BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ THU HIỀN

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC MÁU
THEO CON ĐƯỜNG ỨC CHẾ XANTHIN
OXIDASE CỦA TỎA DƯƠNG
(Balanophora laxiflora Hemsl.,Balanophoraceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ THU HIỀN

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC MÁU
THEO CON ĐƯỜNG ỨC CHẾ XANTHIN
OXIDASE CỦA TỎA DƯƠNG
(Balanophora laxiflora Hemsl.,Balanophoraceae)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1. TĂNG ACID URIC MÁU ........................................................................... 3
1.1.1. Sinh chuyển hóa acid uric ...................................................................... 3
1.1.2. Tăng acid uric máu ................................................................................ 5
1.2. XANTHIN OXIDASE VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE .. 8
1.2.1. Xanthin oxidase ...................................................................................... 8
1.2.2. Các chất ức chế xanthin oxidase.......................................................... 13
1.3. TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl., Balanophoraceae) ............ 15
1.3.1. Tên khoa học ........................................................................................ 15
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................. 15
1.3.3. Thành phần hóa học ............................................................................ 16
1.3.4. Công dụng ............................................................................................ 19
1.3.5. Tác dụng dược lý .................................................................................. 19
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................... 21
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ............................................................................ 21
2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .................................................................... 21
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ............................................................... 24
2.2.1. Động vật thí nghiệm.............................................................................. 24
2.2.2. Hóa chất, thuốc thử .............................................................................. 24


2.2.3. Thiết bị .................................................................................................. 24
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 25
2.3.1. Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô

4.2. VỀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA CAO
TOÀN PHẦN, CÁC PHÂN ĐOẠN, CÁC CHẤT TINH KHIẾT CỦA TỎA
DƯƠNG. ................................................................................................... 47
4.2.1. Về cao toàn phần và các phân đoạn của tỏa dương ........................... 47
4.2.2. Về các chất đã phân lập ........................................................................ 48
4.3. VỀ CƠ CHẾ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA BLE1 ..... 49
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 52
1. VỀ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC HUYẾT THANH THỰC NGHIỆM .... 52
2. VỀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO................... 52
3. VỀ CƠ CHẾ ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA BLE1 ..... 52
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ABCG2

: ATP-binding cassette sub-family G member 2

AMP

: Adenosin monophosphat

ATP

: Adenosin triphosphat

BCRP

: Breast cancer resistence protein


: Liều ức chế 50% hoạt độ enzym

IMP

: Inosin monophosphat

LD50

: Liều tối thiểu gây chết 50% động vật thí nghiệm

Na-CMC : Natri carboxymethyl cellulose
NF-κB

: Nuclear factor-kappa-B

OAT

: Organic anion transporter (kênh vận chuyển anion hữu cơ)

PRPP

: Phospho ribosyl pyrophosphat

SCL2A9

: Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9
protein

URAT1


16

2.1

Hàm ẩm và hiệu suất của cao toàn phần và các cao phân đoạn

22

của tỏa dương
2.2

Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng

31

3.1

Ảnh hưởng của cao toàn phần tỏa dương đến nồng độ acid uric

35

huyết thanh chuột nhắt trắng thực nghiệm
3.2

Ảnh hưởng của cao toàn phần tỏa dương lên hoạt độ xanthin

36

oxidase gan chuột nhắt trắng thực nghiệm


Kết quả đo mật độ quang acid uric tạo thành ở các nồng độ

42

xanthin thay đổi
3.8

Các thông số của phương trình Lineweaver - Burk

43


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Công thức cấu tạo của acid uric

3

1.2

Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể


21

2.2

Sơ đồ chiết xuất dược liệu

23

2.3

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

26

2.4

2.5
2.6
3.1
4.1

Quy trình tiến hành thí nghiệm trên mô hình gây tăng acid uric
cấp bằng kali oxonat
Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase
in vitro
Quy trình xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro
Đồ thị Lineweaver - Burk của enzyme xanthin oxidase
khi có mặt và không có mặt BLE1
Sự phụ thuộc của V0 vào nồng độ cơ chất


một dược liệu quý, từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhức
mỏi chân tay, đau bụng, chữa ho, chảy máu tử cung và trĩ, làm thuốc bổ cho
người già, người mới ốm dậy, và phụ nữ sau khi sinh [2]. Một số nghiên cứu đã
cho thấy cao chiết tỏa dương có tác dụng chống oxy hóa tốt. Hơn nữa, các loài
Balanophora còn chứa một lượng lớn các tanin thủy phân và các hợp chất
phenolic [33], [35]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh một số hợp chất phenolic

