BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Dương Thị Huệ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT
MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT
PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN
ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7,
EXON 8 CỦA GEN SMN1 GÂY BỆNH THOÁI
HÓA CƠ TỦY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Dương Thị Huệ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT
MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT
PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN
ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7,
EXON 8 CỦA GEN SMN1 GÂY BỆNH THOÁI
HÓA CƠ TỦY
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:
60 42 01 14

Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã chỉ dạy giúp đỡ và động viên tôi trong việc thực hiện luận
văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô trong Khoa Sinh, Bộ môn Y sinh học phân
tử, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ
tận tình trong việc nghiên cứu luận văn này.
Xin chân thành gửi lời cảm ơn tới bạn Phạm Quốc An, bạn Nguyễn Huỳnh Minh
Quân và toàn thể cán bộ công tác tại phòng thí nghiệm bộ môn Y sinh học phân tử,
Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bệnh Viện Nhi đồng I, Bệnh viện Nhi đồng II
đã tạo điều kiện cho tôi tiến hành thu thập mẫu nghiên cứu luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè lớp SHTN Khóa 22 đã động viên,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận văn này.
Qua đây con cũng xin được gửi lời biết ơn sâu sắc tới Bố Mẹ và các anh chị đã
động viên hỗ trợ con trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu luận văn này.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 9 năm 2013
TÁC GIẢ LUẬN VĂN
Dương Thị Huệ

2


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

bp

Base pair

CK


MLPA

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI

National Center for Biotechnology Information

Nu

Nucleotide

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

SMA

Spinal Muscular Atrophy

SMN


3. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................................8
4. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................................9
5. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................................9
6. Đóng góp của luận văn ...................................................................................................9
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn.................................................................9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 11
1.1. Đặc điểm của bệnh thoái hóa cơ tủy ........................................................................11
1.1.1. Đặc điểm lâm sàng và tiêu chuẩn cận lâm sàng .................................................... 11
1.1.2. Di truyền bệnh SMA ............................................................................................. 12
1.1.3. Bệnh học phân tử ................................................................................................... 14
1.1.4. Chữa trị bệnh SMA ............................................................................................... 22
1.2. Các phương pháp xác định đột biến gen smn1 .......................................................23
1.2.1. Phương pháp Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification ..................... 23
1.2.2. Phương pháp PCR - Restriction fragment length polymorphism (PCR - RFLP) . 26
1.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescent insitu hybridization -FISH) . 27
1.2.4. Real - time PCR .................................................................................................... 28
1.2.5. Giải trình tự gen bằng máy tự động....................................................................... 29
1.3. Lược sử nghiên cứu của đề tài ..................................................................................29
1.3.1. Lược sử nghiên cứu trên thế giới........................................................................... 29
1.3.2. Lược sử nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................................... 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 32
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................32
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất .........................................................................32
2.2.1. Quá trình nghiên cứu sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ sau .............................. 32
2.2.2. Hóa chất ................................................................................................................. 33
4



3.5.2. Kết quả phân tích thai nhi của gia đình bệnh nhân SMA11 .................................. 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 66
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 73

5


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Thoái hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy - SMA) là bệnh di truyền do gen lặn nằm
trên nhiễm sắc thể thường, bệnh được mô tả đầu tiên bởi nhà thần kinh học Guido Wernig
(người Australia) vào năm 1891 [10]. Đây là một trong những bệnh thần kinh cơ di truyền
thường gặp. Tần suất mắc bệnh 1/10.000 - 1/25.000 và tần suất người bình thường mang
gen bệnh là 1/50 [40].
Người ta đã phát hiện 4 gen liên quan đến bệnh, mỗi gen gồm hai bản sao có trình tự
tương đối giống nhau: gen SMN (Suvival motor neuron: gồm SMN1 và SMN2); Neuroral
apoptosis inhibitory protein gene (NAIP và ΨNAIP); Basal transcription factor subunit p44
(p44t và p44c); H4F5c và H4F5t [34].
Nguyên nhân chính gây bệnh SMA là do đột biến gen SMN (survival motor
neuron).Gen SMN nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 5 (5q13), gồm hai bản sao
SMN1 và SMN2, hai gen này có trình tự gần như giống nhau, chỉ khác nhau ở 5 nucleotide.
Gen SMN1 nằm ở vùng telomer, gen SMN2 nằm ở vùng centromer trên nhiễm sắc thể. Gen
SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh vận động
tủy sống (spinal motor neuron). Cả hai gen SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein tương
ứng, tuy nhiên do sự khác nhau ở một vài nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có
chức năng, trong khi protein do gen SMN2 tổng hợp có chức năng rất hạn chế. Do đó, khi
gen SMN1 bị đột biến dẫn đến không tổng hợp protein thực hiện chức năng gây bệnh
SMA. Các tác giả khẳng định đột biến gene SMN1 là nguyên nhân chính gây nên bệnh

