CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
*************
NGUYỄN THỊ HẠNH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM
RẮN PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO (HPLC)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002-2007)

HÀ NỘI ,5 - 2007
BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
*******

1


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

NGUYỄN THỊ HẠNH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHÊ PHẨM
RẮN PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO (HPLC)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002- 2007)

Người hướng dẫn: TS Đoàn Cao Sơn
TS Nguyễn Hải Nam

nhà trường.
Tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, và những người luôn sát cánh bên
tôi động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Nguyễn Thị Hạnh
A1 K57

3


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

MỤC LỤC
BỘ Y TẾ...............................................................................................................1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI................................................................1
*************....................................................................................................1
NGUYỄN THỊ HẠNH.........................................................................................1
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM RẮN
PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) 1
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002-2007).....................1
HÀ NỘI ,5 - 2007.................................................................................................1
BỘ Y TẾ...............................................................................................................1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ...............................................................1
******* 1
NGUYỄN THỊ HẠNH.........................................................................................2
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHÊ PHẨM RẮN
PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) 2
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002- 2007)....................2
MỤC LỤC............................................................................................................4

2.3. NỘI DUNG..................................................................................................33
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................34
2.4.1. Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu.................34
2.4.2. Cách đánh giá kết quả .............................................................................34
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ........................................................36
3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM
36
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn sắc ký .....................................................................36
3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký ...........................................43
3.1.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp.................................................44

5


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp .....................................................46
3.1.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp:........................................................49
3.2. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM ...............................54
3.3. BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ.................................................................................57
KẾT LUẬN........................................................................................................59
PHỤ LỤC...........................................................................................................60
MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ VÀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI THU ĐƯỢC TRONG
CHƯƠNG TRÌNH THỰC NGHIỆM.................................................................60
61
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT...........................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI........................................................75

6

1.1.7. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12]......................................16

7


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)[3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19, 20]..................................................................17
1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)..........................17
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ..............................................................18
1.2.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký ...............................................................................19
1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC...................................................19
1.2.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng...21
1.2.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký...................................25
1.2.7. Ứng dụng của HPLC................................................................................29
PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN
NGHIÊN CỨU....................................................................................................32
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .....................................................................32
2.2. PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT................................................32
2.2.1. Hóa chất....................................................................................................32
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................33
2.3. NỘI DUNG..................................................................................................33
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................34
2.4.1. Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu.................34
2.4.2. Cách đánh giá kết quả .............................................................................34
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ........................................................36
3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM
36
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn sắc ký .....................................................................36

ra, có thể xảy ra với mọi đối tượng khác nhau. Để điều trị các rối loạn trên một
nhóm thuốc kháng histamin ra đời với tác dụng kháng histamin trên thụ thể H 1.
Nhưng các thuốc trước đây khi sử dụng luôn gây khó khăn cho con người trong
công việc và sinh hoạt do tác dụng phụ gây buồn ngủ, cùng việc sử dụng liều
nhiều lần trong ngày. Kháng histamin thế hệ 2 ra đời là một giải pháp hữu hiệu
khắc phục nhược điểm trên nên kháng histamin thế hệ 2 nhanh chóng được sử
dụng rộng rãi và phổ biến trong đó điển hình có cetirizin [1, 8].
Cetirizin là kháng histamin có tác dụng mạnh, kéo dài, chọn lọc trên thụ
thể H1. Hiện nay trên thị trường dược phẩm trong nước và nước ngoài có hàng
ngàn chế phẩm cetirizin được sản xuất. Chính vì vậy việc đảm bảo chất lượng
cho rất nhiều chế phẩm của một thuốc như vậy là vấn đề đáng được quan tâm.
Các dược điển European 4th, BP 2005 [9, 10] mới chỉ có chuyên luận kiểm tra
cetirizin dạng nguyên liệu mà chưa có chuyên luận kiểm tra chất lượng cetirizin
trong viên nén. Vì vậy xây dựng một phương pháp định lượng có thể dùng cho
cả dạng nguyên liệu và viên nén một cách chính thống là hết sức cần thiết.
Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, với sự phát triển vượt bậc của khoa
học kĩ thuật, đã có nhiều thành tựu mới được đưa vào ứng dụng đem lại cho
chúng ta những phương pháp kiểm nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao. Một
trong những phương pháp đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương
pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định lượng có kết quả
nhiều hoạt chất trong đa dạng các loại chế phẩm.