1


có khả năng ức chế mạnh XO và tác dụng điều trị của các hợp chất này có thể do
khả năng chống oxy hóa và khả năng ức chế enzym này [16], [31], [45]. Gần
đây, nghiên cứu của tác giả Ho S.T và cộng sự về tác dụng ức chế enzym xanthin
oxidase của tỏa dương cho thấy các chất phân lập từ dược liệu này có khả năng
giảm acid uric máu [34]. Để góp phần cung cấp thêm những bằng chứng khoa
học về việc sử dụng tỏa dương như một dược liệu có tiềm năng hạ acid uric máu,
đề tài “Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu theo con đường ức chế xanthin
oxidase của tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl., Balanophoraceae)”
được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau:
1. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh thực nghiệm của cao toàn
phần tỏa dương in vivo
2. Sàng lọc khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro của các phân đoạn
và một số hợp chất phân lập từ tỏa dương.
3. Xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase in vitro của chất có tiềm năng
nhất.

2


Chương 1. TỔNG QUAN

1.1.1.2. Quá trình thải trừ acid uric ra khỏi cơ thể
Thận thải trừ 2/3 lượng acid uric được tạo ra hàng ngày, trong khi 1/3 còn
lại bị phân hủy bởi các vi khuẩn đường ruột và thải trừ qua phân [18], [25], [39],
[64]. Quá trình thải trừ qua thận ảnh hưởng nhiều nhất đến nồng độ acid máu,
với hơn 90% trường hợp tăng acid uric máu là do giảm bài tiết ở thận [37]. Tại
thận, acid uric được lọc qua cầu thận, sau đó được bài tiết, tuy nhiên 90% được
tái hấp thu và quay trở lại máu [21], [24], [64].
Các anion urat đi qua màng tế bào thông qua các kênh vận chuyển đặc
hiệu. SLC22A12 (URAT1) và SLC2A9 (URAT1/GLUT9) là 2 kênh đóng vai trò
chủ yếu đối với sự tái hấp thu acid uric vào máu [23], [46], [51], [77], [78].
SLC2A9 là kênh vận chuyển acid uric quan trọng nhất, có công suất vận chuyển
cao hơn URAT1 nhiều lần [63]. Các kênh SLC22A6 (OAT1), SLC22A8
(OAT3), SLC17A3 (NPT4), ABCC4 (MRP4), và ABCG2 (BCRP) tham gia vào

4


quá trình bài tiết acid uric vào nước tiểu [36], [37], [42], [52], [65]. Vai trò của
các kênh vận chuyển acid uric ở ốn thận được thể hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3. Các kênh vận chuyển acid uric ở ống thận [37]
1.1.2. Tăng acid uric máu
1.1.2.1. Khái niệm tăng acid uric máu
Tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric máu trên 7,0
mg/dL (tức trên 0,42 mmol/L) và trên 6,0 mg/dL (tức trên 0,36 mmol/L) đối với
nữ [21], [62].
1.1.2.2. Nguyên nhân gây tăng acid uric máu
Nguyên nhân gây tăng acid uric máu có thể do tăng sản xuất, giảm thải trừ
acid uric hoặc cả hai [26].
Phân loại nguyên nhân gây tăng acid uric máu theo sinh lý bệnh được thể


