ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
–&—

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN SINH BÀO TỬ

GVHD: ThS. Nguyễn Kim Minh Tâm
SVTH: Hồ Thị Mỹ Linh
MSSV: 60701279

Tp. HCM, tháng 01 năm 2012


LỜI CẢM ƠN
Luận văn đề tài “Khảo sát khả năng sinh amylase ngoại bào của một số
chủng vi khuẩn sinh bào tử” được thực hiện từ tháng 9/2011 đến tháng 1/2012.
Trong suốt quá trình làm luận văn tôi đã được rất nhiều sự giúp đỡ của:
Thạc sĩ Nguyễn Kim Minh Tâm – Bộ môn Công nghệ Sinh học trường đại
học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn, cung cấp
tài liệu và luôn động viên tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.
Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô giáo trong
khoa Kỹ thuật Hóa học Đại học Bách Khoa TpHCM đã tận tình giảng dạy,
truyền đạt những kiến thức cơ bản để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.
Cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 Bộ môn công nghệ Sinh học,
trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử
dụng trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.

TÓM TẮT .................................................................................................................. II
MỤC LỤC ................................................................................................................ III
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ VI
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................VII
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................ VIII
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
TỔNG QUAN............................................................................................................. 3
1. ĐỊNH NGHĨA VỀ ENZYME ................................................................................ 3
1.1. Enzyme ngoại bào ........................................................................................... 3
1.2. Enzyme nội bào ............................................................................................... 3
2. ENZYME AMYLASE ........................................................................................... 3
2.1. Định nghĩa ....................................................................................................... 4
2.2. Phân loại .......................................................................................................... 4
2.3. Một số enzyme amylase phổ biến ................................................................... 5
3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ..................................................... 11
4. ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TRONG THỰC TẾ ĐỜI SỐNG VÀ SẢN XUẤT
.............................................................................................................................. 12
4.1. Ứng dụng của amylase trong công nghệ thực phẩm ..................................... 12
4.2. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác ............................................... 14
5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP AMYLASE
Ở VI SINH VẬT ................................................................................................... 15
5.1. Nhiệt độ ......................................................................................................... 15
5.2. pH môi trường ............................................................................................... 16
5.3. Độ thông khí .................................................................................................. 16
iii


5.4. Thành phần môi trường ................................................................................. 16
6. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE CỦA VI SINH
VẬT ...................................................................................................................... 17

1. PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH AMYLASE ........................................................ 35
2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH AMYLASE
CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ......................................................................... 39
3. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA AMYLASE ................... 45
4. BÀN LUẬN .......................................................................................................... 47
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 35
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 39
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ........................................................................................... 54
TÀI LIỆU TIẾNG ANH ........................................................................................... 55

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase .. 32
Bảng 2. Các bước pha mẫu để xác định hoạt độ amylase ........................................ 33
Bảng 3. Khả năng sinh amylase ngoại bào và khả năng thích nghi với môi trường
của một số chủng vi sinh vật phân lập được ............................................................. 35
Bảng 4. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 19 theo
thời gian .................................................................................................................... 39
Bảng 5. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 20 theo
thời gian .................................................................................................................... 40
Bảng 6. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 21 theo
thời gian .................................................................................................................... 41
Bảng 7. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 24 theo
thời gian .................................................................................................................... 42
Bảng 8. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 25 theo
thời gian .................................................................................................................... 43
Bảng 9. So sánh hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn ........................ 44


