng phiên ma ngƣơc va nhân
gen cystatin bằng kĩ thuật PCR;
- Đọc trình tự nucleotide cua gen cystatin ở cây đậu tƣơng.


Chƣơng 1

tƣơng còn có tác dụng hữu hiệu giả m cholesterol trong máu, giảm thiểu nguy
cơ các bệnh liên quan đến tim mạch, ngăn cản sự phát triển các mầm bênh
ung thƣ, ngăn ngừa bệnh thận , bệnh tiểu đƣờng va bệnh xốp xƣơng [14].
Đậu tƣơng là cây trồng có giá trị kinh tế cao, là cây công nghiệp, cây
thực phẩm, vừa là cây cải cải tạo đất, tăng năng suât cây trông vơi thơi gian
sinh trƣơng ngắn ngày, trồng đƣợc nhiều vụ trong năm, với các nhóm giống
chín sớm, trung bình và muộn. Thời gian sinh trƣởng là một yếu tố rất quan
trọng để lựa chọn cây trồng luân canh tăng vụ [15], theo thời gian sinh trƣởng
có thể phân ra các giống đậu tƣơng chín rất sớm (75-90 ngày), các giống chín
sớm (90-100 ngày), các giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn
trung bình (110-120 ngày), các giống chín muộn (130-140 ngày), các giống
chín rất muộn (140-150 ngày). Đậu tƣơng là cây tƣơng đối mẫn cảm với điều
kiện ngoại cảnh. Trong tập đoàn giống đậu tƣơng có những giống chỉ trồng
vào vụ hè, có những giống chỉ trồng vào vụ đông, có những giống trồng ở vụ
xuân hè và có những giống trồng thích hợp với vụ thu đông [9].
Đậu tƣơng là cây trồng chiến lƣợc của nhiều quốc gia . Cây đậu tƣơng
chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền nông nghiệp nƣớc ta nói riêng v à
trên thê giơi noi chung . Vì đâu tƣơng là cây ngắn ngày , hạt có giá trị dinh
dƣơng cao , là nguồn nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm

(ép

dâu, làm bánh kẹo , đô uông ), làm thực phẩm cho ngƣời và thức ăn cho chă
n nuôi. Ngoài ra c ây
đâu tƣơng con la cây cai tao đât tôt

,... Ở Việt Nam, phát

triên đâu tƣơng đang la môt trong 10 chƣơng trinh ƣu tiên ơ nƣơc ta [56],
đậu tƣơng đang đƣợc trồng trên cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nƣớc, do điều

Nam Mỹ. Quê hƣơng của đậu tƣơng là Đông Nam châu Á, nhƣng 45% diện
tích trồng đậu tƣơng và 55% sản lƣợng đậu tƣơng của thế giới nằm ở Mỹ.
Nƣớc Mỹ sản xuất 75 triệu tấn đậu tƣơng năm 2000, trong đó hơn một phần
ba đƣợc xuất khẩu. Các nƣớc sản xuất đậu tƣơng lớn khác là Brasil,
Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ.
Theo Oil World, sản lƣợng đậu tƣơng thế giới niên vụ 2007 - 2008 đạt
tổng cộng 221,33 triệu tấn. Theo đo, Argentina là nƣớc cung cấp đậu tƣơng và
sản phẩm đậu tƣơng lớn nhất thế giới. Trong năm 2007, Argentina cung cấp
59% tổng xuất khẩu dầu đậu tƣơng thế giới. Hãng phân tích hạt có dầu Oil
World đã điều chỉnh tăng mức dự báo về sản lƣợng đậu tƣơng thế giới niên vụ
2009 - 2010 lên 258,2 triệu tấn, tăng 2,7 triệu tấn so với dự báo hồi tháng 3,
và tăng 46,5 triệu tấn so với niên vụ trƣớc. Con số này cao hơn so với mức


