BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐOÀN THỊ THU HOÀI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN
Streptococcus spp GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ
RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) CỦA DỊCH ÉP
CÂY CỎ LÀO (Chromolanea odorata)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

VINH - 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN
Streptococcus spp GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ
RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) CỦA DỊCH ÉP
CÂY CỎ LÀO (Chromolanea odorata)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Người thực hiện : Đoàn thị Thu Hoài
Người hướng dẫn : TS. Trần Ngọc Hùng

VINH - 2011

Trang
ĐOÀN THỊ THU HOÀI.........................................................................................................1
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP................................................................................................1
KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN.....................................................................................1
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP................................................................................................2
KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN.....................................................................................2

PHỤ LỤC

ii


DANH MỤC VIẾT TẮT
TT

Chữ viết tắt

Viết đầy đủ

1

ctv

Cộng tác viên

2

h

Giờ


8

VKK

Vòng kháng khuẩn

iii


DANH MỤC BẢNG
Trang
Hình 1.1.1: Cây cỏ Lào Chromolaena odorata.......................................................................3
Hình 1.1.2. Vi khuẩn Streptococcus spp...............................................................................5
Hình 1.1.3. Cá Rô phi vằn Oreochromis niloticus.................................................................7
Sơ đồ 2.4.1. Sơ đồ khối nội dung thí nghiệm.......................................................................17
Hình 2.4. Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn.................................................................18
Sơ đồ 2.4.2 Thí nghiệm tính kháng khuẩn của dịch ép.......................................................20
Sơ đồ 2.4.3. Thí nghiệm nồng độ kháng khuẩn của dịch ép cây cỏ Lào..............................21
Sơ đồ 2.4.4. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau..................23
Sơ đồ 2.4.5. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản..................................23
Bảng 3.1. So sánh đường kính vòng kháng khuẩn của các bộ phận cây cỏ Lào đối với
Streptococcus spp.................................................................................................................25
Hình 3.1.1 So sánh đường kính vòng kháng khuẩn của các bộ phận cây cỏ Lào đối với
Streptococcus spp.................................................................................................................26
Hình 3.1.2 Đường kính vòng kháng Hình 3.1.3 Đường kính vòng kháng khuẩn phần ngọn
khuẩn phần lá........................................................................................................................26
Bảng 3.2. So sánh đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của các nồng độ
dịch ép cỏ Lào......................................................................................................................27
Hình 3.2.1. So sánh đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của các nồng dịch

Hiện nay, có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến việc điều trị không hiệu quả
đối với các bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản như: các loại kháng sinh
trước đây sử dụng đặc trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá nước ngọt không còn hiệu
quả do các dòng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng, danh mục kháng sinh
bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản theo quy định ngày càng nhiều….
Trước tình hình đó, việc tìm ra các giải pháp mới trong phòng – trị bệnh
nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản nói chung, cá Rô phi vằn nói riêng nhằm
thay thế các loại hóa chất, kháng sinh đang được sử dụng. Xu hướng nghiên
cứu các chất chiết xuất từ thảo dược không độc hại, không gây ô nhiễm môi
trường đang được nhiều người quan tâm. Trong số các loại thảo dược nghiên
cứu thì cỏ Lào là một loài thảo dược có nhiều ưu điểm nhưng vẫn chưa được
nghiên cứu nhiều.

1


Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Thử nghiệm khả năng kháng
vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh lở loét trên cá rô phi vằn
(Oreochromis niloticus) của dịch ép cây cỏ Lào”.
2. Mục tiêu đề tài:
- Xác định bộ phận sử dụng có tính kháng khuẩn mạnh nhất của cây
cỏ Lào.
- Xác định nồng độ dịch ép cỏ Lào phù hợp tiêu diệt vi khuẩn.
- Xác định khả năng kháng vi khuẩn của cỏ Lào ở các mức nhiệt độ.
- Xác định nhiệt độ bảo quản của cây cỏ Lào.

