BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Trần Thị Ái Liên
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ
CỦA LACTOBACILLUS
TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Trần Thị Ái Liên
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ
CỦA LACTOBACILLUS
TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRẦN THANH THỦY
Thành phố Hồ Chí Minh - 2012
Trần Thị Ái Liên
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CFU
Colony forming unit (mật độ tế bào)
ĐC
Đối chứng
G-
Gram âm
G+
Gram dương
KS
Kháng sinh
LAB
Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic)
L
DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………....1
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1.
TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC ...................................................................3
1.1.1.
Lược sử nghiên cứu ................................................................................3
1.1.2.
Các vi sinh vật probiotic thường gặp ......................................................4
1.1.3.
Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic ..............................................6
1.1.4.
Cơ chế tác động chung của probiotic......................................................9
1.1.5.
Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm probiotic ...................11
1.2.
VI KHUẨN LACTIC ....................................................................................13
2.1. VẬT LIỆU.........................................................................................................29
2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................29
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................30
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................33
2.2.1. Xác định khả năng sinh acid tổng bằng MT cacbonat agar .........................33
2.2.2. Phân lập từ môi trường MRS .......................................................................33
2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [14]...........................................33
2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram [14] ..................................................................34
2.2.5. Phương pháp khảo sát khả năng di động [15] .............................................34
2.2.6. Phương pháp xác định kiểu hô hấp [15] ......................................................35
2.2.7. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính catalase [42] ........................................35
2.2.8. Phương pháp xác định hoạt tính protease [15] ............................................35
2.2.9. Phương pháp khảo sát khả năng sinh acid lactic [3], [11] ...........................36
2.2.10. Phương pháp khảo sát khả năng sinh bacteriocin ......................................37
2.2.11. Phương pháp khảo sát khả năng đề kháng chất KS của LAB bằng đĩa giấy
KS chuẩn ................................................................................................................38
2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng chịu đựng pH thấp [14], [15] .................38
2.2.14. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ........39
2.2.15. Ảnh hưởng pH ban đầu đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn…….40
2.2.16. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn ........................40
2.2.17. Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh, lắc đến sự ST và hoạt tính kháng
khuẩn ......................................................................................................................41
2.2.18. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon MT nuôi cấy đến sự ST
và hoạt tính kháng khuẩn .......................................................................................41
2.2.19. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose đến sự ST và hoạt tính
kháng khuẩn ...........................................................................................................41
2.2.20. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên sự ST và hoạt
3.6.
Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng LAB trong điều kiện
tối ưu 79
3.7.
Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic sau đông khô ....................83
3.8.
Định danh đến loài bằng phương pháp sinh học phân tử ...............................84
Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................86
4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................86
4.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................................87
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................88
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ...........................................................................................88
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI .......................................................................................89
TÀI LIỆU INTERNET .............................................................................................93
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại Lactobacillus [56] ....................................................................15
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của probiotic và acid lactic trên heo con và heo trưởng thành
[15], [54] ...................................................................................................................23
Bảng 3.1. Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và khả năng
di động của các chủng VK trên môi trường MRS ....................................................47
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát một số đặc điểm của các LAB ......................................50
Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng của chủng PA2 và PP ở những nồng độ muối
kháng khuẩn theo thời gian của chủng Lactobacillus PA2 và Lactobacillus P ........80
Bảng 3.20. Tổng hợp các điều kiện tối ưu để thu sinh khối của hai chủng
Lactobacillus PA2 và Lactobacillus PP. ...................................................................82
Bảng 3.22. Sự biến động số lượng tế bào của hai chủng vi khuẩn lactic theo thời
gian bảo quản bằng đông khô ...................................................................................83
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường tiêu hóa
(Selminen, 1998)………………………………………………………………………...22
Hình 2.1. Phương pháp khoan lỗ thạch .....................................................................37
Hình 3.1. Khả năng sinh acid trên MT cacbonat agar của VK phân lập sau 3 ngày
nuôi cấy. ....................................................................................................................46
Hình 3.2. Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphenmen.......................................49
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng PA2 nhuộm Gram trên
kính hiển vi x100 .......................................................................................................51
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng PP nhuộm Gram trên
kính hiển vi x100 .......................................................................................................51
Hình 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus PA2 với........................57
một số VK gây bệnh đường ruột ...............................................................................57
Hình 3.6. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus PP với một số ..............57
VK gây bệnh đường ruột ...........................................................................................57
Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus PA2 đối vB. subtilis được
nuôi cấy qua các thời gian khác nhau .......................................................................62
Hình 3.7. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus PA2 đối với .................63
B. subtilis được nuôi cấy qua các thời gian khác nhau (tiếp theo)............................63
Hình 3.8. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus PA2 đối với .................66
B. subtilis khi được nuôi cấy ở các pH ban đầu khác nhau.......................................66
Hình 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus PA2 đối với .................68
B. subtilis khi nuôi ở các nhiệt độ MT khác nhau.....................................................68
PP……………………………………………………………………………….….70
Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn của
chủng Lactobacillus PA2…………………………………………………………..72
Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn của
chủng Lactobacillus PP…………………………………………………………….73
Đồ thi 3.11. Ảnh hưởng nồng độ glucose đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn của
chủng Lactobacillus PA2…………………………………………………………..75
Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng nồng độ glucose đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn của
chủng Lactobacillus PP…………………………………………………………….76
Đồ thi 3.13. Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn
của chủng Lactobacillus PA2……………………………………………….…..…78
Đồ thi 3.14. Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến sự ST và hoạt tính kháng khuẩn
của chủng Lactobacillus PP……………………………………………………..…78
Đồ thị 3.15. Động thái quá trình ST và sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus PA2 …………………………………………………….……..…….80
Đồ thị 3.16. Động thái quá trình ST và sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng
Lactobacillus PP……………………………………………………..........………80
1
MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài
Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, khi chất lượng cuộc
sống không ngừng được nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe con người ngày càng
được chú trọng. Do vậy, việc tạo ra các chế phẩm sinh học nhằm cải thiện và tăng
cường sức khỏe con người được tạo ra ngày càng nhiều. Một trong những chế phẩm
sinh học đó chính là probiotic, chúng được tạo ra từ việc ứng dụng vi sinh vật (VSV)
có lợi bổ sung vào hệ tiêu hóa của con người. Việc sử dụng VSV probiotic thực tế đã
mang lại nhiều ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe con người, thông qua các đặc
Với mục tiêu:
Nhằm làm rõ hiệu quả của việc sử dụng probiotic.