tiêu thụ đậu tƣơng toàn cầu là 234,2 triệu tấn do Oil World dự báo. Nam Mỹ
đã thu hoạch xong vụ mùa của mình, với sản lƣợng cao hơn nhiều so với năm
ngoái - khi hạn hán xảy ra. Sản lƣợng đậu tƣơng Brasil dự báo sẽ đạt 67,5
triệu tấn, tăng 1,5 triệu tấn so với dự báo trƣớc đây và tăng so với 57,5 triệu
tấn năm ngoái. Sản lƣợng của Argentina ƣớc tính đạt 54 triệu tấn, tăng 0,7
triệu tấn so với dự báo trƣớc đây và so với 31,5 triệu tấn năm ngoái.
Argentina đang thu hoạch vụ mùa, song thời tiết ở miền Bắc nƣớc này còn
nhiều yếu tố bất ngờ.
Theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản lƣợng đậu tƣơng trên
thế giới năm 2010- 2011 sẽ đạt 249,93 triệu tấn. Tổng diện tích đậu tƣơng thế
giới dự báo đạt 101,37 triệu ha; năng suất bình quân sẽ đạt 2,47 tấn/ha so với
2,54 tấn/ha của năm 2009- 2010. Sản lƣợng đậu tƣơng năm 2010-2011 của
các nƣớc dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Mỹ 90,08 ; Braxin 65,00 Achentina
50,00 ;Trung Quốc 14,60 ; Ấn Độ 8,80 ; Paragoay 6,50 ; Canađa 3,65 và các
nƣớc khác 11,30. Tổng diện tích, tổng sản lƣợng đậu tƣơng trên thế giới va
sản lƣợng của các nƣớc năm 2010-2011 dƣ bao giảm so với năm 2009-2010.

dẫn đến tế bào, mô bị tổn thƣơng và chết.
Tùy theo từng loài, giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng nhƣ
thiệt hại do khô hạn gây ra khác nhau: một số bị chết, một số bị tổn thƣơng
nhƣng cũng có một số khác không bị ảnh hƣởng. Khả năng thực vật có thể
giả m thiểu mức tổn thƣơng do thiếu hụt nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn.
Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô hạn gọi
là cây chịu hạn.
Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái
của môi trƣờng nhƣ hạn, nóng, lạnh,... Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại


cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây, giả m năng suất sinh học. Đã có rất
nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn ở cây đậu tƣơng, ngô, lúa,
đậu xanh [1], [2], [8], [12], [18], [19].
Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giả m năng suất gieo
trồng, nó làm giảm 50% năng suất cây trồng và có khi còn nhiêu hơn thế nữa.
Trên thế giới có khoảng 40 - 60% diện tích đất trồng bị hạn. Ở nƣơc ta , địa
hình phức tạp, khí hậu cũng rất phức tạp, lƣợng mƣa phân bố không đều giữa
các vùng trong năm, cùng với các nguyên nhân khác nhƣ sự bùng nổ dân số, ô
nhiễm môi trƣờng dân đên môi trƣơng

biên đôi nên hạn hán, lũ lụt

thƣờng xuyên xảy ra.
Chịu hạn ở thực vật thƣờng kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress hoạt
đông đông thơi . Khi nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lý, hóa sinh và cấu
trúc tế bào ngƣời ta nhận thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở những mức
độ khác nhau, trong giai đoạn phát triển khác nhau. Điều này chứng tỏ tính
chống chịu của thực vật do nhiều gen quyết định. Tuy nhiên hiện nay ngƣời ta
vẫn chƣa xác định đƣợc chính thức gen nào quy định tính chịu hạn của cây

hạn bằng những biến đổi về hình thái nhƣ lá có nhiều lông, lớp cutin dày, lá
cuộn lại thành ống, ... để giả m thoát hơi nƣớc. Trong môi trƣờng khô hạn, cây
có thể chống lại sự mất nƣớc hoặc nhanh chóng bù lại phần nƣớc đã bị mất
nhờ hoạt động của bộ rễ và sự điều chỉnh ASTT của tế bào.
Ở giai đoạn cây con khi gặp hạn, đậu tƣơng có thể dễ vƣợt qua hơn,
còn ở những giai đoạn sau nhƣ giai đoạn ra hoa, kết quả, hạt chín sữa mà gặp
hạn thì sẽ dẫn đến năng suất giả m đáng kể.
Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có nhiều thành công khi
nghiên cứu sâu hơn về tính chịu hạn của cây đậu tƣơng. Maitra và Cushman
(1994) đã phân lập đƣợc cDNA của dehydrin từ lá đậu tƣơng khi bị mất nƣớc.
Jinn và các tác giả khác (1997) nghiên cứu về sHSP nhóm 1 (15-18kDa) đã


