LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong tổ
phương pháp giảng dạy, các thầy cô trong khoa Sinh - KTNN, các thầy cô
giáo trong trường ĐHSP Hà Nội 2 và các bạn sinh viên. Đặc biệt em xin bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới cô Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình giúp
đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Do lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học. Hơn nữa
do thời gian và năng lực của bản thân còn hạn chế, mặc dù đã rất cố gắng
nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong nhận được
sự đóng góp ý kiến của các thầy, cô giáo và các bạn sinh viên để khóa luận
của em được hoàn thiện và có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2012
Sinh viên

Phạm Thị Ngọc Mai

1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật.
Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập
từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có tài liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đã công bố.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng năm 2012
Sinh viên

Phạm Thị Ngọc Mai


2.1. Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất ............................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 16

3


2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 16
2.1.4. Môi trường nghiên cứu ........................................................................ 17
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản) ...................................... 17
2.1.4.2. Môi trường nhân giống ...................................................................... 17
2.1.4.3. Môi trường lên men............................................................................ 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................. 18
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc ............................................................. 18
2.2.1.2. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng
phương pháp nhuộm Gram................................................................. 18
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng ................... 19
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hoá giống.............................................................. 19
2.2.1.5. Phương pháp lên men tạo màng ......................................................... 19
2.2.1.6. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose ........................ 19
2.2.2. Phương pháp toán học ........................................................................... 20
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 21

3.1. Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 .. 21
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2 và CH14 ...................................................................... 22
3.2.1. Xác định hàm lượng acid acetic tạo thành của các chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 .................................................... 22
3.2.2. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên kính


A.xylinum

: Acetobacter xylinum

BC

: Bacterial cellulose

MT

: Môi trường

Cs

: Cộng sự

CS

: Cellulose synthase

PGM

: Phosphoglucomutase

PC

: Plant cellulose

GK

lượng màng BC ở chủng CH14
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn pepton ở nồng độ khác nhau đến khối
lượng màng BC ở chủng BHN2

7


2. DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC
Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật
Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum
Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum
Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.3. Khuẩn lạc A.xylinum trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum
Hình 3.5. Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn quá trình sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2 và CH14
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự tạo thành acid acetic trong dung dịch lên men
của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14

8


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Ngày nay công nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật
chủ đạo của nhiều quốc gia trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh
với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công

của tia UV…[18], [24].
Nhờ những đặc tí nh độ c đáo trên mà màng BC được coi là nguồn
polimer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện
nay. Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa
sau của thế kỷ XIX và hiện đ ược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: trong công nghiệp sản xuất giấy màng BC được dùng để sản xuất giấy
điện tử chất lượng cao; trong công nghệ môi trường đã sử dụng màng BC làm
màng phân tách để sử lý nước và

biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989;

Jonas và Fonah, 1998). Ngoài ra, màng BC còn được dùng làm chất mang đặc
biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm các sợi truyền
quang, là môi trường cơ chất trong sin h học sử dụng cố đị nh protein thay cho
sắc ký . Trong công nghiệp thực phẩm sử dụng vi khuẩn A.xylinum nuôi trên
môi trường nước dừa tạo màng BC để sản xuất th ạch dừa. Trong lĩ nh vực mỹ
phẩm và dược phẩm , lợi dụng những đặc tính quý báu của màng BC như
thông thoáng , kháng khuẩn , tính tương đồng về cấu trúc với sợi collagen
trong da nên màng BC được coi là nguồn nguyên liệu quý giá dùng làm mặt
lạ dưỡng da, da nhân tạo, dùng trong điều trị bỏng và tổn thương da [9], [25].
Ở Việt Nam hiện nay, do nhu cầu màng trị bỏng lớn, nhưng hầu hết đều
phải nhập ngoại với giá thành cao. Trong khi đó màng BC có thể tự sản xuất
trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền. Nên nếu chế tạo
thành công màng BC từ vi khuẩn A.xylinum sẽ có ý nghĩa rất cao trong tình
hình điều trị bỏng ở nước ta hiện nay [27].
Do sự đa dạng về các mặt ứng dụng như trên và với mong muốn được
tìm hiểu thêm về vi khuẩn A.xylinum, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều
ứng dụng hữu ích của nó, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu một số đặc
tính sinh học của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng
BC”.