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Phân lập, tuyển chọn 2 chủng Lactobacillus từ các chế phẩm probiotic dành
cho người.
2. Tìm hiểu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng Lactobacillus.
3. Khảo sát phổ kháng khuẩn của 2 chủng Lactobacillus với các VSV gây
bệnh đường ruột ở người.
4. Nghiên cứu khả năng tồn tại trong điều kiện bất lợi ở đường ruột.
5. Xác định các điều kiện ST và sinh chất đối kháng của 2 chủng
Lactobacillus được tuyển chọn.
6. Nghiên cứu khả năng sống sót sau quá trình đông khô.
7. Phân loại đến loài 2 chủng VK nghiên cứu bằng sinh học phân tử.
Đối tượng nghiên cứu:
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ chế phẩm probiotic.
3
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC
1.1.1. Lược sử nghiên cứu
Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các
nhà VSV học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người
bệnh và người khỏe mạnh. Hệ VSV có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi là
probiotic.
Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe
tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có
Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp:
Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen và Gorbach (1999),
một số loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong
đó chủ yếu là những loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus như L.
acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L.
sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, S. faecalis,…
Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá
trình sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sung thêm trong chế
phẩm như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt là fructoligosaccharide, là
một tá dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chế phẩm propiotic.
Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (như L. acidophilus
hay L. sprorogenes,…) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L. acidophilus, L.
sprorogenes, L. kefir, S. faecalis,…). Sử dụng chế phẩm probiotic - lactic là liệu pháp
rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu hóa, giúp duy trì hệ VSV có lợi cho hệ
tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ những tác
dụng trong cơ thể người [12], [48].
Bacillus subtilis
B. subtilis là VK ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng được sử dụng qua
đường uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi dùng KS.
B. subtilis có tác dụng hồi phục hệ VSV tự nhiên trong đường tiêu hóa của người sau
khi dùng KS kéo dài. Các chế phẩm B. subtilis được bán ở hầu hết các nước Châu
Âu, mặc dù người ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của B.
5
subtilis có thể vượt qua rào chắn đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong
ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis đã
được biết như làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [61].
phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra.
+ Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và Naminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần
thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải.
+ Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào
T.
Nấm mốc trong chế phẩm probiotic có vai trò tạo sinh khối chứa nhiều acid
amin, sản xuất enzyme amylase, protease nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn ở
động vật nuôi [15].
1.1.3. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic
Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng
tác động thông qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ
tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc
nghiệt trong đường tiêu hóa. Điển hình là các điều kiện như pH thấp, acid mật, KS,…
Chịu pH thấp
Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu. Các nhà khoa học đã
chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90
phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa
có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều kiện áp
lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được chọn lọc để sử
dụng như trong chế phẩm probiotic cần phải chịu được môi trường pH thấp ít nhất 90
phút. Sống sót ở pH 3,0 trong 2 giờ và nồng độ acid 1000 mg/l được xem như là khả
năng chống đỡ đối với acid tối ưu đối với các chủng probiotic [42].
Tiếp đến, chúng phải gắn vào biểu mô và phát triển được trong ruột trước khi
chúng có thể bắt đầu phát huy vai trò đối với sức khỏe vật chủ.
Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzyme trong đường miệng
như lysozyme. Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để
sàng lọc khi muốn tuyển chọn các dòng probiotic [39].
7
8
và tạo được một ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột (Pedersen và Tannock
1989; Freter 1992; Alander và cộng sự 1997) [31], [35].
Bên cạnh khả năng sống sót và phát triển được trong điều kiện khắc nghiệt của
đường tiêu hóa, vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt
tính kháng khuẩn như các acid hữu cơ, ethanol, bacteriocin, H 2 O 2 ,… Những chất này
được sản sinh cùng với quá trình ST và phát triển của chúng trong đường tiêu hóa,
tác động ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ sinh thái đường
ruột.