2


Chương 1


Đầu lá nhọn, mép có răng cưa thưa, có lông thưa và ngăn ở cả hai mặt lá và
ngọn cành. Vò lá và cành non có mùi hắc thơm. Cụm hoa đầu, hình trụ dài 9 –
11mm, đường kính 5 – 6mm. Lúc mới nở, hoa màu xanh tím, sau trắng [45].
Quả bé nhỏ dài, đầu có túm lông nên có thể phát tán đi rất xa nhờ gió.
Mùa hoa tháng 11 – 12 dương lịch. Ở Việt Nam, cỏ Lào phân bố nhiều nhất ở
trung du, miền núi thấp ngay ở ngoại thành Hà Nội cũng thấy những bụi lớn
cỏ Lào mọc ven đường. Cây có thể sinh sản vô tính rất mạnh. Ngọn non, cành
già bẻ trụi lá cắm xuống đất chỉ một tuần là mọc rễ trắng. Chặt cây sát gốc
càng đâm chồi mạnh. Mãi năm 1935 các nhà thực vật học mới ghi nhận cây
cỏ Lào ở Việt Nam[45].
Về công dụng trong y học, từ lâu dân gian đã biết dùng cỏ Lào để cầm
máu, chữa lành các vết thương, vết bỏng và trị một số bệnh do nhiễm khuẩn
về đường ruột, ung nhọt, ghẻ lở, viêm đại tràng, đau nhức xương, cảm cúm...
[21].
Năm 1976, Viện Nghiên cứu y học quân sự công bố kết quả nghiên cứu:
Tác dụng chống viêm, tác dụng kháng khuẩn của cỏ Lào. Tác dụng chống
viêm bộ phận sử dụng là lá, thân, ngọn, rễ nhưng là lá mạnh hơn cả. Tác dụng
kháng khuẩn: nước sắc cỏ Lào có tác dụng ức chế vi khuẩn gây mủ trên vết
thương và ức chế trực khuẩn lỵ Shigella [24].
Năm 1983 đã nghiên cứu xác định hiệu lực kháng khuẩn của cỏ Lào theo
tháng và theo tuổi. Ngọn non và lá bánh tẻ thu hái trong các tháng đều có hiệu
lực như nhau. Ngọn có nụ hiệu lực kháng khuẩn kém [44].
Thành phần hóa học của cỏ Lào đã được nhiều tác giả trong và ngoài
nước nghiên cứu. Học viện Quân Y 17 đã nghiên cứu dịch chiết toàn phần từ
cây Cỏ Lào để bào chế dạng thuốc trị vết thương, vết bỏng. Những nghiên
cứu cho thấy Cỏ Lào giàu đạm, lân, kali. Lá và ngọn non cỏ Lào chứa: Đạm
2,65%, kali(K2O) 2,48%, Lân(P2O5) 0,5%, tinh dầu, tanin, flavonoid,
coumarin và ankaloit. Trong số đó flavonoid là nhóm hợp chất có hoạt tính
4


Streptococcus Autin, 1987

Hình 1.1.2. Vi khuẩn Streptococcus spp

5


Streptococcus spp là vi khuẩn thường gây bệnh lở loét trên cá hay còn
gọi là bệnh đốm đỏ. Nó thường tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm,
ngoài ra chúng ta còn tìm thấy trong muối tươi, biển và nơi cửa sông, được
phân lập từ người và động vật. Vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá,
người và động vật lưỡng cư như ếch, thằn lằn, cá sấu…[9].
Theo Bergey (1984)[7], Streptocuccus spp có hình dạng cầu hoặc hình
ovan, có thể đứng riêng lẻ, thành cặp hay tạo thành chuỗi dài nên gọi là cầu
khuẩn. Vi khuẩn bắt màu tím của Gram dương không di động, hầu hết yếm
khí tùy tiện, lên men trong môi trường Glucoze, nhu cầu phát triển phức tạp.
Vi khuẩn có kích thước 0,5 x 1- 1,5 μm.
Streptocuccus spp phát triển tốt trên các môi trường thạch Tryptic Soy,
Brain Heart Infusion, Muller-Hinton, Nutrien agar và thạch máu cừu. Nhiệt
độ nuôi cấy thích hợp 25 – 28 oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo khuẩn lạc
nhỏ (0,5 - 0,7mm) màu trắng đục, hình tròn, hơi lồi. Một số chủng vi khuẩn
tạo khuẩn lạc trong suốt có tính nhầy sau 24 giờ nuôi cấy. Vi khuẩn không
phát triển ở điều kiện pH 9.6, NaCl 6.5%, nhiệt độ 10oC và 45oC.
Streptococcus spp là tác nhân chính của nhiều bệnh nguy hiểm gây nên
thiệt hại lớn cho cá nước ngọt nói chúng và cá Rô phi nói riêng, làm ảnh
hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành NTTS thế giới.

