ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƯỜNG VÀ TUỔI PHÔI ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI
SINH CÂY TỪ PHÔI NON DÒNG NGÔ NHẬP NỘI
HR8, HR9

Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ
Năng Vịnh
Viện Di truyền nông nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khả năng tái sinh của cây trồng nói chung phụ thuộc nhiều
vào kiểu gen của thực vật. Đối với cây ngô, vấn đề tái sinh
gặp rất nhiều khó khăn, ngoại trừ một số dòng có khả năng
tái sinh cao, được sử dụng làm vật liệu chuyển gen như:
A188, H99, HiII…hầu hết các dòng ngô khác có khả năng
tái sinh kém (1). Mặt khác, khả năng tái sinh còn phụ thuộc
vào môi trường nuôi cấy và một số yếu tố khác. Việc
nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy và
tái sinh ở cây ngô còn hạn chế.

Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi trình bày kết quả
nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và
tuổi phôi nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây
từ phôi non trên cơ sở các dòng ngô nhập nội có khả năng
tái sinh cao HR8 và HR9. Hai dòng ngô này có nguồn gốc
ôn đới, đã được trồng và xác định thời vụ sinh trưởng thích
hợp trong điều kiện Việt nam (10).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP


Hai loại môi trường cơ bản được sử dụng:

- Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)

- Môi trường N6 (Chu et al., 1975)

bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng và một số phụ gia
khác tuỳ từng giai đoạn nuôi cấy (theo Armstrong and
Green, 1985 có cải tiến):

• Môi trường tạo mô sẹo: gồm 2 môi trường khác nhau về
thành phần khoáng và vitamin

- Môi trường CMS: môi trường MS bổ sung 20 g/l sucrose,
2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline
và 10mg/l AgNO
3
.

- Môi trường CN6: môi trường N6 bổ sung 20 g/l sucrose,
2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25 mM L-proline
và AgNO3 nồng độ từ 0-30mg/l.

• Môi trường tái sinh chồi (SM): môi trường N6 bổ sung 60
g/l sucrose, 2 g/l myo-inositol.

• Môi trường kéo dài chồi và tạo cây hoàn chỉnh (RM): môi
trường 1/2MS bổ sung 20 g/l sucrose, 1 g/l myo-inositol.

Tất cả các môi trường đều sử dụng chất giá thể là phytagel


Kết quả bảng 1 cho thấy phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh
cây dòng HR8 được cải thiện một cách rõ rệt khi bổ sung
AgNO
3
nồng độ 1-15mg/l vào môi trường nuôi cấy: tỷ lệ
tạo mô sẹo tăng từ 56,6% lên 85,5%, tỷ lệ tái sinh cây tăng
từ 18,6% lên 22,6% (trong môi trường không có và có
1mg/l AgNO
3
). Tần số tạo mô sẹo và tái sinh cây đạt giá trị
tương đối cao (từ 85.5% - 90.5% và 22.6% - 26.6%) và
thay đổi không đáng kể khi bổ sung 5-15 mg/l AgNO
3
vào
môi trường nuôi cấy. Song, ở nồng độ 10mg/l AgNO
3
thì
khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 đạt giá trị
lớn nhất (90.5% và 26.6%) và giảm dần khi tăng nồng độ
AgNO
3
từ 20mg/l lên 30mg/l.

Hình 1. Ảnh hưởng của AgNO
3
đến khả năng tạo mô sẹo
và tái sinh cây dòng HR8

Trong thí nghiệm này chúng tôi quan sát thấy mô sẹo bắt
đầu xuất hiện sau 1-2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, chúng tôi
chưa quan sát được sự khác biệt về mặt hình thái giữa các
loại mô sẹo tạo thành ở giai đoạn này. Vì thế mẫu được cấy
chuyển sang môi trường mới và sự hình thành các dạng mô
sẹo khác nhau cũng như khả năng tạo mô sẹo đã được quan
sát rất rõ sau 1-2 tuần nuôi cấy tiếp theo (hình 4A, 4B, 4C).
Kết quả bảng 2 cho thấy có sự khác biệt không đáng kể về
khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 khi nuôi cấy
trong môi trường có thành phần khoáng và vitamin khác
nhau: a) Tỷ lệ tạo mô sẹo: đạt 69,4 % và 60,0%, b) Tỷ lệ tái
sinh cây: đạt 18,5 % và 20,8% trong môi trường MS và N6
không bổ sung AgNO
3
tương ứng. Tần số tạo mô sẹo và tái
sinh cây của phôi nuôi cấy trong môi trường MS và N6 có
bổ sung 10mg/l AgNO
3
cũng đạt kết quả tương tự.