Ngoài ra, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như
đồng hóa cholesterol, lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng nhiều enzyme có lợi
giúp cho việc tiêu hóa thức ăn diễn ra dễ dàng. Bên cạnh đó, chúng còn giúp hấp thu
các chất dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư, các hợp chất
độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch cơ thể chủ, tăng khả năng đề kháng cho cơ
thể vật chủ,…[12],[48].
Theo tổ chức lương thực và thực phẩm Quốc Tế (FAO) [59]. Một chủng VSV
được sử dụng tạo chế phẩm probiotic cần phải đảm bảo tiêu chuẩn sau đây:
-
Giống dùng cho probiotic phải mang tính đại diện và được công nhận chung về
tính an toàn cho người và vật nuôi (GRAS microorganism) [28], [49].
-
Có nguồn gốc từ người được chứng minh an toàn cho người.
-
miễn dịch, làm gia tăng chức năng phòng thủ của mạng lưới tế bào chủ.
-
Có khả năng tồn tại trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản bằng đông khô.
1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic
VSV probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên đường
tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các VK gây
bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của
cơ thể vật chủ,…
Cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh
Hệ VSV ở đường tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác nhau, một
trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng KS dài ngày dẫn đến việc tiêu diệt
các VSV có lợi trong ruột. Để khắc phục điều này, người ta thường bổ sung các VSV
có lợi thông qua sử dụng probiotic. Các VSV probiotic sẽ phát triển, chiếm ưu thế
trong đường ruột bằng cách cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng
và khối lượng các chất được sản sinh. Từ đó, ức chế và tiêu diệt được VSV gây hại,
thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột.
Trong một nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp thường xuyên các VSV có lợi
dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật nuôi với liều
lượng thích hợp (1,2 tỷ CFU/ kg thức ăn/ ngày), sự cân bằng của hệ VSV đường ruột
được duy trì [7], [13], [23], [54].
Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn
Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lượng
cạnh tranh vị trí bám với VK gây bệnh, chúng còn tác động nhờ vào khả năng sản
sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như KS, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid
acetic, acid formic, acid béo, …), diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol,… Đặc biệt,
nhiều chủng VSV còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn
dụng probiotic. Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ
được đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [51].
11
1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm probiotic
Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau. Một
trong những chế phẩm probiotic phổ biến được biết đến với tên thường gọi là “men
vi sinh”. Chúng tồn tại ở các dạng như cốm, bột, lỏng, viên nén,… chứa VSV có thể
ở dạng sống, chết đông khô, xác VK. Các sản phẩm probiotic có thể phối hợp nhiều
chủng VK (như L. acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis,…)
hoặc chỉ sử dụng một chủng VK (như L. acidophilus hay L. sprorogenes,…) [12],
[48].
Một số chế phẩm thông dụng ở dạng men tiêu hóa trên thị trường hiện nay
như Antibio (Hàn Quốc), Probio (Việt Nam), Acidophilus (Mỹ), Biolactyl (Việt
Nam), Lactéol (Pháp), Bio - acimin (Việt Nam), Biolactyl (liên doanh Pháp), L – bio
- 3D (Việt Nam), Bioflora (Pháp),… Các chế phẩm này được sử dụng nhằm khắc
phục: các chứng bệnh về đường tiêu hóa, một số hạn chế do điều trị bằng KS dài
ngày mang lại, điều trị tiêu chảy cấp, tăng cường khả năng miễn dịch,…
Tuy nhiên, thực tế cho thấy chất lượng các chế phẩm probiotic trên thị trường
hiện nay đang là một vấn đề đáng lo ngại.
Theo Yeung P.S.M và cộng sự, có một số sản phẩm thương mại probiotic ghi
trên nhãn không đúng với nội dung (xem bảng 1.1), có đến 28/44 sản phẩm nghiên
cứu có tên không đúng với nội dung ghi trong nhãn, trong đó có 9/16 sản phẩm trên
nhãn là L. acidophilus nhưng khi kiểm nghiệm bằng phương pháp lên men
carbonhydrat lại cho kết quả là một loài khác [9], [56].
Theo kết quả kiểm tra mới đây (2011) của Thanh tra Sở Y tế Tp. Hồ Chí
Minh: khoảng 50% men vi sinh trên thị trường Tp. Hồ Chí Minh chứa men độc, thậm
chí nhiều men thực chất chỉ là bột mì có chứa độc tố [64].
E.
faecium,
men
carbonhydrat
6/19 sản phẩm thực L. plantarum; L. delbrueckii,
phẩm chức năng
Phương pháp
API rapid ID KIT
L.
rhamnosus
5/13 sản phẩm thực L. plantarum; L. delbrueckii, P. API rapid ID KIT
phẩm chức năng
pentosaceus,
E.
faecium,
L.
rhamnosus; L. fermentum
9/15 sản phẩm thực L.
Copyright: Tài liệu đại học ©