R
L
E
D
S
Y
P
A
L
H
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của 4 năm miệt mài học tập trên ghế giảng
đường Đại học, cũng là bước khởi đầu để làm quen với công việc nghiên cứu khoa học
thực thụ. Vì vậy, nó vô cùng có ý nghĩa đối với mỗi sinh viên. Tuy nhiên, hoàn thành tốt
Khóa luận là một công việc không hề đơn giản, không chỉ đòi hỏi sự nỗ lực, cố gắng của
bản thân người thực hiện mà còn cần đến sự động viên, cổ vũ của gia đình, bạn bè đặc
biệt là sự giúp đỡ nhiệt thành của các thầy cô và cán bộ hướng dẫn. Qua đây, tôi xin gửi
lời cảm ơn đến những cá nhân đã nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện Khóa luận.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phan Văn Chi – Phó
viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Hoá Sinh Protein đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa
học trong suốt quá trình thực hiện khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Phương Thuận, Chủ nhiệm
bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên Hà Nội đã tận tình truyền thụ và trang bị cho tôi những nền tảng kiến thức vững
chắc trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể chủ động tiếp thu tốt hơn những
kiến thức khoa học mới khi làm khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS. Đỗ Quỳnh Hoa, người đã trực
tiếp hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận.

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................15
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.............................................................................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................15
2.1.2. Hóa chất........................................................................................................15
2.1.3. Thiết bị..........................................................................................................16
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................................16
2.2.1. Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết thanh.............................16
2.2.2. Kết tủa protein bằng TCA ở các điều kiện khác nhau...............................16
2
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford
......................................................................................................................17
2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)..............18
2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE).......19
2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin......................................20
2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS.
.................................................................................................................................20
2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8.....
.................................................................................................................................21
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................23
3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt...........23
3.2. Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được......................24
3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford............25
3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt.......................................................................27
3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp...........................................30
3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein...........................................32
3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE.......................................34
3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS..
.................................................................................................................................36
3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện...............37

Hình 8. Kết quả thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt............23
Hình 9. Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt.............................................................24
Hình 10. Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford....................26
Hình 11. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết thanh bền nhiệt trong mẫu nghiên cứu so với
protein tổng số..........................................................................................................27
Hình 12. Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt....................................................29
Hình 13. Sự hội tụ của Tris trên bản điện di 2-DE tại pH ứng với pKa của nó...................30
Hình 14. Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt trên dải pH 4-7......................................31
Hình 15. Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát các điều kiện kết tủa với TCA.......................33
Hình 16. Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu quả của việc loại Tris bằng phương pháp kết tủa
protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10.......................................35
Hình 17. Kết quả nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 .................................37
Hình 18. Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) của Haptoglobin gi|4826762..............38
Hình 19. Trình tự amino acid của protein haptoglobin gi|4826762.......................................38
Hình 20. Kết quả nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465.......................................39
5
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 21. Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) của apoA-I gi|37499465....................40
Hình 22. Trình tự amino acid của protein apoA-I gi|37499465.............................................40
Hình 23. Kết quả nhận dạng của transthyretin với số đăng ký gi|1181953...........................41
Hình 24. Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) của transthyretin gi|1181953......41
Hình 25. Trình tự amino acid của transthyretin với số đăng ký gi|1181953.........................42
6
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
MỞ ĐẦU
Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng
khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những
thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên
hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu
là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay.

