BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHAN THỊ ANH THƯ
ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC
THỰC NGHIỆM CỦA MÁN ĐỈA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHAN THỊ ANH THƯ
Xin cám ơn những người bạn đã và đang cùng nghiên cứu khoa học tại Bộ
môn Dược lực, những người luôn động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn
thành khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và người thân, những người luôn bên cạnh
và ủng hộ hết lòng, là nguồn cổ vũ tinh thần lớn lao đối với tôi trong thời gian thực
hiện khóa luận này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên Phan Thị Anh Thư
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về tăng acid uric máu 2
1.1.1. Định nghĩa 2
1.1.2. Nguyên nhân gây tăng acid uric máu 2
1.1.3. Hậu quả của tăng acid uric máu 5
1.1.4. Điều trị tăng acid uric máu 6
4.1. Về ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh
trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat 34
4.2. Về cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của cao toàn phần mán đỉa
36
4.2.1. Về ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan
chuột thí nghiệm 36
4.2.2. Về ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột
thí nghiệm 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALT : Alanine aminotransferase
CMC-Na : Natri carboxymethyl cellulose
DHBV : Duck hepatitis B virus (virus viêm gan B vịt)
DL/kg : Dược liệu/kg
ED
50
: Mức liều đạt 50% đáp ứng
EDTA : Ethylendiamintetraacetic acid
Tên bảng
Trang
1
1.1
Một số hợp chất có trong dược liệu mán đỉa
12
2
3.1
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng
độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp
bằng kali oxonat
26
3
3.2
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ
xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
28
4
3.3
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến thể tích
nước tiểu chuột thí nghiệm
29
5
3.4
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến pH
nước tiểu chuột thí nghiệm
30
6
3.5
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng
2.3
Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn
phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô
hình gây tăng cấp bằng kali oxonat
19
6
2.4
Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn
phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí
nghiệm
21
7
2.5
Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn
phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí
nghiệm
23
8
3.1
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid
uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp bằng kali
oxonat
26
9
3.2
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ
xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
28
10
3.3
enzym tham gia vào quá trình tạo thành acid uric trong cơ thể - đích tác dụng của
nhiều thuốc làm hạ acid uric máu hiện nay, của 91 mẫu dược liệu Việt Nam. Kết quả
cho thấy, trong 91 mẫu nghiên cứu mán đỉa là dược liệu có tác dụng tốt nhất. Cao
toàn phần cũng như một số phân đoạn và chất tinh khiết phân lập được từ mán đỉa
đều thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro tương đối mạnh [14]. Tác dụng
ức chế xanthin oxidase in vitro tốt mở ra khả năng mán đỉa có thể làm hạ acid uric.
Để tiếp tục đánh giá tác dụng hạ acid uric của mán đỉa trên động vật thí nghiệm nhằm
góp phần đưa dược liệu này vào ứng dụng trong thực tế điều trị, đề tài “Đánh giá tác
dụng hạ acid uric thực nghiệm của mán đỉa” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh in vivo của dược liệu mán đỉa.
2. Xác định cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của dược liệu mán đỉa.
2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về tăng acid uric máu
1.1.1. Định nghĩa
Acid uric là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của các hợp chất nhân purin trong
cơ thể người. Đây một acid yếu với pKa là 5,75 và 10,3. Trong huyết thanh, dịch
ngoại bào và dịch khớp, 98% acid uric tồn tại dưới dạng muối mononatri urat ở pH
7,4. Nồng độ urat bão hòa trong huyết thanh là 6,8 mg/dL (405 µmol/L) ở 37
o
C [48].
Tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric huyết thanh cao hơn khoảng
2 lần độ lệch chuẩn so với nồng độ acid uric trung bình của người khỏe mạnh (tùy
theo lứa tuổi và giới tính), thường là 7 mg/dL (416 μmol/L) ở nam và 6 mg/dL (357
μmol/L) ở nữ [23].
1.1.2. Nguyên nhân gây tăng acid uric máu
Nồng độ acid uric được giữ ở mức sinh lý bình thường do có sự cân bằng giữa
quá trình hình thành và đào thải. Khi có bất thường xảy ra trong cơ thể hoặc do nguyên
[1], [23], [48].
Mặc dù nguyên nhân gây tăng sinh acid uric là từ nguồn purin hoặc các enzym
như PRPP synthetase hoặc HGPRT, hiện nay để ức chế hình thành acid uric đích tác
dụng mà nhiều thuốc hướng đến là enzym xanthin oxidase. Xanthin oxidase có nhiều
ở gan và ruột, là enzym chủ chốt xúc tác cho những bước cuối cùng tạo acid uric [28].
Việc ức chế xanthin oxidase có thể làm giảm sản xuất acid uric mà không phụ thuộc
vào nguyên nhân gây tăng acid uric.