Rượu

Chế độ ăn giàu purin

Béo phì
Giảm thải trừ acid uric
Nguyên phát

Nhiễm độ Berili

Tăng năng tuyến cận giáp

Bệnh sarcoid

Giảm năng tuyến giáp

Nhiễm độc chì

Thận đa u nang

Nhiễm độc thai nghén

Đái tháo đường

Hội chứng Bartter

Tăng huyết áp

Hội chứng Down

Các nghiên cứu trước đây hướng đến giả thuyết tăng huyết áp làm tăng
acid uric máu bằng nhiều cơ chế khác nhau, đặc biệt bằng cách tăng tái hấp thu
acid uric tại thận do giảm lượng máu đến thận. Tuy nhiên, các nghiên cứu lâm
sàng và thực nghiệm gần đây chứng minh tăng acid uric có thể dẫn đến tăng
huyết áp. Quan sát trên mô hình động vật thể hiện sự co mạch máu thận qua
trung gian acid uric, nồng độ nitric oxid nội bào giảm, sự hoạt hóa hệ
angiotensin ở thận, các tổn thương do oxy hóa quá mức dẫn đến tăng huyết áp
[53].
 Tăng acid uric máu và bệnh tim mạch
Nồng acid uric máu cao có liên quan đến các biến cố tim mạch, trong đó
acid uric đóng vai trò trung gian. Cơ chế chính xác vẫn chưa rõ ràng, song có thể
do ức chế sự sản xuất nitric oxid, sự kết tập tiểu cầu …[71].
7


1.2.

XANTHIN OXIDASE VÀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE

1.2.1. Xanthin oxidase
1.2.1.1. Phân bố, cấu trúc, cơ chế hoạt động, các thông số động học
 Phân bố
Ở người, XO thường được tìm thấy chủ yếu ở gan và trong máu. XO cũng
được phát hiện trong một số mô của động vật có vú, ở chim, côn trùng, và vi
khuẩn. Ở động vật, XO được tìm thấy trong tế bào gan, tế bào ruột, ngoài ra còn
thấy trong tế bào thận, dạ dày, huyết thanh và phổi, nồng độ thấp thấy ở trong
xương, cơ, tim và não [9].
 Cấu trúc
Xanthin oxidase là một homodimer, khối lượng phân tử 283 – 290 KDa,
gồm hai monomer khối lượng phân tử khoảng 150 – 155 KDa. Mỗi monomer

superoxid và các gốc chứa oxy hoạt động khác (ROS) tham gia vào quá trình
oxy hóa của cơ thể, liên quan đến nhiều quá trình bệnh sinh như: viêm, xơ vữa
động mạch, ung thư, lão hóa …
Truyền tín hiệu: một số nghiên cứu đã chứng minh XO có vai trò kích
thích đại thực bào, tăng cường hoạt hóa adenylyl cyclase, cảm ứng biểu hiện của
c-myc và c-fos ở tế bào JB6 …
9


Chuyển hóa thuốc: XO là một enzym tế bào chất, hỗ trợ cho hệ
cytochrom P450 trong chuyển hóa thuốc [61].
1.2.1.2. Cơ chế ức chế xanthin oxidase
Động học Michaelis - Menten là mô hình động học đơn giản và nổi tiếng
nhất, đưa ra công thức mô tả mối liên quan giữa tốc độ phản ứng enzym và nồng
độ cơ chất. Phương trình Michaelis - Menten như sau:
Vmax.[S]
V0 =

Km + [S]

Dạng đường thẳng của phương trình Michaelis - Menten được sử dụng để
xác định các thông số động học của enzym:
1
V0

Km
=

Vmax.[S]



Vmax

Km

Ức chế cạnh tranh (competitive)

Vmax

αKm

Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive)

Vmax/α’

Km/α’

Ức chế hỗn hợp (mixed)

Vmax/α’

αKm/α’

Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive)

Vmax/α

Km

Cơ chế ức chế được xác định thông qua đồ thị phương trình Lineweaver Burk, là đồ thị hàm số 1/V đối với 1/[S], với sự có mặt và không có mặt chất ức

12


1.2.2. Các chất ức chế xanthin oxidase
1.2.2.1. Allopurinol và Febuxostat


Allopurinol
Allopurinol có cấu trúc tương tự purin, là một chất ức chế cạnh tranh