truyền chỉ sau bênh loạn dưỡng cơ Duchenne và chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu,
cuối cùng bệnh nhân sẽ tử vong. Trẻ em mắc bệnh SMA là một gánh nặng cho gia đình, xã
hội và chính bản thân bệnh nhân. Do vậy hiện nay các nhà khoa học chọn lựa phương pháp
sàng lọc trước sinh với mục đích hạn chế sinh ra các em bé mắc bệnh thoái hóa cơ tủy.
Cũng như các bệnh di truyền khác, trong bệnh thoái hóa cơ tủy, người con mắc bệnh không
phải 100% là do nhận gen bệnh từ bố mẹ mà có thể do bản thân người con tự đột biến trong
quá trình hình thành giao tử [42]. Do vậy khi đã chẩn đoán chính xác vị trí đột biến của
người con thì cần phải xác định kiểu gen của bố mẹ bệnh nhân. Nếu bố và mẹ là người
mang gen bệnh (kiểu gen dị hợp tử) thì đến lần mang thai sau bắt buộc phải tiến hành chọc
ối và chẩn đoán xem thai nhi có bị đột biến không để tư vấn di truyền và có hướng xử lý kịp
thời. Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng
kĩ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến mất
đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy”.
7


2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định tỉ lệ đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1 ở các bệnh nhân
thoái hóa cơ tủy.
- Xác định tỉ lệ người lành mang gen ở bố mẹ bệnh nhân.
- Phân tích kiểu gen của thai nhi và tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng có kiểu gen
dị hợp tử đang mang thai.
3. Đối tượng nghiên cứu
- Nhóm chứng: Gồm 30 người bình thường, không mắc bệnh SMA trong đó có 15
nam và 15 nữ. Được dùng để hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại các đoạn dò và làm mẫu

đối chứng khi tiến hành phản ứng MLPA cùng với mẫu bệnh nhân.
- Nhóm nghiên cứu:
(1) Gồm 50 bệnh nhân: Các bệnh nhân này được chọn từ kết quả chẩn đoán dựa trên
các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như sau:

6. Đóng góp của luận văn
- Xác định tỉ lệ bệnh nhân SMA mang đột biến gen SMN1 ở Việt Nam bằng phương
pháp MLPA.
- Xác định tỉ lệ cha mẹ bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử bằng phương pháp MLPA.
- Chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền cho các gia đình bệnh nhân SMA mang đột
biến đồng hợp tử gen SMN1.
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
* Ý nghĩa khoa học
Các bệnh lý di truyền nói chung hay bệnh thoái hóa cơ tủy nói riêng là những bệnh
chưa điều trị được ở Việt Nam. Phần lớn chỉ điều trị triệu chứng để kéo dài thời gian sống
của bệnh nhân. Đối với bệnh thoái hóa cơ tủy, phần lớn bệnh nhân tử vong sớm do suy hô
hấp. Tỷ lệ người lành mang gen bệnh chiếm tỷ lệ khoảng 1/50, do vậy nếu không quản lý
được người lành mang kiểu gen dị hợp tử thì gen bệnh sẽ lan truyền trong cộng đồng và tỷ
lệ trẻ em mắc bệnh sẽ ngày càng tăng cao. Từ thực tế này, các nhà khoa học khuyên phải
phát hiện các cặp vợ chồng mang gen bệnh và tư vấn chẩn đoán trước sinh bệnh thoái hóa
cơ tủy để phát hiện sớm các thai nhi mắc bệnh, có hướng xử trí thích hợp. Ở Việt Nam,
phần lớn các cặp vợ chồng không được sàng lọc trước bệnh thoái hóa cơ tủy, đa số đã sinh
con mắc bệnh mới đi khám và phân tích gen. Do vậy chúng ta cần chẩn đoán đột biến gen
SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy ở người con, sau khi xác định được kiểu gen và vị trí đột
biến ở người con sẽ phân tích kiểu gen của bố mẹ xem có mang gen bệnh hay không. Nếu
có thì bắt buộc phải chẩn đoán trước sinh cho thai kỳ tiếp theo. Đề tài này thực hiện với mục
đích trên nên có ý nghĩa khoa học như sau:
9