10


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu định
lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) ” với các mục tiêu cụ thể sau:


Mô phỏng cấu tạo của cetirizin

13


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Công thức phân tử : C18H25ClN2O3
Khối lượng phân tử: 461, 82
Tên khoa học: acid (RS)-2-[2[4[(4-Clorophenyl)phenylmethyl]piperazin1-yl] ethoxy]acetic.
1.1.2. Tính chất
Cetirizin có dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, pKa 1 = 2,9 tương
ứng pKa cuả nhóm cacboxylic; pKa2 = 8,3 tương ứng pKa nhóm amin bậc 3;
Tan tốt trong nước, đặc biệt là trong aceton và methylen clorid;
Trong phân tử cetirizin có dây nối liên hợp nên có khả năng hấp thụ ánh
sáng tử ngoại. Phổ hấp thụ của dung dịch 20µg/ml trong acid hydrochlorid R
(10,3g/l) trong giới hạn quét phổ từ 210nm đến 350 nm có cực đại hấp thụ tại
231nm với độ hấp thụ riêng 359-381.
1.1.3. Tác dụng dược lý
− Tác dụng dược lực học:
Cetirizin là chất thuộc nhóm dẫn chất của piperazin, là chất chuyển hoá
của hydroxyzin (oxy hoá nhóm chức –OH alcol thành –COOH) có tác dụng đối
kháng histamin mạnh, kéo dài và đặc biệt chọn lọc trên thụ thể H1. Cetirzin có
tác dụng an thần, gây ngủ và kháng cholinergic đều rất yếu, không kháng
serotonin. Cetirizin ức chế giai đoạn sớm của phản ứng dị ứng qua trung gian
histamin và cũng làm giảm sự di dời của các tế bào viêm. Giảm giải phóng các
chất trung gian ở giai đoạn muộn của phản ứng dị ứng. Chất này có tác dụng bảo
vệ dưỡng bào, giảm đáng kể đáp ứng hen suyễn với histamin.
− Tác dụng dược động học:

− ZYRTEC dung dịch uống 1mg/1ml lọ 75ml
− ZYRTEC dung dịch uống 10mg/ml lọ 10ml

15


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

− Chế phẩm của hãng UCB PHARM
− CETINAX viên nén 10mg
− Chế phẩm của MEDOPHARM -TENAMYD CANADA
− HICET viên nén 10mg bao phim
− Chế phẩm của công ty Micro labs limited
− CEZILviên nén 10mg bao phim
− Chế phẩm của công ty Alkem labs.
Ngoài ra cetirizin thường được kê đơn với pseudoephedrin nên có chế
phẩm kết hợp với pseudoephedrin
− ZYRTEC-D, VILIX-D chế phẩm của UCB pharma.
1.1.7. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12]
Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng đã được
đưa ra như sau:
∗ Phương pháp chuẩn độ acid –base [9, 10]
Cân chính xác lượng bột tương ứng với khoảng 0,1g cetirizin hoà tan
trong 100 ml dung dịch gồm 30 thể tích nước và 70 thể tích aceton. Chất chuẩn
độ dùng là dung dịch NaOH 0,1M.
1ml NaOH 0,1M tương ứng với 15,39mg C21H27Cl3N2O3
∗ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [7, 11, 12]
− Phương pháp 1 [7] :
+ Cột C18 (phenomenex)
+ Pha động dung dịch đệm phosphat 0,01M (1,36g KH2PO4 trong

lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [3].
b. Khái niệm về sắc kí lỏng hiệu năng cao

17


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) là một
phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau giữa hai pha
luôn tiếp xúc không trộn lẫn vào nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng được
đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực của một bơm cao áp. Pha tĩnh chứa trong
cột là một chất rắn được phân chia dưới dang tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ
lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi băng liên kết hoá
học với các nhóm hữu cơ. Sắc ký lỏng phân tách dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học trên bề mặt [3].
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là
yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:
Nếu pha tĩnh là bản chất hấp phụ (silicagel, nhôm oxy hoặc polyme thuần
tuý) thì ta có sắc ký hấp phụ.
Nếu pha tĩnh bản chất là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ hoặc
đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ ta có sắc ký phân bố.
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion.
Nếu pha tĩnh là các gel, ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử).
Khi đặt chất phân tích lên đầu cột ta cho pha động chạy liên tục cột ta đã
thực hiện quá trình sắc ký
Ví dụ, nếu ta nạp một hỗn hợp ba chất A, B, C vào cột tách thì khi bơm
pha đông qua cột tách các quá trình sắc ký xảy ra. Khi đó A, B, C tách ra khỏi
nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là