6


sống trong khoảng nhiệt độ 8 – 420C, nhiệt độ thích hợp để cá tăng trưởng tốt
là 28 – 300C, pH thích hợp là 6,5 – 8,5, độ mặn thích hợp là 10 – 12% [38].

7


1.2. Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong phòng,
trị bệnh cho ĐVTS
Kháng sinh là chất hữu cơ do sinh vật tiết ra hoặc do con người tổng hợp
nên, có khả năng ức chế, kìm hãm và tiêu diệt vi khuẩn ở một nồng độ nhất
định. Trong y học, thú y và nuôi trồng thủy sản, người ta dùng kháng sinh để
trị các bệnh nhiễm khuẩn và đem lại hiệu quả rất cao, nếu dùng đúng thuốc,
đúng liều và đúng thời gian. Tuy vậy, kháng sinh cũng là con dao hai lưỡi, có
thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe động vật sử dụng nó và cũng có tác động
không nhỏ tới môi trường sinh thái, nếu dùng kháng sinh tùy tiện và thiếu
hiểu biết có khả năng làm giảm sức đề kháng của vật nuôi với các loại mầm
bệnh [9].
Việc sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh vi khuẩn đã mang lại
những thành công nhất định, nhưng nó cũng làm gia tăng những dòng vi
khuẩn kháng thuốc (Weston, 1996). Sự kháng thuốc này còn được truyền
sang dòng vi khuẩn khác thông qua các thể plasmid trong đó có các vi khuẩn
gây bệnh trên người và động vật nuôi khác, làm hạn chế việc sử dụng kháng
sinh trong phòng trị bệnh cho người và trong thú y (Towner, 1995).
Dư lượng kháng sinh tồn tại trong cơ thể động vật thủy sản nuôi làm
giảm giá trị thương phẩm và tăng rủi ro cho người tiêu thụ. Sự kháng thuốc
cũng được tìm trên những vi khuẩn gây bệnh cho người (Towner, 1995). Ở
Anh và Ai Len, ADN của những vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đã chuyển
sang các loại vi khuẩn E. coli và Aeromonas phân lập từ các bệnh viện
(Rhodes và ctv, 2000).
Một trong những lý do quan trọng nhất để kiểm soát việc sử dụng kháng

nuôi hoặc giúp sinh ra kháng thể. Bên cạnh đó, có nghiên cứu còn chứng
minh được tính vô hại của thảo dược đối với môi trường. Mặc dù còn hạn chế
nhiều so với nghiên cứu trên người và gia súc nhưng cũng có một số nghiên
cứu điển hình như:

9


- Ở Thái Lan, Sataporn Direbusarakom, Ungkana Hiransali và Sompron
Runngkammerdwong (1997) đã thử nghiệm tác dụng của một số loại cây
Ocimum sanctum, Eclipta alba, Cassia alata,...đối với YHV trên Penaeus
monodon. Kết quả cho thấy O.sanctum, E. alba, C. alata, P. acidus... có tác
dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn này và nồng độ ức chế tối thiểu là 1mg/ml,
liều gây chết 50% đối với poslava 15 sau 24h là 1,987 – 3,548 ppm [39].
- Ở Trung Quốc, Khuê Lập Trung (1985) trong “Kỹ thuật phòng trị bệnh
tôm, cá và nhuyễn thể” đã đưa ra 22 loại thảo dược chủ yếu phòng trị bệnh
nhiễm khuẩn, ngoại ký sinh trùng và bệnh đường ruột. Các loài thảo dược có
thể kể như: Xuyên Tâm liên, Địa Niên thảo, Lưu Xô thử, Tiền thảo, Quản
trọng…[22].
Một nghiên cứu trên cá chép ở Trung Quốc là người ta trộn lẫn một số
thảo dược với nhau (Astragalus mempranaceus phần rễ và thân, Poligonum
multiflorum phần rễ, Isatis tinctoria phần rễ, Glycyrhida grabra phần thân)
cho cá ăn 0,5 và 1% trong thời gian 30 ngày, kết quả cho thấy tính miễn dịch
của cá tăng lên đáng kể [30].
Hiện nay ở Trung Quốc sản phẩm được sử dụng phổ biến và nhiều người
biết đến có nguồn gốc từ tỏi (Allium sativum), đóng gói dạng bột mịn trắng với
trọng lượng 1kg/gói (trong gói 1kg có 10 gói nhỏ mỗi gói có trọng lượng
100gram) đã được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trong việc phòng và trị
bệnh nhiễm khuẩn trên cá trắm cỏ nói riêng và cá nuôi nước ngọt nói chung [10].
Một hợp tác nghiên cứu giữa các nhà nghiên cứu người Trung Quốc và