- Ứng dụng kĩ thuật MLPA trong chẩn đoán bệnh thoái hóa cơ tủy giúp giảm tỉ lệ mắc
bệnh thoái hóa cơ tủy cũng như hạn chế được sự lan truyền gen SMN1 bị đột biến trong
cộng đồng Việt Nam.
- Xác định tỉ lệ các kiểu gen SMN1 ở các bệnh nhân thoái hóa cơ tủy Việt Nam.
* Ý nghĩa thực tiễn

- SMA type II (Bệnh OMIM 253550): Thể này chiếm khoảng 50% các trường
hợp. Bệnh xuất hiện muộn hơn, thường là từ 6 đến trước 18 tháng tuổi. Trẻ có biểu hiện
giảm trương lực cơ, chậm phát triển vận động, có thể ngồi được nhưng không đứng và đi
được. Có biến chứng cong vẹo cột sống và nuốt khó. Trẻ phát triển tinh thần bình thường.
Trẻ có thể sống đến tuổi đi học, một số ít có thể sống đến tuổi trưởng thành [8].
- SMA type III (Bệnh Kugelberg-Welander, OMIM 253400): Đây là thể nhẹ nhất,
chiếm khoảng 25% các type. Bệnh khởi phát muộn và tiến triển chậm. Bệnh xuất hiện sau 2
tuổi. Trẻ chậm phát triển vận động, tự đi được nhưng muộn hoặc biết đi rồi sau đó đi lại khó
11


khăn hơn. Có các biểu hiện của yếu cơ gốc chi, co cứng cơ, cong vẹo cột sống. Trẻ phát
triển tinh thần bình thường nên có thể đi học được. Tỉ lệ sống sót: Một số trẻ biểu hiện bệnh
muộn và tiến triển chậm nên có thể sống đến tuổi trưởng thành [8].
Ngoài ra theo một số tác giả khác còn phân chia thêm SMA type IV: Còn gọi là loại
người lớn, thường xảy ra sau tuổi 30. Các triệu chứng: Bắt đầu teo cơ cột sống thường là
nhẹ đến trung bình và bao gồm yếu cơ, run và co giật.
Các xét nghiệm cận lâm sàng của bệnh bao gồm:
- Xác định hoạt độ enzyme creatine kinase (CK): Creatine kinase là một loại
enzyme có vai trò chuyển hóa năng lượng giúp cho quá trình co cơ. Khác với một số bệnh
thần kinh cơ di truyền như loạn dưỡng cơ Duchenne có nồng độ enzyme CK trong huyết
thanh tăng rất cao (30 - 40 lần so với bình thường), trong bệnh thoái hóa cơ tủy, tổn thương
cơ là do sự thoái hóa của tế bào sừng trước tủy sống, do vậy hoạt độ CK huyết thanh chỉ
tăng nhẹ (2 - 9 lần) hoặc không tăng [8].
- Đo điện cơ đồ: Đây là phương pháp được sử dụng để chẩn đoán phân biệt bệnh lý
teo cơ do tổn thương ở cơ hay do tổn thương thần kinh
Bệnh nhân thoái hóa cơ tủy có hình ảnh bất thường trên bản điện di cơ [11].
+ Ở trạng thái nghỉ: Có sự xuất hiện các hoạt động điện thế tự phát kiểu sóng nhọn
dương và co giật sợi cơ, co giật bó cơ và phóng điện lặp lại phức hợp.
+ Ở trạng thái co cơ: Khoảng điện thế của đơn vị vận động dài ra, biên độ tăng và số