1.1. Lƣợc sử nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter
Từ lâu người ta đã biết acid acetic ở dạng giấm nhưng cho đến những
năm đầu thế kỷ XIX người ta mới điều chế được acid acetic và biết được rằng
giấm là sản phẩm lên men của 1 chủng vi khuẩn có tên là Acetobacter hay vi
khuẩn acetic.
Người đầu tiên nghiên cứu những màng mỏng của giấm là nhà bác học
Person vào năm 1822. Ông đã chứng minh được đó là một loại vi sinh vật có
tên là Mycoderma aceti.
Năm 1837, Kiitsing đã khẳng định rõ vai trò của vi sinh vật trong quá
trình lên men giấm. Cũng năm này Hansen đã tách được từ màng giấm loại vi
khuẩn thuần khiết đó là Mycoderma aceti [22].
Năm 1862-1868, Frateur đã chứng minh được sự đúng đắn trong nhận
xét của ông Kiitsing “Để thực hiện quá trình lên men nhất thiết phải có vi sinh
vật”. Ông đã khẳng định bản chất của vi sinh vật trong quá trình lên men
acetic là một tác nhân quan trọng. Trong quá trình này do phát hiện ra kính
hiển vi điện tử nghiên cứu màng xuất hiện trên bia và rượu vang. Ông kết luận
rằng màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn ông cũng gọi đó là
Mycoderma aceti [23].
Những nghiên cứu tiếp theo đều nhằm mục đích cái tiến quá trình lên
men acetic và tiến hành phân loại chúng.
Beijerinck, 1899 ông đã phân loại vi khuẩn dựa vào hai dấu hiệu:
Một là: Dựa vào khả năng sử dụng đạm amoni để thực hiện sự sinh
trưởng và phát triển của mình.
Hai là: Dựa vào giai đoạn di động có hay không trong quá trình phát
triển.

12


Năm 1926, Henneberg chia tất cả vi khuẩn acetic thành bốn nhóm theo

Trên bề mặt môi trường dịch thể tạo màng nhầy có chưa xenluloza
dạng điển hình là: Acetobacter xylinum.
Trên bề mặt môi trường dịch thể không tạo màng nhầy chứa
xenluloza dạng điển hình là: Acetobacter rancens, Acetobacter pasteurianus,
Acetobacter kneizigianus.
Loại 2: Không oxi hóa acid acetic
Tạo thành sắc tố trên môi trường có đường glucoza
Sắc tố nâu tối tới đen nhạt: Acetobacter melanogenus
Sắc tố hồng: Acetobacter
Không tạo thành sắc tố
Nhiệt độ thích hợp nhất từ 30-350C: Acetobacter suboxydans
Nhiệt độ thích hợp nhất từ 18-210C: Acetobacter oxidans [15],[16]
Năm 1960, Shiwel và Carr nghiên cứu về đặc trưng môi trường nuôi
cấy và sinh hóa của vi khuẩn. Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất nằm trong
giới hạn 30-350C. Hai ông đã đi đến kết luận không thể có sự phân loại đồng
nhất giữa các vi khuẩn Acetobacter [25], [26].
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.2.1. Đặc điểm chung về vi khuẩn Acetobacter xylinum
* Đặc điểm hình thái, tế bào học
A.xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng
2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng
nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm
iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ
4,5% acid acetic trong môi trường. Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá
giới hạn cho phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [9].

14





Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn A.xylinum
theo Frateur (1950)
STT
1
2
3

Đặc điểm

Hiện tƣợng

Kết quả

Oxy hoá ethanol

Chuyển hoá môi trường chứa Bromphenol

thành acid acetic

Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

Hoạt tính catalase

Hiện tượng sủi bọt khí

+

Sinh khối không phát triển


trên môi trường chứa CaCO3

+

Không hình thành sắc tố nâu

_

Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

+

* Đặc điểm về sinh trƣởng
Vi khuẩn acetic phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường
có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay mannitol,… trong điều kiện
hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-300C, pH: 5,4 - 6,8 [15],[16].
Tính chất đặc trưng nhất của vi khuẩn acetic là khả năng oxy hóa rượu
etylic thành acid acetic ở pH: 4,5. Ngoài ra, chúng còn thực hiện quá trình oxy
hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của
chúng) để tạo thành các hợp chất xeto hay các acid hữu cơ tương ứng.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn cacbon, nguồn
nitơ và chất sinh trưởng rất đa dạng, chúng có thể đồng hóa nhiều loại thức ăn
cacbon khác nhau như: các loại đường (monosaccaride, disaccaride,

16


polysaccaride) rượu etylic, acid hữu cơ, nhưng không sử dụng được tinh bột và
lactose.

1.4.1. Đặc điểm cấu trúc của màng bacterial cellulose
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.
Chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn.