xanthin oxidase, được FDA cấp phép phê duyệt năm 1966 để điều trị gout và là
một chất quan trọng trong điều trị tăng acid uric máu tiên phát và thứ phát [43].
Các tác dụng không mong muốn của allopurinol như: kích ứng đường tiêu
hóa, ban da, phản ứng quá mẫn, hội chứng Steven-Johnson’s. Allopurinol được
yêu cầu giảm liều ở bệnh nhân suy thận. Tương tác thuốc cũng là một giới hạn
trong việc sử dụng allopurinol. Mức độ ban da tăng khi sử dụng allopurinol cùng
với ampicillin hoặc amoxicillin. Sử dụng allopurinol cùng vơi theophillin hoặc
warfarin sẽ gây ra độc tính trên bệnh nhân [68].
 Febuxostat
Febuxostat là chất có cấu trúc không tương tự purin, được sử dụng ở bệnh
nhân bị gút không dung nạp hoặc không đáp ứng với allopurinol, được cấp phép
lần đầu tiên năm 2009 và bị chuyển hóa tại gan. Febuxostat hiệu quả hơn
allopurinol trên bệnh nhân suy giảm chức năng thận nhẹ và vừa khi sử dụng ở
liều thông thường, ít tương tác thuốc hơn, dung nạp tốt hơn trên bệnh nhân quá
mẫn với allopurinol. Tuy nhiên, một số thử nghiệm lâm sàng gần đây quan sát
thấy các biến cố tim mạch gặp nhiều hơn ở các bệnh nhân sử dụng febuxostat so
với allopurinol. Giá thành cao cũng là một hạn chế trong sử dụng febuxostat
[68].
1.2.2.2. Các chất ức chế xanthin oxidase có nguồn gốc tự nhiên
Gupta và cộng sự đã đánh giá tác dụng ức chế XO của dịch chiết ethanol

flavonoid trong cây [74]. Jiao và cộng sự đã phân lập được một dẫn xuất mới của
apigenin trong dịch chiết ethanol của Palhinhaea cernua, cấu trúc được xác định
là apigenin-4’-O-(2’’-O-p-coumaryl)-β-D-glucopropanosid. Chất này thể hiện
tác dụng ức chế XO tốt [38]. Wang và cộng sự đã chứng minh tác dụng ức chế
XO tốt của tinh dầu từ lá của Cinnamomum osmophloeum (Lauraceae) do
cinnamaldehyd - thành phần chính trong tinh dầu mang lại [79].
Trong các flavonoid được tìm thấy ở thực vật, apigenin có tác dụng mạnh
nhất., quercetin, myricetin, và genistein có tác dụng ức chế XO tốt theo cơ chế
cạnh tranh [47], [76]. Các nghiên cứu sâu hơn về mối liên quan giữa cấu trúc tác
dụng của các flavonoid cũng được tiến hành [19], [20]. Các dẫn xuất coumarin
được chứng minh ức chế XO mạnh, đặc biệt là esculein (IC50 = 8,2 µM) và 4methylesculein. Hai hợp chất này chứa các nhóm hydroxyl ở vị trí số 6 và 7 [28],
14


[48]. Silva và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất có tác dụng thu
dọn gốc tự do silibinin và benzadac lên hoạt tính XO. Silibinin ức chế cả 3 dạng
của enzym (XDH, XO thuận nghịch và XO không thuận nghịch), trong khi
benzadac ức chế chọn lọc XO [70]. Acid phytic - một phân tử dễ bị phosphoryl
hóa, có nhiều ở trong cây, chiếm 1 - 5% khối lượng của rau ăn, ngũ cốc, và hạt;
acid reductic - một chất có cấu trúc tương tự như acid ascorbic được chứng mình
có tác dụng ức chế XO [50], [55].
1.3. TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl., Balanophoraceae)
1.3.1. Tên khoa học
Tỏa dương còn có tên khác là nấm đất (dó đất, cu chó, dó đất hoa thưa)
Tên khoa học: Balanophora laxiflora Hemsl., thuộc họ Dó đất
(Balanophoraceae) [1], [2], [3].
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây cỏ mập, sống kí sinh trên rễ, màu nâu đỏ, cao 10 - 20 cm, không có
diệp lục. “Củ” hình trứng, đường kính 2 - 2,5 cm, bề mặt sần sùi và có mụn hình
sao nổi rõ. Thân khí sinh (là cuống cụm hoa) mang 5 - 10 lá dạng vảy ở phía

(7’S, 8R, 8’R)-9-Ogalloyllariciresinol-4’-Oβ-D-glucopyranosid

2

6’-O-(E)-caffeoyl
coniferin

3

coniferin

4

Lariciresinol-4’-O-β-Dglucopyranosid

16