Bố

Mẹ

Rr

Rr

Lành mang gen

Lành mang gen

Tần số con với các kiểu gen khác nhau
RR

13

rr

Rr

Lành

Bệnh Lành mang gen bệnh

25%

25%

50%


100%

0

bệnh

Rr

Rr

Lành mang gen

Bệnh

bệnh
rr

RR

Bệnh

Lành

Rr

Rr

Bệnh


nhân chính gây nên bệnh SMA. Các kết quả nghiên cứu cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa
cơ tủy bị mất cả hai bản sao của gen SMN1 còn khoảng 6% bệnh nhân rơi vào trường hợp
mang kiểu gen SMN1 dị hợp tử, bệnh nhân có 1 allele SMN1 bị đột biến mất gen SMN1 và
1 allele mang gen SMN1 bị đột biến điểm, không tổng hợp được protein SMN1 có chức
năng [4].
Nghiên cứu của Ogino S. cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa cơ tủy bị đột biến mất cả
hai exon 7 của gen SMN1. Sự mất exon 7 được chứng minh là do đột biến mất đoạn gen
chứa exon 7 hoặc do exon 7 của gen SMN1 đột biến chuyển thành exon 7 của gen SMN2
[41]. Các bệnh nhân bị đột biến mất hai exon 7 (SMN1) đa số kèm theo đột biến mất exon 8
của gen SMN1, tuy nhiên có trường hợp vẫn mang ít nhất một bản sao của exon 8 [41].
1.1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen SMN1
Gen SMN1 nằm ở vùng telomer, gen SMN2 nằm ở vùng centromer trên nhiễm sắc thể.
Mỗi bản sao dài 27kb, gồm 9 exon (exon 1, 2a, 2b, 3 - 8). SMN2 chỉ khác SMN1 ở 5
15


nucleotide: Một ở intron 6 (A>G), một ở exon 7 (T>C), hai ở intron 7 (G>A, G>A) và một
ở exon 8 (A>G) (hình 1.2B) [15].
Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh
vận động tủy sống (spinal motor neuron). Protein SMN là một protein phổ biến trong tế bào
người với trọng lượng phân tử 38 kilodalton (kDa), gồm 294 amino acid.
Cả hai gen SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein tương ứng, tuy nhiên do sự khác
nhau ở một vài nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có chức năng, trong khi protein
do gen SMN2 tổng hợp có chức năng rất hạn chếdo thiếu hụt exon 7 (hình 1.4). Do đó, khi
gen SMN1 bị đột biến dẫn đến không tổng hợp protein thực hiện chức năng gây bệnh
SMA. Trong đó vùng mã hóa exon 7 đóng vai trò rất quan trọng trong việc mã hóa chức
năng của protein SMN. Đột biến exon 7 làm giảm khả năng tương tác của protein SMN với
các protein khác trong quá trình sinh học (ví dụ: protein neuron specific profilin II) dẫn đến
không thực hiện chức năng bình thường [9]. Nucleotide ở vị trí +6 của exon 7 gen SMN1 là
C, ứng với exon 7 gen SMN2 là T. Sự khác biệt này theo lý thuyết không làm biến đổi dịch

exon 7 do ưu thế điều hòa nghiêng về sự ức chế quá trình ghép nối exon 7 [30].

Hình 1.4. Sự khác nhau về chức năng giữa gen SMN2 và gen SMN1
a. Gen SMN1 và SMN2, b. Tiền mRNA của gen SMN2 và gen SMN1, c. mRNA của
gen SMN2 và gen SMN1, d. Protein quy định bởi gen SMN2 và gen SMN1
(Nguồn: [48])
Protein SMN là một protein phổ biến trong tế bào người với trọng lượng phân tử 38
kilodalton (kDa), gồm 294 amino acid. Protein SMN có trong hạt của sợi trục neuron, màng
sinap của tế bào thần kinh cơ và tập trung trong các cấu trúc Cajal boies (CBs) được gọi là
thể cuộn ở nhân tế bào thần kinh cơ.
Protein SMNtham gia vào phức hợp protein SMN, phức hợp này đóng vai trò quan
trọng trong sự lắp ráp các snRNP của tế bào chất cũng như quá trình tái tạo các snRNP và
quá trình ghép nối mRNA (spliceosome) trong nhân tế bào.

18


Phức hợp
SMN

snRNA đi
bà

Bào tương
Methyl
hóa
arginin
e

Phức hợp

thể này và một đột biến mất đoạn hoặc chuyển đổi gen trên nhiễm sắc thể còn lại [48]. Các
dạng đột biến xảy ra có thể ở trạng thái dị hợp tử hoặc đồng hợp tử.Song chỉ dạng đồng hợp
tử (đột biến xuất hiện ở cả trên 2 allele) mới biểu hiện ra kiểu hình.