1.1.2.2. Quá trình giảm thải trừ acid uric
Thận là cơ quan đóng vai trò chủ yếu trong đào thải acid uric. Sự thải trừ acid
uric phụ thuộc vào 4 quá trình: lọc ở cầu thận, bài tiết, tái hấp thu và bài tiết sau khi
đã tái hấp thu ở ống thận. Acid uric bị ứ đọng trong cơ thể có thể do giảm mức độ lọc
cầu thận, giảm bài tiết hoặc tăng tái hấp thu, trong đó, nguyên nhân liên quan đến quá
trình tái hấp thu thường được nhắc tới nhiều nhất [23], [48]. Các tác nhân làm tăng
tái hấp thu acid uric ở ống thận gồm có: tình trạng béo phì, kháng insulin, rối loạn
lipid máu hoặc sử dụng các loại thuốc như: thuốc lợi tiểu, salicylat liều thấp, acid
nicotinic,…Các tác nhân này chủ yếu làm tăng tái hấp thu acid uric do tác động đến
các kênh vận chuyển anion hữu cơ (Organic anion transporter - OAT) ở ống thận
[34], [48], [60]. Hệ vận chuyển anion hữu cơ ở ống thận và một số thuốc liên quan
đến thải trừ urat được minh họa trong hình 1.2.
5
Hình 1.2. Hệ vận chuyển urat tại tế bào ống thận [60]
Acid uric bị giảm đào thải cũng có thể do bệnh nhân mắc một số bệnh về thận
như suy giảm chức năng thận, bệnh thận mạn tính [1], [48].
Ngoài các nguyên nhân chỉ làm tăng sinh hoặc giảm thải trừ acid uric còn có
những yếu tố ảnh hưởng tới cả 2 quá trình trên như: rượu, sốc, chứng suy giảm
glucose-6-phosphatase hoặc giảm fructose-1-phosphate aldolase [48].
1.1.3. Hậu quả của tăng acid uric máu
Xanthin oxidase là phức hợp molybdoflavoenzyme, xúc tác cho 2 bước cuối
cùng trong chu trình chuyển hóa purin là quá trình hydroxyl hóa hypoxanthine thành
xanthine và xanthine thành acid uric [28]. Các thuốc ức chế enzym xanthin oxidase
ngăn cản sự hình thành acid uric ở giai đoạn cuối, có tác dụng trên bệnh nhân bị tăng
acid uric do bất kỳ nguyên nhân nào, được lựa chọn hàng đầu hiện nay để điều trị
tăng acid uric máu và gút mạn tính [40], [76]. Các thuốc được sử dụng trên lâm sàng:
allopurinol và febuxostat [40], [53].
▪ Allopurinol
Allopurinol ức chế enzym xanthin oxidase theo cơ chế ức chế cạnh tranh ở
nồng độ thấp và không cạnh tranh ở nồng độ cao. Chất chuyển hóa chính của
allopurinol là oxypurinol cũng ức chế không cạnh tranh với xanthin oxidase [19].
Thuốc được sử dụng chủ yếu để điều trị tăng acid uric máu và nước tiểu trong gút
7 nguyên phát và thứ phát, tăng acid uric máu do dùng hóa trị liệu và bệnh sỏi canxi
oxalat niệu tái phát [15]. Tác dụng không mong muốn nguy hiểm nhất có thể gặp phải
khi dùng allopurinol là phản ứng dị ứng nghiêm trọng (hội chứng Stevens-Johnson,
phản ứng trên da và toàn thân) dẫn đến tử vong [40]. Các tác dụng không mong muốn
khác gồm: độc tính trên gan gây tăng transaminase trong máu, tác động lên thần kinh
trung ương gây chóng mặt, mất tỉnh táo, có thể làm tăng tần số bị cơn gút cấp trong
6-12 tháng đầu điều trị [15].
▪ Febuxostat
Febuxostat tạo phức hợp bền vững với cả dạng oxy hóa và dạng khử của
xanthin oxidase, do đó ức chế hoạt động của enzym [19]. Thuốc được FDA phê duyệt
để điều trị tăng acid uric ở bệnh nhân gút năm 2009 [53] nhưng không được sử dụng
để điều trị tăng acid uric không triệu chứng [15], [19]. Tác dụng không mong muốn:
có thể làm xuất hiện cơn gút cấp khi bắt đầu điều trị, buồn nôn, đau khớp, mẩn đỏ,
rối loạn chức năng gan… [15].