Cũng ở Ấn Độ, người ta cũng đã tiến hành nghiên cứu trong quy mô
phòng thí nghiệm với 3 loại thảo mộc Ocimum sanctum (OS), Withania
somnifera (WS) và Myristica fragrans (MF) có ảnh hưởng kháng lại vi khuẩn
Vibrio harveyi gây bệnh trên cá song (Epinephelus tauvina) bước đầu đã có
kết quả tốt trong việc trị bệnh do vi khuẩn Vibrio harveyi. Một nghiên cứu
khác tại Ấn Độ cho thấy chất chiết từ lá ổi và quả ổi có tác dụng chống lại các

11


loài vi khuẩn Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Bacillus, E. coli,
Clostridium và Pseudomonas [40].
Nhìn chung, trên thế giới đã quan tâm tới vấn đề hiệu quả sử dụng thảo
dược về khía cạnh kháng khuẩn trên các đối tượng thủy sản nhằm phòng và
trị bệnh. Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu còn hạn chế ở quy mô phòng thí
nghiệm, các sản phẩm ra đời trên thị trường từ các kết quả nghiên cứu hiện
nay còn hạn hữu.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược ở Việt Nam
Cũng như nhiều nước trên thế giới có nghề NTTS, Việt Nam cũng đang
đối mặt với những ảnh hưởng lớn của dư lượng hóa chất, kháng sinh sử dụng
tồn đọng trong sản phẩm thủy sản gây độc cho sức khỏe con người, vật nuôi
đồng thời tác động xấu đến môi trường sinh thái.
Để khắc phục tình trạng lệ thuộc vào hóa chất, kháng sinh trong phòng
trị bệnh cho động vật thủy sản nuôi, đảm bảo nguồn thực phẩm an toàn cho
người tiêu dùng, thời gian qua đã có không ít những nghiên cứu sử dụng thảo
dược trong phòng trị bệnh thủy sản. Một số loài thảo dược đã được đưa vào
nghiên cứu: tỏi, lá xoan, lá ổi, lá hẹ,… Đối tượng nuôi được nghiên cứu bao
gồm cả các loài nước mặn và nước ngọt như cá chép, cá trắm cỏ, cá rô phi, cá
song [23].
Từ lâu, nhân dân ta đã biết sử dụng cây cỏ xung quanh mình để trị nhiều

calendulacae); nhọ nồi (Eclipta alba Hassk); bồ công anh (Lactuca indica
L.); cây vòi voi (Heliotrpium indicum L.); chó đẻ răng cưa (Phyllantus
urinaria L.) và vitamin cùng một số vi lượng khác. Thuốc có tác dụng phòng
và trị bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của cá nuôi lồng
hay nuôi ao [10].
Ở miền Nam, các cây cỏ được dùng trong phòng trị bệnh cho vật nuôi
thủy sản chủ yếu từ kinh nghiệm dân gian: Khu vực nuôi cá bè ở Tân Châu -