Hình 1.6. Sơ đồ minh họa các loại đột biến gen SMN1
a. Đột biến mất đoạn (một phần gen hoặc toàn bộ gen); b. Đột biến chuyển đổi gen (từ
SMN1 sang SMN2); c. Các điểm đột biếnđã xác định
(Nguồn: [48])
* Đột biến mất đoạn gen (deletion)
Đoạn exon 7 bị mất hoặc cả gen SMN1 bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau.
Trong cấu trúc của vùng gen SMA (5q13) có sự lặp lại nhiều lần trong trình tự, chính vì vậy
trong quá trình sao chép DNA có thể dẫn đến hiện tượng kết cặp bổ sung trong 1 mạch phân
tử DNA tạo cấu trúc kẹp tóc làm bỏ qua sao chép đoạn gen dẫn đến đột biến mất đoạn (hình
1.7. B) [29]).

20


Hình 1.7. Cơ chế đột biến vùng gen SMA (5q13)
A. Chuyển đổi gen, B. Mất đoạn giữa của nhiễm sắc thể mang gen SMN1 và SMN2, C.
Mất đoạn giữa của nhiễm sắc thể mang gen SMN2
(Nguồn: [29])
* Đột biến chuyển đổi gen (gene conversion)
Gen SMN1 bị chuyển thành gen SMN2 do nucleotide C bị chuyển thành T, do đó
trong quá trình hoàn thiện mRNA bị thiếu hụt exon 7. Giữa gen SMN1 và SMN2 có 5
nucleotide khác nhau: Một ở intron 6 (A>G), một ở exon 7 (T>C), hai ở intron 7 (G>A,
G>A) và một ở exon 8 (A>G). Tuy nhiên, chỉ cần một đột biến T>C ở exon 7 có thể coi là
đột biến chuyển đổi gen từ SMN1 sang SMN2 do nucleotide này có vai trò quan trọng trong
việc hoàn thiện mRNA để tạo mRNA chứa exon 7 quy định protein có chức năng [14], [16],
[57].



chặn quá trình ức chế exon 7 và tăng cường sự phiên mã của exon này. Đoạn antisense này
được đưa vào cơ thể chuột, kết quả cho thấy có sự tăng cường sao chép mRNA và biểu hiện
protein ở các tế bào thần kinh vận động tủy sống [27].
Cho đến nay việc điều trị các bệnh di truyền nói chung và bệnh SMA nói riêng vẫn
đang là khó khăn cho ngành y học do đó cách bệnh này vẫn là gánh nặng cho bản thân bệnh
nhân, gia đình và xã hội. Chính vì vậy, trước khi các nhà khoa học tìm ra phương pháp chữa
trị đặc hiệu thì việc sàng lọc người lành mang gen, chẩn đoán trước sinh để hạn chế sinh ra
những đứa trẻ mang SMA được coi là lựa chọn được ưu tiên hàng đầu.
1.2. Các phương pháp xác định đột biến gen smn1
1.2.1. Phương pháp Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification
Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification (MLPA) còn gọi là kĩ thuật
khuếch đại đa đoạn dò, được mô tả lần đầu tiên vào năm 2002 bởi Schouten J.P. và cs, đây
là phiên bản mới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉ
bằng 1 cặp mồi. Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai với phân tử
DNA đích đặc hiệu. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligoncleotide có kích thước khác nhau (đoạn
dò xuôi và đoạn dò ngược). Các probe sẽ gắn đặc hiệu vào các exon của phân tử DNA đích,
sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò
hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu
huỳnh quang. Đoạn đệm được thiết kế dài ngắn khác nhau nên khi phản ứng PCR khuếch
đại sẽ tạo ra nhiều đoạn DNA có chiều dài khác nhau và được phân tách bằng điện di mao
quản. Nếu exon bị đột biến mất đoạn thì không có hiện tượng lai probe và probe đó sẽ
không được khuếch đại, do đó khi điện di mao quản sẽ không thấy hình ảnh exon bị đột biến
mất đoạn. Nếu gen có đột biến lặp đoạn, kết quả trên hình ảnh điện di mao quản cho thấy
đỉnh tín hiệu của probe tương ứng với exon bị đột biến sẽ tăng cao khác biệt so với bình
thường [40].
Đến nay có hơn một triệu phản ứng MLPA được thực hiện mỗi năm trên khắp thế giới
và được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người, di truyền tế bào và
nghiên cứu ung thư, cho phép phát hiện các tổn thương gen một cách nhanh chóng và chính