BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH
Nguyễn Hoàng Minh Huy KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ
CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN
Streptomyces dicklowii.CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC:
TS. TRẦN THỊ THANH
1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh.
1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về
kháng sinh.
1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng
sinh.
1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất
kháng sinh.
1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh.
1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh.
1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối.
1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc.
1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh.
1.2. Các nhóm chất kháng sinh chính có nguồn gốc từ xạ khuẩn:
1.2.1. Phân lo
ại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn.
1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn.
1.3. Vai trò của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phòng chống
nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng:
1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng.
1.3.2. Vai trò của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phòng
chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng.
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.
2.1. Vật liệ
u:
2.2. Phương pháp:
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật.
2.2.1.1. Phương pháp làm phòng ẩm quan sát hình thái vi
thể của xạ khuẩn.
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh –
phương pháp khuếch tán trên thạch.
40
47
52
52
52
53
53
54
54
thích sinh trưởng thực vật.
2.2.3. Phương pháp hóa lý.
2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của
chất kháng sinh.
2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh.
2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhóm chức trong cấu
trúc hóa học của chất kháng sinh.
2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng hoà tan trong các
dung môi của chất kháng sinh.
2.2.4. Phương pháp khác.
2.2.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị
nhiễm bệ
nh.
2.2.4.2. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng ra khỏi
đất.
2.2.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi
khuẩn Streptomyces dicklowii.
55
57
57
57
60
61
61
61
62
62
62
63
63
64
66
72
72
98
101
107
107
108
111
1
Ở ĐẦU
Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất rõ: làm giảm năng suất
cây trồng, giảm phẩm chất nông sản khi thu hoạch và bảo quản, ảnh hưởng
xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng. Từ thế kỷ 18 Anton De Bary đã đặt nền
móng môn khoa học bệnh cây (1853). Để khắc phục những thiệt hại do bệnh
cây gây ra, người ta đã sử dụng nhi
ều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc
hóa học, … trong đó sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa và ngăn chặn bệnh
hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử dụng, hiệu quả cao
nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phòng bệnh cho cây đạt hiệu quả
lớn.
Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học cũng như phân
hóa họ
c người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống rất lớn.
Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất, nước
làm cho người và gia súc bị ngộ độc. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu
chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn
trùng hại cây trồng, rất thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học
trong nông nghiệp.
Chúng tôi nhận được chủng Streptomyces dicklowii từ phòng thí
nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn này
được nhập từ Mỹ. Để tiến tới sử dụng có hiệu quả chủng xạ khuẩn này trong
điều kiện môi trường Vi
ệt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ
CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii”
3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn:
1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái:
Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng
có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào
nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu
vô ti (Amytoz), không phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ
khuẩn cũng có những
đặc điểm giống nấm mốc hơn như có hệ sợi
khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ
khuẩn hệ sợi
không có vách ngăn. Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu
từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên
thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc.
Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan, 1998).
Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí
trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ
bào tử có thể từ 5 – 10 vòng, đường kính vòng xoắn có thể thay đổi từ 5 –
7nm. (xem hình 1.2)
Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn
Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường
có hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử có các dạng như: dạng nhẵn
(hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tóc.
6
Hình 1.3: Bào tử dạng gai ở Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình
chụp dưới kính hiển vi điện tử theo
ijs.sgmjournals.org/ / medium/frontcover.gif
)
Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn ở Streptomyces violazeoruber (hình chụp dưới
kính hiển vi điện tử theo
www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg )
1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa của xạ khuẩn:
1.1.1.2.1. Đặc điểm sinh lý nuôi cấy:
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trường đất - xạ
khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất
7
trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm). Hầu như trong các loại đất đều có mặt
của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn
ưa nhiệt. Xạ khuẩn thường sống tốt trong môi trường có pH trung tính.
Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng
sử dụng có thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ
khuẩn sử
(CHOH)
4
CH
2
OH
GLUCOSE IZOMERAZA
CH
2
OH
C=O
(CHOH)
3
CH
2
OH
Glucose Fructose
Để thu enzym người ta thường thu canh trường nuôi cấy của chúng.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và
tổng hợp enzym, nên để tăng sự tổng hợp enzym thì môi trường nuôi cấy phải
có đầy đủ các thành phẩn dinh dưỡng đặc biệt cần bổ sung “chất cảm ứng”
tổng hợp enzym, thường là cơ chất tương ứng của enzym cần tổng hợp.
Thí dụ: trong tổng hợp proteaza của Actinomyces cần chất cảm ứng
là protein đậu nành hay protein động vật.
1.1.1.2.3. Khả năng sinh vitamin của xạ khuẩn:
- Vitamin B12: Cũng như vi khuẩn, xạ khuẩn có khả năng tổng hợp
tốt vitamin B12, là loại vitamin mà ở động vật và thực vật không có khả năng
tổng hợp. Nên trong công nghệ tổng hợp vitamin B12 thì con đường sản xuất
chủ yếu là con đường sinh h
ọc mà xạ khuẩn và vi khuẩn là hai loài vi sinh vật
chính là cellulose. Ở vách sơ cấp, cellulose hiện diện dưới dạng những sợi dài
liên kết với các đường đa khác để tạo ra một mạng lưới. Khi tăng trưởng các
liên k
ết có thể bị đứt tạm thời, do đó vách tế bào trở nên đàn hồi hơn và
những vật liệu mới được chen vào. Auxin có vai trò chính trong cả hai quá
trình trên. Trong các auxin, β – indole acetic acid (IAA) là một kích thích tố
sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều. Đã có nhiều công trình
nghiên cứu về khả năng sinh IAA của xạ khuẩn: Các chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp IAA có thể kể như: Streptomyces olivochromoferus 1/247
10
có khả năng tạo thành 33 μgIAA/ ml canh trường, Streptomyces
olivochromoferus 1/294 có khả năng tạo thành 9μgIAA/ ml canh trường, …(
Lê Thị Hoa, 1998)
Qúa trình sinh tổng hợp IAA ở vi sinh vật diễn ra khá phức tạp,
bằng phương pháp đồng vị phóng xạ người ta xác định được IAA có nguồn
gốc từ Triptophan (hình 1.5).
Hình 1.5: Các con đường hình thành IAA ở vi sinh vật. (theo Lê Thị
Hoa,1998)
1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn:
1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh:
Có nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng
điều trị bệnh
nhưng nhìn chung có thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các
chất có nguồn gốc vi sinh vật và thực vật
có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc
tiêu diệt một số vi sinh vật khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ
thấp. Chất kháng sinh là một chất hóa học có hoạt tính kháng lại các vi sinh
vật như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở động vật
Biocontrol dưới dạng lỏng có thành phần bao gồm một số chủng Streptomyces
sp.; Trung Quốc cũng là n
ước hết sức chú trọng phát triển công nghiệp kháng
sinh, các nhà máy kháng sinh được xây dựng ở Tứ Xuyên, Thượng Hải,
12
Trường Sa, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất các nguyên liệu và các
thành phẩm kháng sinh từ vi sinh vật.
