Chơng trình nghiên cứu khoa học cơ bản
bộ khoa học và công nghệ

báo cáo kết quả nghiên cứu

Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất hoá học, dợc lý
học hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng v
kháng nấm bệnh của quả cây du trà (Camellia (Sp.)
họ Theaceae) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản,
thuốc phụ khoa góp phần phục vụ mục đích bảo vệ
sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ
Mã số đề tài: 511402
Giai đoạn: 2002-2005
Thuộc chơng trình nghiên cứu KHCBNN
Chủ nhiệm đề tài: GS. TSKH. Phạm Trơng Thị Thọ

6126
29/9/2006

hà nội - 2006


Cán bộ tham gia đề tài 511402
STT
Họ và tên
1
Phạm Trơng Thị Thọ

Học vị
Cơ quan
GS.TSKH Viện dợc liệu

sản
Viện da liễu TW
Thử kháng
nấm
ĐHSP Hà Nội
Đào tạo sinh
viên, thạc sỹ
ĐHBK Hà Nội
Trung tâm KHTN Nghiên cứu
và CN quốc gia
hoá học



2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Đinh Thị Thuyết
Nguyễn Kim Bích

Bác sỹ

16
17
18

Lê Thị Anh Đào
Nguyễn Minh Tú
Trần Văn Lộc

PGS. TS
TS
ThS

19
20

Đào Đức Thiện
Dơng Ngọc Tú

Cử nhân
TS


Mục lục
Số
TT
1
2
3

D. Các tiêu chuẩn cơ sở
- Nguyên liệu
- Hoạt chất Sf
- Thẩm định tiêu chuẩn hoạt chất Sf của viện kiểm nghiệm quốc
gia
E. Các tài liệu khác
- Thông báo cục sở hữu trí tuệ chấp nhận đơn đăng ký sáng chế
- Nhận xét của các phản biện
- Giấy xác nhận hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản.
Mã số 511402 của bộ khoa học và công nghệ
- Giấy xác nhận hợp tác của công ty dợc Hậu Giang
Kết luận Lời cảm ơn
Các tài liệu tham khảo
Phần phụ lục
Bìa sách 101 cây thuốc với sức khoẻ sinh sản phụ nữ NXB
KHKT 2001
Bài báo thứ nhất Contribution to the study on chemistry and
biological activity of Saponin extracted from the seed of Du Tra
tree growing in Vietnam
10th Asian Chemical Congress, 10 ACC
8th Eurasia Conference on Chemical Sciences Eu As C2S 8
Luận văn sinh viên Phạm Quang Huy. ĐHSP 6/2003: Bớc
đầu tìm điều kiện tối u để tách saponin từ cây Sở dầu
(Camellia oleifera Abel). Bảo vệ ngày 10/6/2003 tại ĐHSP HN
đạt xuất sắc
Luận văn Thạc sĩ ĐInh Ngọc Thức, ĐHSP tháng 11 năm 2003:
Bớc đầu nghiên cứu một số thành phần hoá học cây Sở Dỗu
Nghệ An (Camellia drupifera (Lour) Pierre. Bảo vệ ngày
10/11/2003 tại ĐHSP HN đạt loại giỏi
The biological subsstance extracted from Camellia sp. growing


16

21

Tác dụng hoạt chất Sf từ 1 loài Camellia (sp.) lên tinh trùng
ngời
Những vấn đề nghiên cứu cơ bản ttrong khoa học sự sống
Hội nghị toàn quốc 2004 28.10.2004 Học viện Quân Y
Bản số liệu gốc phân tích tinh dịch. Thử tác dụng Sf (test in
vitro)
Phân tích tinh dịch; so sánh với tác dụng của nớc muối sinh lý;
tinh dịch + nớc muối sinh lý; tinh dịch + nớc muối sinh lý
+hoạt chất
Study of spermicical effect in vitro on human spermatozoa and
in vivo á locally applied in the vagina of rat and reproductive
toxicity of the active product Sf extracted from Camellia sp.
Theacea growing in Vietnam
RSCE 2005 (Regional Symposium on Chemical Engineering)
New Trends in Technology Towards Subtainable Development
Proceedings, November 30 December 2, 2005 pp 346-353
Nghiên cứu tác dụng diệt tinh trùng và độc tính sinh sản của
hoạt chất Sf tách đợc từ quả Du Trà Camellia sp. họ Theacea
mọc ở Việt nam
Báo cáo Hội nghị KHCN kỷ niệm 45 năm ngày thành lập Viện
Dợc Liệu 1961-2006
Kết quả thử LD50 của hoạt chất Sf suy ra dợc liệu