viii


MỞ Đ ẦU


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp đại học 2012

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú, chúng có mặt ở khắp mọi
nơi trong đất, nước, không khí… Ngoài những tác hại như gây ảnh hưởng xấu đến
sức khỏe của con người và động thực vật, vi sinh vật còn mang lại một nguồn lợi to
lớn nếu chúng ta hiểu biết và sử dụng chúng hợp lý. Các loài vi sinh vật nói chung
và các loài sinh bào tử nói riêng đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rất nhiều
trong các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, công nghiệp và y học… nhờ khả
năng sản sinh các loại enzyme thủy phân của chúng.
Enzyme là chất xúc tác sinh học, ngoài tính chất của một chất xúc tác nó còn
đặc biệt hơn ở chỗ chúng có khả năng xúc tác ở nhiệt độ và áp suất bình thường, có
tính đặc hiệu cao. Chính vì thế, enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi với quy
mô sản xuất lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển công nghệ enzyme. Việc sử
dụng enzyme không chỉ mang lợi ích về kinh tế mà còn góp phần giải quyết hiệu
quả việc làm sạch và bảo vệ môi trường.
Trước kia, enzyme thường được khai thác chủ yếu ở thực vật và động vật, như
amylase từ malt, papain từ đu đủ hay các protease từ động vật… Tuy nhiên, việc thu
nhận enzyme từ hai nguồn này còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như thời tiết,
bệnh tật, năng suất và hơn hết đây chưa phải là sản phẩm chính của ngành trồng trọt
và chăn nuôi của nước ta. Vì vậy, việc dùng tế bào động vật và thực vật làm nguồn
nguyên liệu để thu nhận enzyme khá hạn chế, thiếu tính kinh tế và khó nâng lên quy

w Nội dung nghiên cứu
Bao gồm nội dung chính:
- Phân lập và tuyển chọn các chủng sinh bào tử có khả năng sản sinh
amylase hoạt tính cao trong môi trường đất.
- Nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, hình thái bào tử của các chủng tuyển chọn.
- Khảo sát thời gian nuôi cấy để thu được enzyme có hoạt tính cao.
- Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel.
- Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme thu được.

Mở đầu

2


T Ổ N G Q U AN


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

1. ĐỊNH NGHĨA VỀ ENZYME [2][3]
Enzyme là những phân tử protein đặc hiệu có khả năng xúc tác các phản ứng
chuyên biệt.
Cấu trúc không gian của enzyme có vai trò quan trọng đối với hoạt tính xúc
tác của enzyme. Tuy nhiên, hoạt động của enzyme liên hệ trực tiếp với một phần
xác định trong phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động - phần của phân tử
enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất tạo thành phức chất trung gian giữa enzyme và
cơ chất.


thu được enzyme ở dạng bột đồng thời đặt tên là diaslase (theo tiếng Hy Lạp có
nghĩa là phân giải). Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột
được gọi là amylase [3].
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật,
trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn [3]. Trong đó,
amylase từ vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất nhờ những đặc
điểm ưu việt của chúng.
Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đặt nền móng cho việc sản xuất các
chế phẩm enzyme này và là cơ sở để sử dụng chúng trong sản xuất và đời sống
Hiện nay, kỹ thuật nghiên cứu về enzyme amylase đã hoàn thiện hơn và mở ra
những phương hướng mới, triển vọng mới trong việc ứng dụng amylase trong các
ngành kinh tế quốc dân.

2.1. Định nghĩa [3][10]
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong
nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH

→

RH + R’OH

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen.

2.2. Phân loại [3][20]
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và
exoamylase (enzyme ngoại bào).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme
khử nhánh này được chia thành 2 loại:


5


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

2.3.1.1. Cơ chế tác dụng
Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:
- Giai đoạn dextrin hóa: chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành
một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh
(các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Tinh bột à dextrin phân tử lượng thấp.
- Giai đoạn đường hóa: các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp
tục tạo ra các tetra-trimaltose. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi αamylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
Dextrin à tetra- và trimaltose à di- và monosaccharide.
Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide (gồm 6-7 gốc glucose). Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp
tục tạo nên các mạch cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của
amylose chứa 13% glucose và 87% maltose.
Amylose à oligosaccharide à polyglucose à maltotetrose à maltotriose à
maltose.
Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không
phân cắt được liên kết α-1,6- glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường
nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose
8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành

các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và
nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+,
Ag+, Hg2+…
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với αamylase từ vi sinh vật.
Ví dụ: pH tối thích cho α-amylase từ malt là 5.3 (khoảng hoạt động từ pH 4.75.4), α-amylase từ nấm sợi là 4.8 (khoảng hoạt động từ pH từ 4.5-5.8).
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau.
Tổng quan