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật
Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải
lớn của tế bào khác bằng liên kết hydro hoặc Vandervan tạo thành dạng sệt
(gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể
vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính
vì thế mà màng BC được mở rộng [21].

18


Hình 1.3. Sự hình thành những dải ribbon trong màng BC của A.xylinum
1.4.2. Cơ chế tổng hợp bacterial cellulose

Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở A.xylinum

19


Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều
hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại
enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà [12], [13].

men [9], [14].
1.5.3. Ảnh hưởng của các hợp chất chứa cacbon, nito, photpho
Để đảm bảo hoạt động sống bình thường của vi khuẩn, môi trường thức
ăn ngoài rượu, nước còn phải cung cấp thêm muối khoáng, nguồn cacbon,
nguồn nitơ dễ hấp thụ như: CaHPO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, KHPO4,
MgSO4.7H2O... tùy nhu cầu cụ thể của từng loại. Ngoài ra môi trường cung
cấp thêm vitamin và các chất kích thích sinh trưởng như : pepton, cao nấm
men, cao thịt,...
1.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic và rượu etylic
Acid acetic có tác dụng ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nồng độ
acid 8% vi khuẩn hoạt động kém, khi nồng độ acid từ 12-14% thì hoàn toàn
đình chỉ hoạt động. Vì vậy, nồng độ acid acetic cần dùng hoạt hóa vào khoảng
2-2,5% (Nodes) và 2% (Ebner, 1985). Nồng độ rượu cao nhất để oxy hóa 56%. Khi không có rượu etylic trong môi trường vi khuẩn sẽ chuyển hóa acid
acetic thành CO2 và H2O [7], [8], [9].
1.6.Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới và ở Việt Nam
1.6.1. Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới
Vi khuẩn A.xylinum và màng BC của chúng đã thu hút được sự chú ý
của nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực
công nghệ: trong công nghệ môi trường, các nhà khoa học đã dùng màng phân
tách để xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng,
dùng màng như một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền
quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực
phẩm. Đặc biệt trong công nghiệp dệt đã sử dụng chúng để sản xuất vải đặc

21


biệt có giá trị kinh tế cao. Trong công nghiệp giấy, màng BC được sử dụng để
sản xuất giấy điện tử có chất lượng cao [1], [4].
Ứng dụng nổi bật nhất của màng BC là trong lĩnh vực y học. Trong y

bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các
loại vật liệu che phủ tạm thời. Việc sử dụng các vật liệu che phủ tạm thời có
nguồn gốc từ da dị loại để che phủ vết thương phần mềm, vết bỏng đã được
sử dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ
dừng lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi. Mặc dù da dị loại tươi có
những ưu điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những
nhược điểm nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và
xử lý phức tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng
loại là lý tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều
trường hợp rất khan hiếm; không đủ đáp ứng được. Chính vì vậy vật liệu che
phủ tạm thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan
trọng trong điều trị bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được
quan tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn [10], [11].
Trên thế giới, tác giả Wan (Canada) đã có những nghiên cứu về màng
BC từ A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad, Czaia và cộng sự
đã dùng màng BC làm da nhân tạo, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [20].
Năm 2006, Bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh Đại học Y Dược Tp.HCM đã
chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương
pháp lên men. Màng có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt
hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời.
Năm 2010, nhóm nghiên cứu đề tài B.2010 - 18 - 69TĐ của Đinh Thị
Kim Nhung cũng đang nghiên cứu thu nhận màng BC từ chủng vi khuẩn
Acetobacter, ứng dụng trị bỏng.

23


CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và thiết bị hóa chất

2.1.4. Môi trường nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (môi trường cơ bản):
Glucose: 20g/l

(NH4)2SO4: 3g/l

Pepton:5g/l

KH2PO4: 2g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

Nước máy: 1000 ml

Agar: 20g/l
2.1.4.2. Môi trường nhân giống:
Glucose: 20g/l

KH2PO4: 2g/l

Pepton: 5g/l

MgSO4.7H2O: 2g/l

(NH4)2SO4:3g/l

Nước máy: 1000 ml

2.1.4.3. Môi trường lên men
Bảng 2.1. Thành phần các môi trƣờng lên men

2

Agar

20g

3

(NH4)2SO4

3g

3g

3g

3g

5g

3g

4

KH2PO4

2g

2g


2%

2%

7

Pepton

3g

5g

8

Nước mía ép

9

Nước dừa

10

Nước máy

5g

2g
2%

200ml