22


24

64- 68

69- 85
86- 118
119128

129132

133135
136141
142
143144
145149
150162
168173
174178


Lời nói đầu
I. Giới thiệu vấn đề
Cho đến nay, đã có nhiều tài liệu giới thiệu cây thuốc Việt Nam dới nhiều
hình thức phong phú và sinh động. Song, cha có tài liệu nào đề cập riêng đến các
cây thuốc có tác dụng hạn chế sinh sản một cách có hệ thống theo kinh nghiệm
dân gian và trên cơ sở nghiên cứu khoa học và cũng cho đến nay cha có một
dạng thuốc hạn chế sinh sản nào thích hợp, đợc bào chế từ nguồn dợc liệu sẵn
có trong nớc.
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu đề tài "Sàng lọc cây thuốc có tác dụng kế
hoạch hoá gia đình" của Uỷ ban Quốc gia dân số kế hoạch hoá gia đình - năm

nào giới thiệu rõ và chứng minh đầy đủ tác dụng hạn chế sinh sản của nó.
Chính vì vậy, chúng tôi đã đề xuất đề tài:"Chiết xuất hoá học, dợc lý học
hoạt chất có tác dụng diệt tinh trùng và kháng nấm bệnh của quả cây Dutrà (một
loài Camellia- Họ Theaceac) nhằm làm thuốc hạn chế sinh sản, thuốc phụ khoa,
góp phần phục vụ mục đích bảo vệ sức khoẻ sinh sản phụ nữ & KHHGĐ.
Đề tài thuộc chơng trình nghiên cứu KHCBNN - Hớng khoa học tự nhiên
Mã số đề tài 511402 - giai đoạn 2002 - 2005
Đề tài khoa học cơ bản nêu trên đã đợc Hội đồng khoa học ngành Hoá học,
Hội đồng khoa học tự nhiên đánh giá kết quả thực hiện loại : Đạt

2


II. Các kết qủa nghiên cứu
A- Những nghiên cứu về hoá học
1- Phân tích sàn lọc sơ bộ hoá thực vật bã khô dầu Dutrà
Dùng các phản ứng định tính với các thuốc thử đặc hiệu để xác định các
nhóm chất hoá học có trong bã khô dầu quả Dutrà. Kết quả ghi ra ở bảng.
Bảng1: Các nhóm chất hoá học trong bã khô sở
Nhóm chất

Thuốc thử

Kết quả

Ankaloit

Dragendoff

Flavonoit


-

++
-

Kết quả thử định tính cho thấy trong bã khô sở Dutrà có chứa chủ yếu là
Saponin, Flavonoit, Tanin.
2- Sơ đồ chiết bã khô Dutrà theo độ phân cực của dung môi.
Bã khô dầu
Dutrà

n-hexan

CHCl3

MeOH

Phân đoạn 1

Phân đoạn 2

Phân đoạn 3

a/ Khảo sát phân đoạn1: Phân đoạn n-hexan này có chứa nhiều lipít và
nhiều axít béo tự do: Dung dịch làm mất màu nớc Brôm, chứng tỏ trong dịch
chiết có các axít béo không no, điều đó phù hợp với các tài liệu về dầu sở là các
gluxrít của axít oleic, linoléic, stearic.
b/ Khảo sát phân đoạn 2 (CHCL3): Phân đoạn 2 đợc xử lý qua sắc kí cột
SiO2. Hệ dung môi theo tỉ lệ tăng cực dần. ở phân đoạn thứ 19, Hệ dung môi

chống hoại tử do nọc rắn độc gây ra.
(Phụ lục số 15 trang 60 - 63)
c/ Khảo sát phân đoạn 3: Phân đoạn MeOH.
Phân đoạn 3 đợc xử lý nh sau:
Dung dịch MeOH thu hồi MeOH cặn còn lại hoà tan với Butanol bão
hoà nớc cất dung môi đến cạn hoà tan lại bằng MeOH rửa bằng axêton
: ête (5:1) thu đợc hỗn hợp Saponin tinh chế saponin sạch ký hiệu S3.
* Các phản ứng đặc trng của Saponin (S3) chiết xuất từ bã Dutrà
1/ Phân biệt hai loại Saponin: Tritecpen và Steroit.