○ Các thuốc làm tăng thải trừ urat qua thận
vật, có tác dụng kích thích chuyển acid uric thành allantoin dễ tan khiến nồng độ acid
uric máu hạ xuống. Thuốc đại diện cho nhóm là pegloticase, được FDA phê duyệt
năm 2010 để điều trị gút mạn tính không đáp ứng với các thuốc hạ acid uric khác
[53]. Ngoài ra còn có rasburicase dùng để kiểm soát nồng độ acid uric ở những bệnh
nhân ung thư đang điều trị bằng hóa trị liệu [15], [53].
1.1.4.2. Các dược liệu và bài thuốc từ dược liệu
○ Các dược liệu và bài thuốc được sử dụng để điều trị thống phong
Tình trạng tăng acid uric máu không có chứng bệnh tương ứng trong Đông y,
tuy nhiên, bệnh gút, căn bệnh có nguyên nhân trực tiếp do tăng acid uric thì được xếp
vào chứng tý, được gọi là bệnh thống phong và được điều trị bằng nhiều vị thuốc và
bài thuốc khác nhau [4].
▪ Các vị thuốc điều trị thống phong
Theo lý luận y học phương Đông, để điều trị thống phong cần sử dụng các vị
thuốc thuộc các nhóm như: tán hàn (can khương, quế nhục, phụ tử…), trừ thấp (độc
hoạt, tang ký sinh, sa kê, ngưu tất, hy thiêm, thương truật, ý dĩ, phục linh, tỳ giải…)
và hoạt huyết, bổ huyết (đương quy, xuyên khung…) [3], [4].
9 ▪ Các bài thuốc điều trị thống phong
Các vị thuốc trên được phối hợp thành các bài thuốc khác nhau, được sử dụng
tùy theo thể bệnh thống phong: Độc hoạt tang ký sinh gia giảm và Ngũ tích tán gia
giảm được dùng để trị bệnh thể hàn tý, Ý dĩ nhân thang gia giảm dùng để trị bệnh thể
thấp tý, Bạch hổ quế chi thang gia vị dùng để trị bệnh thể lịch tiết phong… [3], [4].
○ Một số dược liệu và bài thuốc đã được đánh giá tác dụng và cơ chế hạ acid uric
Nhiều dược liệu và bài thuốc từ dược liệu đã được đánh giá tác dụng và xác
định cơ chế hạ acid uric máu theo 2 hướng chính: ức chế xanthin oxidase và làm tăng
thải trừ urat qua thận.
▪ Một số dược liệu và bài thuốc có tác dụng ức chế xanthin oxidase
Các nghiên cứu trên động vật đã chứng minh nhiều dược liệu có tác dụng hạ
của nước này như Shuang Qi (chứa long não, tam thất) [41], Simiao (chứa thương
truật, hoàng bá, ý dĩ, ngưu tất) [29], Wuling san (chứa trạch tả, bạch truật, quế nhục,
phục linh) [22], Xie Zhuo Chu Bi Fang (chứa thổ phục linh, ngưu tất) [65] thể hiện
tác dụng làm hạ acid uric huyết thanh chuột nhắt. Cơ chế hạ acid uric của các bài
thuốc trên được xác đinh là làm tăng thải trừ urat thông qua tác động lên các yếu tố
liên quan đến hệ vận chuyển ion ở ống thận.
▪ Một số bài thuốc vừa ức chế xanthin oxidase vừa làm tăng thải trừ urat qua thận
Trong 2 nghiên cứu được công bố năm 2010 và 2012 tiến hành trên chuột bị
gây tăng acid uric mạn bằng kali oxonat, 2 bài thuốc của Trung Quốc là Simiao gia
giảm (chứa hoàng bá, ý dĩ, ngưu tất, phấn tỳ giải, tri mẫu) [32] và Sanmiao (chứa
hoàng bá, thương truật, ngưu tất) [69] làm hạ acid uric máu theo cả 2 cơ chế: ức chế
xanthin oxidase và làm tăng thải trừ urat qua thận trên chuột nhắt trắng. Cả 2 bài
thuốc đều làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh và hoạt độ xanthin oxidase gan
chuột, làm tăng nồng độ acid uric nước tiểu 24 giờ và hệ số thải trừ urat của chuột
khi so sánh với lô chứng.
1.2. Tổng quan về dược liệu mán đỉa
1.2.1. Tên gọi và phân loại
○ Tên gọi
Tên khoa học: Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen [72].
Tên khác: Pithecellobium clypearia (Jack) Benth, Pithecellobium angulatum
Bentham, Inga clypearia Jack, Abarema angulata (Bentham) Kostermans [6], [72].
Tên thường gọi: mán đỉa, giác, khét, hông linh, lim sẹt, ràng ràng [6].
11 ○ Phân loại
Loài mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen) thuộc chi
Archidendron, họ Đậu (Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), phân lớp Hoa hồng (Rosidae),
ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [5].