Hình 3: ẢNh hưởng của thành phần môi trường và AgNO
3

đến khả năng tái sinh dòng HR8 Sự có mặt của AgNO
3
trong môi trường nuôi cấy đã cải

cấy) lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8
Hình 4. A. Phôi nuôi cấy; B, C. Mô sẹo và mô sẹo phôi hoá
tạo thành từ phôi non; D. Cây tái sinh; E, F, G. Mô sẹo tạo
thành từ phôi nuôi cấy có kích thước 0,5; 1-2 và 3 mm
tương ứng; Đối với các phôi nuôi cấy ở độ tuổi 16 ngày sau thụ phấn
(có kích thước 0,5mm) khối tế bào mô sẹo tạo thành rất
nhỏ, sinh trưởng chậm và có dạng nhầy (hình 4E). Khi tái
sinh chúng tạo thành cụm chồi với các chồi không hữu
hiệu, sức sống kém và ít rễ. Tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây
thấp đạt 29,4% và 11,3%.

Bên cạnh đó thì khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ các
phôi non ở độ tuổi 18-20 ngày (có kích thước khoảng 1-
2mm) là tương đối tốt. Sau 7-10 ngày trên bề mặt của mẫu
nuôi cấy đã xuất hiện các khối mô sẹo dạng hạt nhỏ, xốp,
có màu trắng ngà (hình 4F). Khối tế bào này sinh trưởng rất
nhanh, sau vài lần cấy chuyển đã phát triển thành các phôi
dạng hình cầu (hình 4C). Các tế bào phôi này được tách ra
một cách dễ dàng, phát triển thành cây hoàn chỉnh (hình
4D). Tỷ lệ tạo mô sẹo và tái sinh cây đạt 54,4-83,3% và
17,7-26,6%.
Ngược lại, với các phôi nuôi cấy ban đầu ở độ tuổi trên 20
ngày (có kích thước 3mm) thì khả năng tạo mô sẹo rất
kém, tế bào phôi nuôi cấy phồng to lên, rễ xuất hiện (hình

phần khoáng và vitamin khác nhau (MS và N6) có bổ sung
20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100 mg/l casein hydrolysat, 25
mM L-proline và 10 mg/l AgNO
3
. Sự có mặt của 10mg/l
AgNO
3
trong môi trường N6 đã có tác dụng kích thích khả
năng tạo mô sẹo cũng như tái sinh chồi.

3. Phôi non sau thụ phấn 18-20 ngày (có kích thước tương
ứng khoảng 1-2mm) có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây
tốt nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Armstrong CL., and Green CE. (1985)
Establishment and maintenance of friable, embryogenic
maize callus and the involvement of L-proline. Planta 164:
207-214
2. Chu CC., Wang CC., Sun CS., Hsu C.,Yin KC., Chu
CY., Bi FY. (1975)
Establishment of an efficient medium for anther culture of
rice through comparative experiments on the nitrogen
source. Sci Sin 18: 659-668.
3. Do Nang Vinh (1989)
Factors affecting the formation and differentiation of
embryogenic callus in cultured in vitro of immature maize
embryos. Genetics and breeding, vol. 22, No. 1, Sofia.
4. Green CE., and Phillips RL. (1975)

12. Vain P., Yean H., and Flament P. (1989)
Enhancement of production and regeneration of
embryogenic type II callus in Zea mays L. by AgNO3.
Plant Cell Tissue and Organ Culture 18: 143-151.

SUMMARY

The affect of medium component and embryo age on
callus induction and plant regeneration from immature
embryos of HR8 maize inbred line

Pham Thi Ly Thu, Pham Minh Thoi, Le Huy Ham, Do
Nang Vinh
Institute of Agricultural Genetics

The effective regeneration system plays important role in
plant transformation. In general, maize (Zea mays L.) is
recalcitral plant in regeneration, except some high
regenerable lines as A188, H99, HiII… which have been
used for transformation. Besides, plant regeneration
capacity depends on genotype. It was also affected by
medium component and the other factors.

HR8 and HR9 are high regenerable lines were used in this
study. There was no significant difference among callus
induction rates for immature embryos cultured on MS or
N6 medium containing 20 g/l sucrose, 2 mg/l 2,4-D, 100