13


Châu Đốc - An Giang; Hồng Ngự - Đồng Tháp; Vĩnh Hưng, Tân Hưng Đồng Tháp Mười - Long An,…người dân đã biết dùng cây cỏ mực (Prostista
alba), dây trầu không (Piper better L.) để phòng trị bệnh ký sinh trùng cho cá;
lá ổi (Psidium guajava) chữa bệnh nhiễm khuẩn cho cá [15].
Năm 2002, Phan Xuân Thanh và ctv đã nghiên cứu chọn ra được một số
cây có hoạt chất chính là 2 - hydro - 6 -pentodecatrienylbenzoate có tác dụng
chống khuẩn và chống nấm phổ rộng. Hoạt chất này là thành phần chính của
chế phẩm Sông Lam TS3 hiện đang được sử dụng để phòng trị bệnh cho động
vật thủy sản [10].
Nguyễn Thị Vân Thái (2004), đã nghiên cứu thấy nhiều vị thuốc có tính
kháng khuẩn được kết hợp với nhau để trở thành một đơn thuốc, ví dụ như:
kết hợp củ cải, hạt tía tô, hạt cải bẹ để trị bệnh nhiễm khuẩn ở phổi hoặc kết
hợp với các vị hoàng liên, hoàng lá, đại hoàng, gọi là “tam hoàng” để sắc rửa
vết thương nhiễm khuẩn. Ngày nay, với y học tiến bộ người ta đã tách chiết
thành công các hoạt chất làm tăng tác dụng điều trị và ổn định chế phẩm [19].
Theo tổng kết của Đỗ Tất Lợi (2006), hợp chất có trong thảo dược rất
phong phú, chúng được chia thành các nhóm trong đó bao gồm kháng sinh
thực vật (Phitoncid) có tác dụng diệt khuẩn cũng như hạn chế sự sinh trưởng
của các loại vi khuẩn [23].
Viện bỏng quốc gia ngày 28/6/2006 đã hoàn thành quy trình sản xuất

về nồng độ thảo dược, ảnh hưởng của nhiệt độ, nhiệt độ bảo quản, các chất
hóa học....đến tính kháng khuẩn của thảo dược còn ít. Mặt khác, phần lớn
đang sử dụng dịch chiết dạng thô, chưa tách được kháng sinh nguyên chất có
trong thảo dược nghiên cứu.

15


Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Cây cỏ Lào (Chromolaena odorata) thuộc họ Cúc (Asteraceae).
- Vi khuẩn Streptocuccus spp được thu và lưu giữ ở phòng thí nghiệm vi
sinh bệnh học khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh.

2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ thí nghiệm
- Đĩa petri, kính hiển vi

- Que cấy, đèn cồn, lam kính, khay inox, panh, kẹp gắp
- Dao, kéo, cối, chày, lưới lọc, giấy lọc, cốc thủy tinh, đĩa lồng
- Tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp
- Nước cất, dầu soi kính
Và một số dụng cụ cần thiết khác.
2.2.2. Môi trường và hóa chất
- Môi trường: Nutrient Agar,
- Hóa chất: Dung dịch chỉ thị màu dùng để nhuộm Gram: Dung dịch
Crysta Violet, dung dịch Lugol, dung dịch cồn 96%, dung dịch Safranin.

2.3. Nội dung nghiên cứu

Thử nghiệm khả năng kháng vi
khuẩn ở các nhiệt độ bảo quản

Kết luận

Sơ đồ 2.4.1. Sơ đồ khối nội dung thí nghiệm
2.4.2. Phương pháp tách chiết dịch ép
Cỏ Lào thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ
phòng, cân khối lượng rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, vắt lấy dịch ép qua
lưới lọc. Dịch ép được bảo quản ở nơi khô thoáng với nhiệt độ luôn bảo đảm
dưới 500C tránh hiện tượng tác dụng dược lý của thảo dược bị mất đi bởi nhiệt
độ.
17


2.4.3. Xác định mật độ vi khuẩn
Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml nước muối
sinh lý.
Lấy 1ml mẫu nước cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ nhất làm
đồng đều ta được độ pha loãng 10 lần (10-1).
Lấy 1ml nước ở ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2, ta được độ
pha loãng 100 lần (10-2).
Cứ làm như vậy ta được độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4, …,10-n.
Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy
trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt. Mỗi độ pha loãng nuôi
cấy từ 2 – 3 đĩa lồng.
Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên
đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng.

Nước muối sinh lý

9ml

NA(-)

9ml

NA(-)

Hình 2.4. Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn
Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: X =

18

A
V .K

NA(-)


Trong đó:
X: mật độ vi khuẩn
A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng
V: Thể nước đưa vào nuôi cấy
K: Hệ số pha loãng
2.4.4. Phương pháp thử kháng sinh đồ
Thử kháng sinh đồ theo phương pháp của Bauer - Kirby (1997): Kháng
sinh đồ được thực hiện trên môi trường Nutrient agar, các đĩa giấy có kích
thước 0,6 cm được tẩm dịch ép của các loại thảo dược đến no (mỗi nồng độ
thảo dược thử nghiệm được lặp lại 4 lần).
Cách tiến hành: - Dùng pipet lấy 0,1ml dung dịch vi khuẩn, dàn đều lên