BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HCM
KHOA HÓA HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S. Nguyễn Ngọc Hưng.
SVTH: Nguyễn Thị Ngọc Trinh.

TP.HCM – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HCM
KHOA HÓA HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

GVHD: Th.S. Nguyễn Ngọc Hưng.
SVTH: Nguyễn Thị Ngọc Trinh.

TP.HCM – 2013


LỜI CÁM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Ngọc Hưng vì đã giao cho
em đề tài nghiên cứu này. Cám ơn thầy vì đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt
thời gian nghiên cứu.
Em cũng xin gửi lời cám ơn đến các thầy cô ở phòng thí nghiệm bộ môn phân

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................... 24
2.1. Hóa chất, dụng cụ................................................................................... 24
2.1.1. Hoá chất .............................................................................................. 24
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị .................................................................................. 25
2.2. Thực nghiệm .......................................................................................... 26


2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu .................................................................... 26
2.2.2. Phân tích mẫu dược phẩm .................................................................. 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN ..................................................... 32
3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu ....................................................................... 32
3.1.1. Khảo sát thành phần pha động ............................................................ 32
3.1.2. Khảo sát tốc độ pha động .................................................................... 34
3.2. Phân tích mẫu dược phẩm ...................................................................... 36
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính ................................................................. 36
3.2.2. Ứng dụng quy trình phân tích vào một số mẫu dược phẩm ................ 40
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ........................................................ 44
4.1. Kết luận .................................................................................................. 44
4.2. Đề nghị ................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45
..............................................................................................................................


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của thơi gian lưu, chiều cao pic sắc kí vào tỉ lệ của
methanol trong pha động ........................................................................................ 32
Bảng 3.2.Mối quan hệ giữa tốc độ pha động và chiều cao pic sắc kí .................... 34
Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của chiều cao pic sắc kí vào nồng độ của paracetamol ... 37
Bảng 3.4.Sự phụ thuộc của chiều cao pic sắc kí vào nồng độ của caffein ............. 38
Bảng 3.5.Diện tích pic thu được sau mỗi lần lọc ................................................... 39


HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

RP – HPLC

Sắc kí hấp phụ pha đảo

S pic

Diện tích pic sắc kí

STT

Số thứ tự

tR

Thời gian lưu

UV

Tử ngoại

V

Thể tích

VIS

paracetamol và caffein. Trong khi đó, HPLC thường chỉ dùng để xác định từng chất
riêng rẽ.
Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài “Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol
và caffein trong một số dược phẩm bằng phương pháp HPLC” với mong muốn
tìm ra một phương pháp nhanh, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nghiên cứu của
phòng thí nghiệm với hai mục tiêu:
Trang 1


• Xây dựng điều kiện phân tích đồng thời paracetamol và caffein bằng phương
pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS.
• Áp dụng phương pháp này để định lượng paracetamol và caffein trong một số
dược phẩm thông dụng.

Trang 2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.1.

1.1.1. Giới thiệu
Sắc kí là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử chất phân
tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là
pha tĩnh,một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích
có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi
nhau.
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương thức của phép sắc kí.Kỹ thuật
phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc kí lớp mỏng áp suất cao (HPTLC) và sắc kí

Đây thường là các loại detector dựa theo các tính chất của chất phân tích. Một
số detector thông dụng như:
− Detector hấp thụ quang phân tử,vùng phổ UV-VIS.
− Detector nguyên tử phát xạ (AES) hay hấp thụ nguyên tứ (AAS).
− Detector huỳnh quang phân tử.
− Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng).
− Detector chiết suất.
− Detector đo độ dẫn nhiệt.
− Detector diode phát quang và diode mảng.
− Detector phổ khối lượng.
Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để
đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng. Trong
các loại trên, thì detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS hiện nay
đang được dùng phổ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại không quá
đắt.
e) Bộ phận hiển thị kết quả:
Bộ phận hiển thị kết quả có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là các
máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tích
phân kế (intergrator), sau đó máy tính và máy in kèm theo để xử lý kết quả và in kết
quả.

Trang 4


Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC.
Những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm:
− Bộ chương trình gradient dung môi (pha động).
− Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu.
− Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc kí.
− Máy tính và các chương trình (phần mềm) điều khiển toàn bộ hệ thống HPLC


Hình 1.3.Quá trình tách sắc kí của các chất.
Trang 6


1.1.4. Các đại lượng đặc trưng
1.1.4.1. Thời gian lưu
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột sắc kí sẽ bị lưu
giữ ở trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời
gian tính từ lúc bắt đầubơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại. Như vậy
nếu gọi t Ri là thời gian lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có:
t Ri = ( t o + t′ Ri )
Trong đó:
+ t o là thời gian không lưu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động )
+ t′ Ri là thời gian lưu giữ thực của chất i ở trong cột sắc kí (thời gian lưu hiệu
chỉnh)
Nếu t o = 0 thì ta sẽ có t Ri = t′ Ri . Trường hợp này chỉ có khi t Ri là rất nhỏ (thường
là khi t Ri nhỏ hơn 4 phút).

Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC.
Giá trị t′ Ri của một chất tan trong quá trình sắc kí là phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
Ví dụ như:
 Bản chất sắc kí của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp.
 Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
Trang 7


 Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế.
 Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ
chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình

𝐾=

𝐶𝑖𝑆𝑃

𝐶𝑖𝑀𝑃

(1.4)

Trong đó C iSP và C iMP là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động.
Hệ số K i cho ta biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha
động và pha tĩnh).
1.1.4.3. Hệ số dung lượng
Hệ số dung lượng k’cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố vào trong
mỗi pha là bao nhiêu.
𝑘′𝑖 =

𝑚𝑆𝑃

𝑚𝑀𝑃

(1.5)
Trang 8


Mối quan hệ giữa hệ số dung tích k i ′ và hệ số phân bố K i thể hiện qua phương
trình sau:
𝑘′𝑖 = 𝐾𝑖 .

1.1.4.4. Hệ số tách α


1.1.4.5. Số đĩa lý thuyết N
Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc kí, người ta dùng khái
niệm số đĩa N. Đây là một đại lượng, về hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc kí
như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) là H. Tất nhiên đây là lớp có tính chất
động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như:
- Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh.
- Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh.
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (chất phân tích).
- Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc kí.
- Độ nhớt của pha động.
Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc kí đã chọn, thì chiều
cao H cũng có những giá trị xác định ứng với các chất tan. Chiều cao lí thuyết H và số
đĩa lí thuyết N được xác định theo công thức:
𝐻=

𝑁=

𝐿

𝐻

𝐿

16

(

𝑊𝑖 2
)
𝑡𝑅𝑖


𝑁𝑒𝑓 = 16. (

)2

𝑡𝑅𝑖 −t0
𝑊𝑖

)2

(1.10)
(1.11)

Nếu giá trị N ef là quá nhỏ thì không có sự tách tốt của các chất, hoặc sự tách
không hoàn toàn.Nhưng nếuN ef là quá lớn thì cũng không cần thiết. Vì khi đó pic sắc
kí của các chất tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động.
1.1.4.6. Độ phân giải R
Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc kí.
Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ
phân giải được tính theo công thức sau:
R AB =

2.(tRB −tRA )
WA + W B

(1.12)

Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai pic sẽ
có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc kí. Song nếu đoạn
đường nền này dài quá thì cũng không cần thiết. Vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha

+ C S và C M : hệ số chuyển khối của pha tĩnh và pha động.
Nếu biểu thị các đường biểu diễn tổng cộng trong quan hệ của H với u thì
chúng ta có được đường cong Van Deemter.

Trang 11


Hình 1.6. Phương trình đường cong Van Deemter.
Hệ số A phụ thuộc vào đường kính hạt nhồi d p trong pha tĩnh; cách chúng được
nhồi trong cột hoặc được phủ trên bản mỏng được biểu diễn qua λ (hệ số nạp cột) phụ
thuộc vào độ đồng thể của chất nhồi, dạng hình học và kích thước của cột:
A = 2.λ.d p

(1.13)

Hệ số B chỉ ra cho ta ảnh hưởng của hệ số khuếch tán D M của chất tan ở trong
pha động theo hướng chiều dài của cột.
B = 2γ. D M

(1.14)

Trong đó:
+ D M : hệ số khuyếch tán của chất tan ở trong pha động theo hướng chiều dài của
cột.
+ γ: hằng số đặc trưng cho sự khuếch tán trong một đơn vị thời gian và trong
điều kiện cột nạp tốt thì giá trị γ hầu như bằng 1.
Hệ số C tỉ lệ thuận với tốc độ pha động và ảnh hưởng đáng kể đến đường cong
H – u. Hệ số C M và C S được tính theo công thức sau:
C M = ϕ.(d p )2 / D M


Trong đó:
+ H : Chiều cao pic sắc kí của chất.
+ S : Diện tích pic sắc kí của chất.