nhận thấy, chúng tăng lên ở lƣợng lớn trong mầm đậu tƣơng dƣới tác động của
nhiệt độ đƣợc tìm thấy ở cấu trúc dạng hạt trong nguyên sinh chất và trong
nhân cùng với protein bị biến tính [31]. Năm 2004, nhóm nghiên cứu Huang
và cs (Đài Loan) đã phân lập đƣợc gen P5CS Ở đậu tƣơng từ mARN với
kích thƣớc 2148bp. Gen P5CS là nhân tố giới hạn cho nhịp độ tổng hợp
proline ở thực vật trong điều kiện bất lợi do hạn và do mặn gây nên.
Nghiên cứu của Porcel và cs (2005), đã chỉ ra rằng, gen mã hoá protein
dehydrin (LEA-DII) có vai trò với khả năng chống chịu hạn của đậu tƣơng. Ở
Việt Nam đã có một số tác giả nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây đậ u
tƣơng, công trinh đanh gia khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng nhập
nội của Nguyễn Huy Hoàng (1992) phân lập các gen liên quan đến khả năng
chịu nóng, chịu hạn của cây đậu tƣơng. Nghiên cứu phân lập và đọc trình tự
gen chaperonin tƣ
vơi kich thƣơc phân tƣ

giông đâu tƣơng chiu lanh Bonminori - Nhât Ban
1,6 Kb của Nông Văn Hai va cs (1997) [34]. Nghiên

có bản chất protein [30]. Chúng có mặt trong vi sinh vật, động vật, thực
vật, là chất ức chế cysteine proteinase.
Các nghiên cứu chứng minh rằng cysteine proteinase đƣợc phân tách
từ ấu trùng của các côn trùng có thể đƣợc ức chế bởi cả bởi non-proteinaceous
và proteinaceous cystatin. Một số thành viên trong lợp bọ cánh cứng bao gồm
côn trùng ăn củ, hạt, rễ và lá. Sự tồn tại của cysteine proteinase trong ruột của
côn trùng để phân giải các protein có chứa trong thức ăn của chúng, đã chứa
cả phytocytatin nhƣ là các protein liên quan đến cơ chế phòng chống đối với
ngoại cảnh (Abe et al., 1992; Gillikin et al., 1992; Waldron et al., 1993;
Gruden et al., 2004) [22], [40], [41], [42]. Hiệu ứng của chất gây ức chế
enzyme phân hủy protein trên bộ máy tiêu hóa của côn trùng là một lĩnh vực
nghiên cứu rất quan trọng và những kết quả thu đƣợc có sức thuyết phục lớn
trong lĩnh vực phòng chống côn trùng trong sinh thái học.


Các chất ức chế phân hủy protein Cys đóng vai trò quan trọng trong
thực vật, từ việc kiểm soát các quá trình sinh lý khác nhau và các quá trình
sinh tổng hợp trong tế bào ở thực vật tới việc gây ức chế của các enzyme p
hân hủy Cys ngoại sinh vẫn còn là những dấu hỏi bên trong các động vật chân
đốt ăn thực vật và các loại sinh vật gây bệnh khác để tiêu hủy hoặc là tái hợp
các mô thực vật.
1.2.1.2. Phân loại Cystatin
Cystatin thực vật đƣợc mô tả lần đầu tiên ở lúa vào năm 1987 bởi Abe
và cs. Các cystatin tìm thấ y co môi liên quan đên nhau

tạo thành “liên

họ cystatin”. Các thành viên của liên họ cystatin có thể đƣợc chia thành ba
họ protein có liên hệ mật thiết với việc tạo thành các cystatin động vật
(Barrett et al., 1986; Barret 1987) [23], [24] và một họ thuộc cystatin thực