- Hoà tan 5 mg chất S3 trong 5ml cồn loãng vào 2 ống nghiệm cao 25 cm.
ống thứ 1 độ pH = 13, ống thứ 2 độ pH = 1.
- Lắc mạnh 2 ống nghiệm nh nhau trong 1 phút - Bọt nhiều và bền vững ở
ống thứ 2 (môi trờng axit) chứng tỏ - saponin là loại Saponin tritecpen
2/ Chỉ số bọt: Chỉ số bọt của Saponin đợc tính theo công thức :
Chỉ số bọt =
A: biểu thị nồng độ nhỏ nhất của dịch chiết tính bằng g/ml để cho lớp bọt
bền, không mất sau 1 phút.
Kết quả chỉ số bọt của S3 là :

1
1
=
x10 3 571
A 1,75
3/ Vòng phá huyết: Đây là phần ứng đặc trng của Saponin đờng kính

vòng phá huyết tỉ lệ với nồng độ Saponin

5

cứu cơ bản phải thực hiện đến mức tối đa có thể. Song, trong thực tế, tuỳ loại
thuốc, ngời ta thờng chiết không phải đơn chất mà là hỗn hợp hoạt chất, để hiệu
suất cao tác dụng hiệp đồng và hiệu quả kinh tế cao.
- Trên cơ sở đó chúng tôi đã xây dựng quy trình chiết tách hỗn hợp Saponin flavonoil ("Sf") từ bã Dutrà.
6/ Qui trình chiết tách hỗn hợp Saponin - Flavonoit "Sf" từ bã khô dầu
Bã khô dầu đã xay

Dutrà.

Loại lipít bằng n-hexan
Bã nguyên liệu đã loại lipit
Chiết bằng MeOH
Dịch MeOH
Cô quay chân không
Dịch đặc MeOH
Hoà tan với nBuOH bão hoà nớc
Dịch nBuOH-H2O
Cất quay chân không
Cao n-BuOH
Hoà lại với MeOH
Dịch MeOH
Cất quay chân không
Dịch đặc MeOH
Tủa với axêton: etê (5:1)
Hỗn hợp thô "Sf"
Tinh chế
Hoạt chất "Sf" sạch
7



Sau thủy phân

Trớc thủy phân

Sắc kí đó cho thấy có thể có từ 5 -8 Sapogenin Đối chứng là oléanolic acid)
Kết quả sắc ký trên cho thấy hỗn hợp hoạt chất "Sf" chứa hai nhóm chất
riêng lẻ đi kèm theo nhau: nhóm Sapogenin và nhóm flavonoit. Mỗi nhóm có thế
chứa từ 2 - 3 chất. Từ nhóm flavonoit đã tách riêng đợc một chất. Đó là
kaemferol. Thành phần hóa học nhóm Saponin và nhóm flavonoit còn lại đang
tiếp tục nghiên cứu trong công trình thạc sĩ vào cuối năm 2006.

9


B- Những nghiên cứu dợc lý
I- Tác dụng của hoạt chất Sf lên tinh trùng ngời (test invitro)
(thực hiện tại Bệnh viện Phụ sản Trung Ương)

Mục đích của thí nghiệm là xác định xem ở nồng độ nào khoảng thời gian nào
thích hợp để hoạt chất Sf ức chế đợc tinh trùng, làm cho tinh trùng không tiến
tới nhanh, dừng lại tại chỗ, không hoạt đọng đợc và chết. Điều đó bảo đảm
tinh trùng không còn khả năng tiếp cận đợc với trứng, không còn khả năng
gây thụ thai.
1- Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu
a/ Hoạt chất Sf: Hoạt chất Sf chích đợc từ bã khô dầu quả cây Du trà (Camillia
(Sf)- họ Theaceae)có tinh thể vô định hình màu nâu nhạt với các chỉ tiêu chất lợng
xác định.
b/ Tinh trùng: tinh trùng đợc lấy từ 17 ngời đàn ông khoẻ mạnh bình thờng,
đợc sử lý và thí nghiệm theo tài liệu của tổ chức Y tế Thế giới (WHO)
c/ Phơng pháp tiến hành: lấy hoạt chất Sf pha loãng với nớc muối sinh lý thành

Bài toán đa về tính toán 2 (phơng sai),
theo trị trung bình tác dụng .