Hình 1.7.Mối quan hệ H = f(C) và S = f(C)
Trang 13


Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một
trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm
chuẩn.Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng
chất phân tích.
1.1.5.2. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
Dựa trên (1.17) và (1.18) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo
phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với
các đặc trưng sau:
Giá trị trung bình:

x=

1 n
∑ xi
n i =1

∑ (x
n

i


Tên chung quốc tế: Paracetamol.
Công thức phân tử:C 8 H 9 NO 2 .
Loại thuốc: giảm đau, hạ sốt.
Dược lý và cơ chế tác dụng:
Paracetamol (N-acetyl-p-aminophenol
hoặc Acetaminophen) là chất chuyển hóa có
hoạt tính cuả phenacetin, là thuốc giảm đau,
hạ sốt hữu hiệu có thể thay thế aspirin.
Paracetamol không có hiệu quả điều trị viêm.
Với liều ngang nhau tính theo gam,
paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt
tương tự aspirin.
Paracetamol làm giảm thân nhiệt của người bệnh sốt, nhưng hiếm khi làm giảm
thân nhiệt ở người bình thường. Thuốc tác dụng lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tỏa
nhiệt tăng do giãn tĩnh mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên.
Với liều điều tri, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm
thay đổi cân bằng axit-bazơ, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như
dùng salicylat. Nguyên nhân do paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase toàn
thân, chỉ tác động đến cyclooxygenase / prostaglandin của hệ thần kinh trung ương.
Paracetamol không tác dụng trên tiểu cầu hoặc thời gian chảy máu.
Khi dùng quá liều paracetamol, một chất chuyển hóa là N-bezoquinonimin gây
độc nặng cho gan.Liều bình thường, paracetamol dung nạp tốt, không có nhiều tác
dụng phụ của aspirin.Tuy vậy, quá liều cấp tính (trên 10g) làm thương tổn gan gây
chết người. Những vụ ngộ độc và tự vẫn bằng paracetamol đã tăng lên một cách đáng
lo ngại trong những năm gần đây.
Hấp thu:
Paracetamol được hấp thu nhanh chóng và hầu như hoàn toàn qua đường tiêu
hóa. Thức ăn có thể làm viên nén giải phóng kéo dài paracetamol chậm được hấp thu
Trang 15




không đặc hiệu, không ảnh hưởng đến tiến trình của bệnh cơ bản và có thể che lấp tình
trạng của người bệnh.
Chống chỉ định:
Người bệnh quá mẫn cảm paracetamol.
Người bệnh thiếu hụt glucose-6-photphat dehydrogenase.
Liều lượng và cách dùng:
Paracetamol thường dùng uống.Đối với người bệnh không uống được có thể
dùng thuốc đạn đặt trực tràng.
Không được dùng paracetamol để tự điều trị giảm đau quá 10 ngày ở người lớn
hoặc quá 5 ngày với trẻ em.Không dùng cho người lớn và trẻ em để tự điều trị sốt cao
trên 39,50C; sốt kéo dài trên 3 ngày hoặc sốt tái phát.
Để giảm thiểu nguy cơ quá liều, không nên cho trẻ uống quá 5 liều paracetamol
để giảm đau và hạ sốt trong vòng 24 giờ. Để giảm đau hoặc hạ sốt cho người lớn và trẻ
em trên 11 tuổi, liều paracetamol thường dùng hoặc đưa vào trực tràng là 320 – 650
mg, cứ 4 – 6 giờ khi cần thiết và không dùng quá 4 g một ngày. Liều một lần lớn hơn
(ví dụ 1g) có thể hữu ích để giảm đau ở một số người bệnh.
Quá liều:
Nhiễm độc paracetamol có thể do dùng một liều duy nhất, do uống lặp lại liều
lớn hơn hay do uống thuốc dài hạn. Hoại tử gan là tác dụng độc cấp tính nghiêm trọng
nhất do quá liều và có thể gây tử vong.
Những biểu hiện thường gặp: buồn nôn, nôn và đau bụng thường xảy ra trong
vòng 2 – 3 giờ sau khi uống liều đầu của thuốc. Methemoglobin máu dẫn đến chứng
xanh tím da, niêm mạc và móng tay là một trong những dấu hiệu đặc trưng nhiễm độc
cấp tính p-amionphenol, một lượng nhỏ sulhemoglobin cũng có thể được sản sinh. Trẻ
em có khuynh hướng tạo methemoglobin dễ hơn người lớn sau khi uống paracetamol.
Khi bị ngộ độc nặng, ban đầu có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, kích
động và mê sảng. Tiếp theo có thể là ức chế hệ thần kinh trung ương, hạ thân nhiệt,
mệt lả, thở nhanh, nôn, mạch nhanh, yếu, không đều, huyết áp thấp và suy tuần hoàn.