19


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Có hai loại bơm
− Một loại bơm đẳng dòng (Isocratic pump)
− Hai là loại bơm chương trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump)
b. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường được làm bằng thuỷ tinh, đôi khi là thép
không gỉ. Cần lọc các hạt trong dung môi (thường dùng các màng lọc cỡ lỗ
0,45µm) và đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi
khí). Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong
phương pháp gradient có thể cần đến 2, 3, 4 bình chứa dung môi.
c. Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể dùng bơm tiêm để tiêm vào đầu cột. Phương
pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích
xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với các dung tích khác
nhau. Một số máy HPLC có hệ thống tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều
khiển thể tích tiêm (microsyringe), số lần tiêm và chu kì rửa vòng chứa mẫu.
d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể coi là bộ phận quan trọng nhất của
hệ thống sắc ký vì ở đây xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột có ảnh hưởng
lớn tới khả năng tách các chất cần phân tách. Cột được chế tạo bằng thép đặc
biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha
tĩnh của hệ sắc ký. Cột có nhiều kích cỡ khác nhau, tuỳ mức độ và mục đích của
quá trình sắc ký. Một cột phân tích thông thường dài 10-30cm có đường kính 410mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10µm, số đĩa lý thuyết 40.000 – 60.000 Với chất nhồi
cột cỡ 3-5µm có thể dùng các cột ngắn (3 - 7,5 cm) và nhỏ (đường kính trong 1 4, 6mm), số đĩa lý thuyết có thể lên đến 100.000 và cột này có hiệu lực rất cao.
e. Detector trong HPLC


21


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Khi pha động chảy qua cột sắc ký với một tốc độ không đổi thì thời gian
lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu, VR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di
chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
VR = t R × Fc
Trong đó:
− VR phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất của pha động, tốc F c là
thể tích pha động trong một đơn vị thời gian;
− tR và VR là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai
đại độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ…
b. Hệ số phân bố K
Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của các chất tan giữa pha động
và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số
phân bố tính theo công thức:
K=

Cs
Cm

Trong đó, Cs và Cm là nồng độ chất tan phân bố ở pha tĩnh và pha động
tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình
của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển nó qua cột. K chỉ phụ thuộc vào:
bản chất của chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
− Nếu K lớn thì tR lớn (pic ra muộn)
− Nếu K nhỏ thì tR nhỏ (pic ra sớm)

K B tR ,B
=
K A tR , A

Để tách riêng hai chất thường chọn α = 1, 05 - 2,0. Nếu α càng lớn thì hai
chất tách nhau càng tốt, α nhỏ hai chất khó tách nhau, nhưng α qua lớn thì thời
gian phân tích sẽ quá dài.
e. Độ phân giải
Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
Rs =

2.( t R , B − t R , A ) 1,18.( t R , B − t R , A )
=
W A + WB
W1 / 2 B + W1 / 2 A

Như vậy Rs phụ thuộc vào:
− Hiệu lực cột
− Thừa số chọn lọc α
− Thừa số dung lượng K’B
− Rs tối ưu ≥ 1, 5
Có thể làm tăng Rs bằng cách:
− Tăng N: Tăng chiều dài cột giảm tốc độ dòng.

23


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

− Tăng K’B: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn


t R2
W12/ 2

Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột.
Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và W (độ rộng pic)
Nếu tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài.

24


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

W (độ rộng pic ở đáy) hay W 1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng nhỏ
thì N càng lớn nhưng W và W1/2 sẽ nhỏ hơn khi tR nhỏ.
Khi tR cố định thì bản chất của cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định
trong đó cột đóng vai trò quan trọng.
Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị độ
dài cột :
N = 16.

t R2
WB2 .L

Khi các điều kiện khác cố định thì cột nào có số đĩa lý thuyết cao hơn cột
đó sẽ có hiệu lực cao hơn.
h. Xác định tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu
T û sè tÝn hiÖu =

H