c- Kết quả tính toán: chọn 2 chỉ tiêu ra 2 mức độ có tác dụng quyết định để iiii
1-chỉ tiêu tỉ lệ sống của tinh trùng (%)
2-chỉ tiêu tinh trùng tiến tới nhanh
ở mức độ A: tinh trùng tìm tới nhanh %
ở mức độ D: tinh trùng di dộng tại chỗ %
Mọi cá thể đợc quan sát 2 lần:
Lần thứ 1: không dùng hoạt chất Sf
Lần thứ 2: thí nghiệm với hoạt chất Sf ở các nồng độ 1, nồng độ 3, sau 1 phút,
5 phút.
-Giá trị chỉ tiêu student t tính toán đợc, sẽ so sánh với giá trị t tra bảng ứng với bậc
tự do (n-1)
-Tất cả các kết quả tính toán chỉ tiêu student của các quà trình nghiên cứu, thí
nghiêm so với t tra bảng đợc ghi vào bảng 4.
Bảng 4: kết quả tính toán chỉ tiêu student của các quá trình nghiên cứu thí
nghiệm so với t tra bảng.
Nng
Thi gian tỏc dng
Ch tiờu S: T l sng ca tinh trựng (%0
Ch tiờu 2: Tinh trựng tin ti nhanh (%)
Mc A: Tinh trựng tin ti nhanh (%)
Mc D: Tinh trựng di ng ti ch (%)
Vi bc t do n-1 = 14
Ngýng sai
é tin cy
t tra bng

1

t=4,33

t=12,77
t=12,50

P=0,001
99,9%
t=4,140

Từ các kết quả tính toán theo các chất liệu và mức độ cụ thể (bảng 4) thấy rằng giá
trị tuyệt đối các tét t của các quá trình tính toán thí nghiệm đều lớn hơn giá trị các t
tra bảng, chứng tỏ sự khác biệt có ý nghĩa khá lớn (P
- chỉ số C% không tiến tới bằng 0
- chỉ số D% không di động là 100%
Điều đó khẳng định tác dụng mạnh mẽ của hoạt chất Sf
(số liệu phụ lục 18 trang 86 -118 )

13


So s¸nh t¸c dông diÖt tinh trïng chuét vµ ng−êi cña Saponin
Du trµ víi alkylphenylalcolether [3]

Thuèc
Saponin
Du trµ

Alkyl phenyl
Elcohol ether

Tinh trïng chuét cèng
Nång ®é
mg/ml 20’’ 3’ 5’ 10’ 20’
1,0
0,5
0,25
0,125
0,0625
0,0313
0,0157
+ + 1,0
0.5

chứng minh và chia thành 2 lô: lô chứng và lô thử thuốc, mỗi lô gồm 30 con,
lô thứ 3 gồm 15 chuột cống trắng đực có khả năng sinh sản, được chứng
minh để giao phối. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Tác dụng của thuốc diệt tinh trùng "Sf " đặt âm đạo trên sự
sinh sản ở chuột cống trắng cái
Lô đối chứng
Lô đối chứng: ghép đôi chuột cái
với chuột đực từ 8 giờ sáng, kiểm
tra tế bào âm đạo và tinh trùng,
nếu có tinh trùng coi như chuột đã
thụ tinh ngày thứ nhất. Mười ngày
sau khi ghép đôi và kiểm tra thấy
có tinh trùng âm đạo, mổ chuột
cái để kiểm tra và đếm số vị trí
làm tổ ở hai bên sừng tử cung rồi
đóng vết mổ lại. Đến ngày thứ 18
mổ chuột cái lần thứ hai . Đếm số
bào thai ở hai bên sừng tử cung
.Theo dõi các lứa chuột con đẻ ra.

Số v ị trí làm tổ
Trọng
(mổ lần 1)
TT lượng
Sừng
Sừng
(g)
trái
phải
1

1
9
165
2
6
10
180
7
1
11
165
3
6
12
170
5
3
13
160
2
6
14
150
3
7
15
150
3
3
Trung bình

1
3
5
5
3
2
5
2
7
3
3
3,26 ± 0,50

Lứa
đẻ,
số
con
8
7
7
8
6
7
7
5
5
8
8
8
7

tổ
TT lượng
(mổ lần 1)
(g)
Sừng Sừng
trái
phải
1
150
0
0
2
150
0
0
3
150
0
0
4
160
0
0
5
180
0
0
6
180
0

0
16 160
0
0
17 160
0
0

Số bào thai
(mổ lần 2)
Sừng
trái
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0


Ở lô chứng chuột mẹ thụ thai bình thường, các bào thai phát triển bình thường,
số con đẻ ra từ 5-9 con, ở lô thử thuốc: không có trứng làm tổ ở hai bên sừng tử
cung, chứng tỏ thuốc có tác dụng diệt tinh trùng ở âm đạo chuột cống trắng cái.