1.2.2. Đặc điểm thực vật
TLTK
Flavonoid
7-O-galloyltricetiflavan
[11], [46]
7,4′-di-O-galloyltricetiflavan
[37], [46]
(−)-5,7,3′,4′,5′-pentahydroxyflavan
[18]
(−)-epigallocatechin-7-gallat
(+)-3,5,3',4',5'-pentahydroxyflavan-7-gallat
[37]
(−)-5,3',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallat
(2R,3R)-7-O-galloylplumbocatechin
5-hydroxy-3,7,3',4'-tetramethoxyflavon
[71]
5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavon
Luteolin (5,7,3',4'-tetrahydroxyflavon)
Fisetin (3,7,3′,4′-tetrahydroxyflavon)
[49]
Robinetin (3,7,3',4',5'-pentahydroxyflavon)
Quercetin (3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavon)
[45], [73]
Luteolin-7-O-β-D-glucopyranosid
[71]
Myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid
[18]
Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid
[11], [18]
Polyphenol
nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2009 [18]. Nghiên cứu của Yang và cộng sự năm 2012
và 2013 cũng cho thấy dịch chiết methanol của mán đỉa có tác dụng chống viêm tốt
trên mô hình gây viêm ruột kết bằng dextran natri sulfat và gây viêm dạ dày bằng
ethanol/HCl ở chuột nhắt. Cơ chế chống viêm của mán đỉa được chứng minh là có
liên quan đến các yếu tố tham gia vào quá trình dịch mã tạo ra các enzym và chất
trung gian hóa học trong phản ứng viêm [73], [74].
▪ Tác dụng kháng virus
Các nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy dịch chiết mán đỉa trong các dung
môi khác nhau và một số hợp chất flavonoid phân lập được từ dịch chiết có tác dụng
kháng virus cúm H1N1 [37], [46], virus đường hô hấp (RSV), virus herpes (HSV-1)
ở người [46] và virus viêm gan B ở vịt (DHBV) [44].
▪ Tác dụng bảo vệ gan
Mán đỉa có tác dụng làm giảm nồng độ ALT trong máu chuột trên mô hình
gây viêm gan bằng lipopolysaccharid của Propionibacterium acnes và paracetamol
theo 2 nghiên cứu năm 2009 và 2013 [11], [18].
▪ Tác dụng chống oxy hóa
Nguyễn Thị Hoài và cộng sự đã sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro của
một số cây thuốc của đồng bào Pako - Vân Kiều ở Quảng Trị và nhận thấy mán đỉa
có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với ED
50
của cao toàn phần là 2,18 µg/mL [9].
Nguyễn Khánh Thùy Linh tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các phân
14 đoạn mán đỉa và thu được kết quả phân đoạn ethyl acetat có tác dụng chống oxy hóa
mạnh nhất với ED
50
là 0,63 µg/mL [11].
▪ Tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro
2.1. Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1.1. Dược liệu nghiên cứu
Dược liệu nghiên cứu là cành lá của cây mán đỉa (Archidendron clypearia
(Jack) I.C.Nielsen) được thu hái tại Mê Linh, Hà Nội tháng 1 năm 2014.
Mẫu dược liệu được TS. Trần Thế Bách, phòng Thực vật, Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam xác định tên
khoa học.
Mẫu tiêu bản cây được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện
Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1. Ảnh chụp tiêu bản cành lá mán đỉa
(Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen, Fabaceae)
16 2.1.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Sau khi thu hái, dược liệu được làm sạch, sấy khô, xay thô. Bột dược liệu được
ngâm với dung môi methanol trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Lặp lại 3 lần.
Dịch chiết 3 lần được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách
thủy đến cao đặc. Sau khi điều chế, cao dược liệu được bảo quản ở nhiệt độ 0 - 4
o
C.
Hàm ẩm dược liệu là 4,94%. Hiệu suất chiết cao là 37,26%.
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, cân nặng từ 18-22g, khỏe mạnh do
Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp.
Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày
trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện
- Tủ ấm điều nhiệt (Memmert).
- Các dụng cụ sử dụng để pha thuốc, lấy mẫu và xét nghiệm: micropipet và
đầu côn tương ứng, ống microtube, dụng cụ thủy tinh, chày, cối sứ, mao quản, bơm
kim tiêm, ống nghiệm các loại.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài được thiết kế với các nội
dung tiến hành như sau:
- Thực hiện mục tiêu 1: Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa với
các mức liều khác nhau đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid
uric cấp bằng kali oxonat.
- Thực hiện mục tiêu 2: Xác định sơ bộ cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in
vivo của cao toàn phần mán đỉa trên thực nghiệm thông qua:
+ Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase
gan chuột thí nghiệm.
+ Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận
chuột thí nghiệm.
Copyright: Tài liệu đại học ©