7


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

Ví dụ: α-amylase của A.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của
malt và vi khuẩn B.subtilis.
Độ bền của α-amylase cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH. Tuy nhiên, so
với các loại enzyme amylase khác thì α-amylase có độ bền nhiệt hơn.
Ví dụ: Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn
khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác
động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50oC và bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 1991).
Trong dung dịch đệm pH= 4,7 thì α-amylase của A.oryzae rất nhạy với tác động của
nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt tính dextrin hóa của nó chỉ còn 2229%, hoạt tính đường hóa còn 27-85%. Ở 50oC trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi
này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).

2.3.2. Enzyme β – amylase (EC 3.2.1.2) hay 4-α -D-glucan maltohydrolase

Hình 2. Sơ đồ cấu trúc không gian của β – amylase [20]


Tổng quan

9


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

2.3.3. Enzyme γ - amylase (EC 3.2.1.3) hay 4- α-D-glucan glucohydrolase

Hình 3. Sơ đồ cấu trúc không gian của enzyme γ – amylase.
γ - amylase có khả năng thủy phân liên kết α -1,4 lẫn α-1,6-glucoside từ đầu
không khử của mạch .
Ngoài ra, γ - amylase còn có khả năng thủy phân liên kết α -1,2-glucoside và α
-1,3-glucoside. Do đó, nó có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại
enzyme amylase khác.
γ – amylase hoạt động hiệu quả trong môi trường acid, pH 3.5-5.5, ở nhiệt độ
50 oC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton.

2.3.4. Pullulanase (EC 3.2.1.41) hay α-dextrin 6–glucosidase
Pullulanase có khả năng thủy phân liên kết α -1,6-glucoside trong các polyose
và oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen.
Cơ chất đặc trưng của enzyme này là pullulan-một polysaccharide tách ra từ
giả nấm men Aureobasidium pullulana.
Phân tử lượng là 145.000 Da, pH hoạt động tối ưu là pH = 5, nhiệt độ tối ưu là
47.5 oC.


trình sản xuất.
Do đó nó đã trở thành đối tượng được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất để
thu nhận enzyme.
Những chủng vi sinh vật sinh nhiều amylase thường được phân lập từ các
nguồn trong tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,
giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Tổng quan

11


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

Vi khuẩn thường sử dụng các chủng như Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis,

Baccillus

diastaticus,

Bacillus

stearothemophilus,

Bacillus

circulans…
Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus và Rihzopus…

4.1.2. Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo
Mục đích đưa enzyme vào sản xuất bánh quy là làm tăng mùi vị của bánh.
Amylase hoạt động làm tăng lượng đường khử, đường này sẽ tham gia phản ứng
oxy hóa khử và kết quả tạo bánh quy có màu và mùi hấp dẫn.

4.1.3. Ứng dụng trong sản xuất bia
Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử
dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai
đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp.
Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch
chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được
tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng
và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ
enzyme của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ để
phân hủy lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản
xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm.
Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không
sử dụng hoàn toàn 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một
công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trình lên
men. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm
enzyme amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột. Enzyme này có ý nghĩa
rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp.

4.1.4. Ứng dụng trong sản xuất siro
Ứng dụng trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường- phôi bắp được xử
lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm, ra khỏi khối bột bằng li tâm.
Enzyme amylase chỉ được sử dụng sau khi tinh bột hòa vào nước.

Tổng quan


4.2.2. Ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa
Chất tẩy rửa bao gồm những chất kiềm, sodium silicate, sodium bicarbonate,
sodium tripolyphosphate.

Tổng quan

14