- Ở Việt Nam: chúng ta cũng đã có nhiều cố gắng trong việc tìm
kiếm và sản xuất chất kháng sinh phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh, tách chiết
cũng như nổ lực hợp tác với nước ngoài để sản xuất kháng sinh mặc dù kết
quả chưa đáp ứng được so v
ới nhu cầu thực tế. Những cố gắng ấy có thể tổng
kết qua các mốc thời gian sau: Năm 1950, trong kháng chiến chống Pháp, GS
Ðặng Văn Ngữ đã nuôi cấy Pénicillum và dùng dịch nuôi cấy để chữa vết
thương cho thương binh; Năm 1962 - 1965, Liên Xô (cũ), theo yêu cầu của ta,
đã khảo sát và thiết kế cho Việt Nam một nhà máy sản xuất thuốc kháng sinh,
dự định đặt ở Phú Thọ (Bắc bộ), như
ng sau đó phải ngưng lại vì chiến tranh
mở rộng ra miền Bắc; Năm 1968, Trung Quốc giúp ta thiết kế xưởng
Tetracyclin 5 tấn/năm, trước dự định xây dựng ở Cao Bằng, sau chuyển về
Sơn Tây rồi Việt Trì, nhưng do quan hệ giữa hai nước lúc đó có trục trặc nên
công trình bỏ dở; Năm 1970, Ðơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS
Trương Công Quyền làm chủ nhiệm ra đời, giáo sư và cộ
ng sự đã có nhiều
công trình nghiên cứu về kháng sinh: phân lập được một tập hợp khá lớn các
chủng vi sinh vật trong đó đặc biệt có xạ khuẩn sinh kháng sinh có nguồn gốc
từ đất Việt Nam. Đã tiến hành nghiên cứu sinh lý sinh hoá các chủng vi sinh
vật sinh kháng sinh và tách chiết, định loại được một số kháng sinh. Từ 1985
đến 1990, trong chương trình nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số 64C,
các kháng sinh dùng cho nhu cầu rất lớn được đặt ra hiện nay.
1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh:
1.1.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy:
- Độ thông khí: yếu tố thông khí ảnh hưởng quyết định
đến sinh
tổng hợp chất kháng sinh. Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên
độ thông khí để đạt hiệu suất cực đại đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng khả
năng sinh kháng sinh; lượng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là
lưu lượng thổi khí 1 thể tích môi trường /1 phút.
- Nhiệt độ: có những loài xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt
độ của môi trường cao nhưng đa số các xạ
khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta
khảo sát thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28
O
C – 30
O
C (nhiệt độ phòng thí
nghiệm). Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm trong
khoảng 18
O
C – 28
O
C.
14
- pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH
của môi trường. Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung
tính, ở pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh.
- Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng
sinh không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất
như Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất
kháng sinh từ xạ khuẩn thường đòi hỏi có cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ
trong môi trường. nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như:
bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngô, … nguồn nitơ vô cơ là: muối amon hoặc
nitrat.
1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh:
Có nhiều quan điểm v
ề chất kháng sinh, có quan điểm cho rằng chất
kháng sinh là sản phẩm thải của quá trình trao đổi chất của xạ khuẩn, cũng có
quan điểm cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn
trong môi trường sống tự nhiên. Dù theo quan điểm nào đi nữa thì các con
đường sinh ra chất kháng sinh từ xạ khuẩn được tóm tắt như sau:
- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổ
i sơ cấp duy nhất
(như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm
nucleozit).
- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một
khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin).
- Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hóa các chất trao đổi
bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác. Có thể
phân biệt thành 4 dạng:
+ Chất kháng sinh nhóm polypeptit theo con đường trùng hợp các
acid amin: bacitracin, polymycin.
+ Chất kháng sinh được tạo thành nhờ ph
ản ứng polyme hóa các đơn
vị acetat, propionat: chất kháng sinh nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin.
+ Chất kháng sinh aminoglycozit được tạo thành nhờ các phản ứng
trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin.
+ Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp
chất izopreonit từ các đơn vị acetat…
vào quá trình vận chuyển, do đó không tiếp tục quá trình kéo dài chuổi
polypeptit và tách ra khỏi riboxom.
- Các chất kháng sinh dẫn đến sinh tổng hợp protein bất thường:
Một số chất có thể gắn với phần 30S của riboxom làm thay đổi cấu
hình không gian của tiểu thể này, ảnh hưởng đến việc gắn RNAm vào riboxom
làm rối loạn đọc.
17
Ví dụ: Streptomycin tác dụng làm cho codon UUU mã hóa cho
phenyl bị đọc sai thành AUU, mã hóa cho izolơcin do vậy acid amin
phenylalanime bị thay bằng izolơcin.(xem hình 1.6)
Hình 1.6: Sự ức chế tổng hợp protein của một số chất kháng sinh.
1.1.2.5.3. Phá hủy màng nguyên sinh chất:
Đó là các chất kháng sinh như Bacitracin, Polymicin.