1.1.1. Khái niệm về huyết thanh người
Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi máu
chống đông đã được loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào. Huyết tương là thành phần quan
trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm
55-60% thể tích máu[44].
Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ các
thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ
các yếu tố đông máu. Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các
protein hòa tan khác.... Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực
hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và
nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể.
Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính
hữu ích cho các nghiên cứu proteomics. Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng
cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8].
1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người
Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam
protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong
huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ
ng/ml. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9].
Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng
protein tổng số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin,
lipoprotein, ... [30]. Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất
thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu
giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do
nhiễm vi sinh vật, .... Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân
khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát
hiện chúng.
8
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [30]

sinh học từ đơn giản đến phức tạp nhất.
Vận chuyển các chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến các tổ chức và vận
chuyển các chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt;
haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol. Vận chuyển các protein cần
thiết để tổng hợp các tổ chức tế bào và mô.
Chức năng điều hoà: những protein này tuy có hàm lượng rất nhỏ (ng/ml) nhưng có vai
trò rất quan trọng trong mọi hoạt động của cơ thể. Chúng bao gồm các hormone, cytokine, các
protein ức chế đặc hiệu enzyme.
1.1.4. Phân loại protein trong huyết thanh theo Putnam
Dựa trên quan điểm về chức năng, Putnam (1975-1987) đã phân loại các protein trong
huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết từ các mô rắn, các immunoglobulin miễn dịch,
các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các
mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai.
Hệ thống phân loại này được thừa nhận rộng rãi và trích dẫn lại trong các nghiên cứu
của Anderson (2002) [9].
1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh
Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu
nghiên cứu hấp dẫn [1, 9]. Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được
quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh
toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó.
Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi là một
tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2].
Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc
và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong
cơ thể. Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà
việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển
10
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao
đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư. Những thay đổi bất thường về thành phần

cứu genome. Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành
cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ
đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh-y học, là nền tảng cho sự phát triển các
sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tương lai.
1.1.6. Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh
Hệ protein bền nhiệt trong huyết thanh là một trong những đối tượng nghiên cứu mới rất
hấp dẫn trong nghiên cứu về huyết thanh. Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác và
đầy đủ cho các protein loại này. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, hệ protein bền nhiệt trong
11
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
huyết thanh được xem như là tập hợp các protein có khả năng chịu được nhiệt độ, vẫn giữ được
hoạt tính sau khi đã được xử lý ở nhiệt độ 98
o
C trong 10 phút theo phương pháp của Goufman
và có thể nhận ra được bằng một số phương pháp proteomics như điện di hai chiều và khối phổ
[22]. Các protein bền nhiệt trong huyết thanh thường là những protein có nồng độ thấp và rất
thấp (có thể < 1 pmol), vượt quá giới hạn độ nhạy của các phương pháp nghiên cứu protein
truyền thống. Do đó, trong suốt một thời gian dài, các nghiên cứu về hệ protein bền nhiệt không
được phổ biến và không theo kịp với sự tiến bộ nhanh chóng trong các nghiên cứu về hệ protein
khác ở người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng và vượt bậc
về mặt kỹ thuật, các phương pháp nghiên cứu protein mới như hệ sắc ký Nano đa chiều, phương
pháp nhận diện và định lượng protein bằng khối phổ đã cho phép nhà nghiên cứu thao tác trên
các protein có hàm lượng nhỏ hơn 1pg nhiều lần. Các phương pháp này đã mở ra triển vọng mới
cho việc nghiên cứu các hệ protein hàm lượng thấp, trong đó có hệ protein bền nhiệt trong huyết
thanh.
Tính bền nhiệt của các protein có mối quan hệ chặt chẽ với các cấu trúc tương ứng của
chúng. Ngoài ra, nó còn liên quan đến những cải biến và những biến đổi sinh hóa của protein
như các quá trình glycosyl hóa [31], ..... Do đó, sự thay đổi tính bền nhiệt của protein chắc chắn
có những mối liên hệ nhất định với các biểu hiện bệnh lý. Nghiên cứu các protein bền nhiệt có
thể giúp tìm ra những ứng viên chỉ thị bệnh hiệu quả và có độ nhạy cao.

Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bằng một
trong các phương pháp sau: điện di gradien pH cố định (immobilized pH gradient
electrophoresis, IPGE), điện di hội tụ theo điểm đẳng điện (isoelectric focusing, IEF) hoặc điện
di gradien pH không cân bằng (non-equilibrium pH gradient electrophoresis, NEPHGE), trong
đó phổ biến nhất là điện di IEF [2, 14]. Chiều thứ hai, các phân tử protein được phân tách bằng
phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamid (như điện di SDS-PAGE) (hình 2). Do đó,
thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, (i) chiều thứ nhất theo điện tích
và (ii) chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử.
13
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 2. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE sử dụng thanh IPG Strip [2]
Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric point) của các protein chính là cơ sở của
IEF. pI là giá trị pH tại đó điện tích bề mặt tổng số của protein bằng 0 (protein không di chuyển
trong điện trường). Mỗi protein có một giá trị pI xác định, do đó dưới tác dụng của điện trường
trong quá trình điện di IEF, các protein sẽ di chuyển và dừng lại tại vị trí có pH tương ứng với pI
của chúng.
1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE
Điện di 2-DE là một trong những công cụ mạnh trong phân tích các hỗn hợp protein
phức tạp và là phương pháp không thể thay thế trong so sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh
so với mô thường [2, 32]. Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được áp dụng rộng rãi và
thường gắn liền với proteomics vì nó có khả năng phân tách cao, hiển thị hình ảnh so sánh
tương quan, đem lại bức tranh toàn cảnh về mức độ biểu hiện khác nhau của các protein [20].
Khả năng tập hợp dữ liệu và số hóa dữ liệu cũng là một trong những yếu tố quan trọng
cho phép 2-DE trở thành một phương pháp thực nghiệm có nhiều ý nghĩa trong việc xây dựng
các tập hợp thông tin về một hệ proteome. Nó cho phép so sánh khách quan các kết quả nghiên
14
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
cứu, điều chỉnh sự sai khác trong kết quả nghiên cứu giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau và
phân loại được một số lượng khổng lồ các dữ liệu protein đã được phân tích [14].
Một trong những ưu điểm nữa của phương pháp điện di 2-DE là khả năng kết nối với

tăng cường sự phân tách của các protein mà điểm đẳng điện của chúng có độ tương đồng cao
[39]. Người ta thường sử dụng pH 3-10 trên một bản gel trước, sau đó sử dụng các dải pH hẹp
gối lên nhau (sole nhau) để tăng cường độ phân giải của bản gel thu được.
16
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 4. Hiệu quả của việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên nhau [39].
Khi lựa chọn dải pH hẹp, các protein nằm ngoài vùng pH đã chọn sẽ không được tải lên
thanh Strip, lượng protein quan tâm được tải lên thanh Strip nhiều hơn và do đó cho phép phát
hiện được nhiều điểm protein hơn [39] (hình 4).
Ảnh hưởng của việc lựa chọn phương pháp nhuộm
Protein phân tách được bằng kỹ thuật 2-DE có thể được nhuộm màu bằng các phương
pháp nhuộm truyền thống để dễ quan sát, bao gồm nhuộm bạc, Coomasie và amido đen, ...
Trong đó, phương pháp nhuộm bạc và nhuộm huỳnh quang kiểu mới cho độ phân giải cao nhất
[32].
Mặc dù có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau, nhưng không phải tất cả các phương
pháp này đều phù hợp với những thí nghiệm phân tích tiếp theo. Ví dụ phương pháp nhuộm bạc
17
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
và cố định bằng formalin sẽ cố định các protein trong gel và ngăn cản sự thủy phân chúng bằng
enzyme khi phân tích bằng khối phổ [32].
1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS)
Nguyên lý chung của khối phổ
Khối phổ (Mass spectrometry-MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các
phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân
tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối
được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học.
Cấu tạo chung của máy khối phổ
Máy khối phổ thường được cấu tạo từ các bộ phận chính sau đây: (1) bộ phận đưa mẫu;
(2) nguồn ion hóa; (3) hệ thống bơm chân không; (4) bộ phận phân tích khối (mass analyzer) đo
tỷ lệ m/z; (5) bộ phận đo tín hiệu (detector) xác định số lượng các ion ở mỗi giá trị m/z; (6) hệ