16


1.2. Nghiên cứu sự phục hồi khả năng sinh sản của chuột cống trắng cái
sau khi ngừng dùng hoạt chất "Sf " đặt âm đạo (phụ lục 23 trang 142 )
Tiến hành khảo sát xem chuột cống trắng cái sau khi ngừng dùng hoạt chất "Sf"
có phục hồi khả năng sinh sản bình thường hay không.
Chuột cống trắng cái sau khi diệt tinh trùng với liều thực nghiệm
(5mg/chuột/ngày)và có kết quả ngừa thai thì ngừng dùng thuốc. Cho chuột nghỉ
ngơi 2 tháng để chuột khoẻ lại bình thường rồi cho giao phối trở lại (theo quy
trình WHO)
Kết quả thực nghiệm được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Sự phục hồi khả năng sinh sản của chuột cống trắng cái sau khi
ngừng dùng hoạt chất "Sf" đặt âm đạo

Chuột thử
thuốc
TT

1
2
3
4
5
6
7

170

θ với "Sf" 5mg/chuột/ngày
Số vị trí làm tổ
Sừng
Sừng
trái
phải
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

+
+

Sau 2 th áng cho
cho chuột giao phối
l ại
Lứa đẻ thế hệ F1
số con
5
4
6
5
7
4
9
5
6
4
7
6
7
0
0
0
0

NHẬN XÉT KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM :- sau khi thuốc có tác dụng diệt
tinh trùng ở âm đạo chuột cống trắng cái, ngừng dùng thuốc. Cho chuột nghỉ
ngơi 2 tháng để chuột khoẻ rồi cho giao phối lại. Trong số 17 chuột thử nghiệm


12
13
14
15

130
140
140
140
140
140
150
150
170
160
150
160
160
160
160

Trung bình
± SE

Số v ị trí làm tổ
Sừng
trái
4
3
5


3,69 ± 0,20

Số bào thai
Sừng
trái
4
3
5
4
5
3
3
5
3
3
4
3
3
0
0

Sừng
phải
0
3
3
3
4
2


3,69 ± 0,20

Nhận xét kết quả thực nghiệm :- Thuốc không ảnh hưởng đến sự làm tổ
của trứng và sự phát triển của bào thai ở chuột cái thế hệ F1 . Số lượng chuột
con F2 đẻ ra bình thường, không bị dị dạng.
Xét nghiệm vi thể: (một số chuột ngẫu nhiên F1, n=10) các phiếu giải phẫu
bệnh và các ảnh chụp phủ tạng chuột cho thấy thuốc "Sf "không ảnh hưởng gì
18


đến phủ tạng chuột : não, gan, thận, thần kinh, tử cung, tinh hoàn và buồng
trứng đều bình thường. Xét nghiệm nhiễm sắc thể chuột thế hệ F1 thấy rằng
thuốc không ảnh hưởng đến tế bào tuỷ sống, không gây đột biến gen

Tử cung bình thýờng của
chuột mẹ

Gan của chuột thế hệ F1 bình
thường

Buồng trứng bình thường của
chuột mẹ

Thận của chuột thế hệ F1 bình
thường

19

N ão của chuột thế hệ F1 bình

Phương pháp thử: Theo phương pháp truyền thống
Các ch ỉ tiêu theo dõi
+ Về sinh hoá: Men gan (AST, ALT), creatinin, ure
+ Về huyết học: số l ượng hồng cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu, huyết sắc t ố
Quan sát đ ại thể v à vi th ể một số tổ chức gan th ận, n ão, t ử cung, tuyến
ti ền li ệt. Lấy ngẫu nhiên từ mỗi lô thử, khi có kết quả thử nghiệm. L àm
các tiêu bản vi thể và đọc kết quả trên các tiêu bản do bác sĩ chuyên gia
phẫu thuật giải phẫu bệnh Nguyễn Như Oanh đọc (Vi ện Đông Y). Chụp các
tiêu b ản trên kính hiển vi Nikkon với độ phóng đ ại x10, x20 và chụp ảnh trên
m áy.
+ Kết quả thực nghiệm: Tất cả các ch ỉ số sinh hoá v à huy ết học đ ều
không có sự thay đổi đáng kể ở các lô th í nghiệm trước và sau 8 tuần thử thuốc
trên thỏ đ ực và thỏ cái
(Các phiếu xét nghiệm , ph ụ l ục s ố 26 trang 150 - 167)

Gan thỏ sau khi tác dụng v ới Sf

Thận thỏ sau khi tác dụng với Sf

Tử cung thỏ sau khi tác d ụng với Sf

21

Tuy ến tiền liệt thỏ sau khi tác dụng
với Sf

Não thỏ sau khi tác d ụng với Sf