Polymycin làm phá vỡ lớp phospholipid của cấu trúc màng nguyên
sinh chất làm cho các chất khuếch tán ra khỏi tế bào, tế bào sẽ chết.
Chất kháng sinh polyen tác động lên thành phần sterol của màng.
Màng tế bào vi khuẩn không chứa sterol nên thường không bị kháng sinh
thuộc nhóm này tác động, ngoại trừ tế bào nấm, tế bào động vật và tế bào
ngườ
i (do có thành phần sterol trên màng).
1.1.2.5.4. Ức chế tổng hợp acid nucleic:
Những chất kháng sinh như: mitomycin, actinomycin, mitramycin,
… gắn với acid nucleic (DNA, RNA) tạo thành phức hợp bất hoạt, ngăn cản
sự sao chép của các phân tử acid nucleoic này.
18
Một số chất kháng sinh chống virus như vidarabin, axiclovir có cấu
trúc giống acid nucleoic do đó có thể gắn với enzym cần tổng hợp DNA của
khuấy 1 giờ và lọc qua giấy lọc. Than hoạt tính được giải hấp phụ bằng dung
19
môi hữu cơ (aceton) với tỉ lệ 1:3 trong 6 giờ.; ngoài than hoạt tính còn có Oxit
nhôm và Gel silic là 2 chất được nạp vào các cột dùng trong các quá trình
phân ly của các sắc tố hay một số steroit. (Nguyễn Đức Lượng, 2001)
- Tách chiết kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion: các loại nhựa này là
những phân tử của styren trùng hợp với sự có mặt của một lượng nhất định
divinyl benzen, sự kết hợp đến 12% divinylbenzen sẽ tạo các cầu nối giữa các
m
ạch trong quá trình trùng hợp, cho phép tạo các mạng polyme làm tăng độ
xốp của chúng và làm khung cho nhiều nhóm hóa học, tạo ra tính đặc biệt cho
mỗi loại nhựa. những nhựa cationit mạnh chứa tới 3 nhóm sunfonic trong các
phân tử benzen làm cho nhựa có tính acid mạnh. Những chất trao đổi ion
cenllulotic là những este của cenlluloza, chúng đóng vai trò của chất trao đổi
anion hay cation. Ngoài ra chúng còn có những tính chất đặc biệt như hút
nước, khả năng trao đổi tăng nhanh hơn 5m Eq/g. Đối với tách chiết s
ản phẩm
trao đổi ở xạ khuẩn thường người ta sử dụng 5% nhựa trao đổi ion trong dịch
nuôi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và lắc trên máy lắc 2 giờ. Sau khi loại
dịch lọc, nhựa trao đổi được rửa bằng nước cất. Giải hấp phụ bằng NH
4
OH 1N
và HCl 1N, sau khi giải hấp phụ đem cô chân không ở 60
O
C và tủa kháng sinh
bằng aceton (theo Nguyễn Đức Lượng, 2001)
- Phương pháp tách chiết chất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ: quá
trình tách chiết bằng dung môi hữu cơ thường được thực hiện qua 2 giai đoạn:
đầu tiên là giai đoạn trộn 2 pha nước và dung môi để tăng bề mặt tiếp xúc,
Trước khi tách chiết, sinh khối cần rửa bằng nước để loạ
i bỏ thành
phần môi trường; các dung môi dùng để tách chiết có nhiều loại như: etyl
acetat, butanol, etanol, metanol, … nhưng trong đó aceton là dung môi có cực
thấp nhất thường hay được sử dụng nhiều hơn trong tách chiết chất kháng
sinh.
1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc:
Cũng tương tự như tách chiết kháng sinh từ sinh khối, các chất
kháng sinh trong dịch lọc có trọng lượng phân tử thấp thường hoà tan trong
nước và dung môi hữu cơ nên người ta thường l
ựa chọn dung môi hòa tan chất
kháng sinh mạnh để tách kháng sinh ra khỏi môi trường dịch lọc; butanol là
dung môi thường được sử dụng.
Copyright: Tài liệu đại học ©