BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------

TRẦN NHẬT THANH

NGHI N CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT VÀO QUÁ
TR NH

N

EN CA CAO

UẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

KHÁNH HÒA - Năm 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------

TRẦN NHẬT THANH

NGHI N CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT VÀO QUÁ
TR NH

N

EN CA CAO


KHÁNH HÒA - Năm 2015


1

ỜI CA

ĐOAN

Tôi xin cam kết đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả nêu trong luận văn
“

là trung thực và

chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Nha Trang, ngày 05 tháng 10 năm 2015
Tác giả luận văn
Trần Nhật Thanh

iii


2

ỜI CẢ

ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:
 Thầy PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn và Cô TS. Mai Thị Tuyết Nga, Cô Nguyễn


5

DANH MỤC CHỮ VIÊT TẮT ........................................................................... viii

6

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ix

7

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. x

8

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .................................................................................... xii

9

LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................ xiii

1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN....................................................................................1
1.1

Tìm hiểu về ca cao .....................................................................................................1

1.1.1


1.2.2

Ủ trong thúng (fermentation in basket)........................................................6

1.2.3

Ủ thùng (fermentation in box) ......................................................................7

1.3

Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao .....................................................8

1.3.1

Nấm men....................................................................................................... 11

1.3.2

Vi khuẩn Acetic ........................................................................................... 11

1.3.3

Vi khuẩn Lactic............................................................................................ 12

1.3.3.1

. Khái quát chung về vi khuẩn lactic ......................................................... 13

1.3.3.2


Biến đổi màu sắc hạt ................................................................................... 19

1.5

Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về lên men ca cao .............................. 20

1.5.1

Những nghiên cứu trong nƣớc ................................................................... 20

1.5.2

Những nghiên cứu ngoài nƣớc ................................................................... 21
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 24

2
2.1

Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................ 24

2.2

Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 24
. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................................ 24

2.2.1

2.2.2
Bố trí thí nghiệm xác định các thông số thích hợp trong quy trình sản
xuất chế phẩm sử dụng chủng vi khuẩn lactic ............................................................... 25


2.2.3.3
Tiến hành kiểm tra pH, số lƣợng các chủng vi sinh trong quá trình lên
men ca cao 31
Các phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................ 32

2.2.4

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.......................... 33

3
3.1

Kết quả nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic ..................................... 33

3.1.1

Các thông số thích hợp trong quy trình sản xuất chế phẩm lactic......... 33

3.1.1.1

Hàm lƣợng bột đậu nành ............................................................................ 33

3.1.1.2

Hàm lƣợng đƣờng........................................................................................ 34

3.1.1.3

Độ pH ............................................................................................................ 35


3.2.2.1

Lên men 1 phần............................................................................................ 45

3.2.2.2

Dƣới mức lên men ....................................................................................... 46

3.2.3
lactic

Sự biến đổi pH của 16 mẫu nghiên cứu có bổ sung chế phẩm vi khuẩn
47

3.2.3.1

Nhóm 1 (mẫu 1-5) ....................................................................................... 47

3.2.3.2

Nhóm 2 (mẫu 6-10) ..................................................................................... 48

3.2.3.3

Nhóm 3 (mẫu 11-15)................................................................................... 49

3.2.4
Sự biến đổi của vi sinh vật trong 16 mẫu nghiên cứu bổ sung chế phẩm
vi khuẩn lactic .................................................................................................................... 52



6

DANH

ỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số vi sinh vật chính đƣợc phân lập từ quá trình lên men hạt ca cao .........9
Bảng 2.1 Bảng bổ sung chế phẩm trong thời gian lên men theo tỉ lệ % so với lƣợng
mẫu .......................................................................................................................................... 31
Bảng 3.1 Quy đổi biến mã và biến thực ............................................................................. 35
Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm tối ƣu hóa............................................................................. 36
Bảng 3.3 Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình đáp ứng bậc 2 của hàm mục tiêu số
lƣợng khuẩn lạc ..................................................................................................................... 37
Bảng 3.4 Thông số đánh giá tính phù hợp và sự tƣơng quan mô hình ........................... 37
Bảng 3.5 Các hệ số ảnh hƣởng trong mô hình hồi quy .................................................... 40

ix


7

DANH

ỤC H NH

Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao .............................................................................................3
Hình 1.2 Lên men thành đống ................................................................................................6
Hình 1.3 Lên men trong thúng................................................................................................7

Hình 3.14 Sự biến đổi của nấm men trong khối hạt trong quá trình lên men ca cao có
bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic ....................................................................................... 52
Hình 3.15 Sự biến đổi của vi khuẩn acetic trong khối hạt trong quá trình lên men ca
cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic ........................................................................... 53
Hình 3.16 Sự biến đổi của vi khuẩn lactic trong khối hạt trong quá trình lên men ca cao
có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic .................................................................................. 55

x


Hình 3.17 Quy trình lên men ca cao có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic quy mô
phòng thí nghiệm ................................................................................................................... 57

xi


8

TRÍCH YẾU UẬN VĂN

 Ca cao đƣợc du nhập vào Việt Nam từ rất sớm nhƣng đến nay kỹ thuật sơ chế
còn thấp, phƣơng pháp lên men còn thủ công … nên hiệu quả thu đƣợc và chất lƣợng
hạt ca cao thành phẩm còn thấp. Xuất phát từ thực tiễn trên, dƣới sự hƣớng dẫn của
PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn và TS. Mai Thị Tuyết Nga, tôi đề xuất đƣợc thực hiện đề
tài: “

”.

 Sản xuất đƣợc chế phẩm vi sinh vật dùng để lên men hạt ca cao quy mô phòng
thí nghiệm.

Ở ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài


Ca cao du nhập vào nƣớc ta từ rất lâu. Nó đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh ở Tây

Nguyên và Nam Bộ với sản lƣợng rất cao. Năm 2009 tổng diện tích ca cao của Việt
nam là 9.683 ha: 1.315 ha trồng thuần (1.100cây/ha) và 8.368 ha trồng xen (600
cây/ha), nhiều nhất là ở các tỉnh Bến Tre, Dak Lak, Bình Phƣớc. Đến năm 2013, diện
tích ca cao cả nƣớc đạt 22.110,3 ha, trong đó vùng có diện tính trồng lớn nhất là Đồng
bằng sông Cửu Long và Tây Nguyên. Diện tích ca cao cho thu hoạch khoảng 11.055
ha, chiếm 50% tổng diện tích, sản lƣợng hạt ca cao khô lên men năm 2013 là 6.765
tấn.


Có 3 giống ca cao chính là Criollo, Forastero và Trinitario. Criollo là giống

cho hƣơng vị đặc biệt, hạt ca cao Criollo thƣờng đƣợc dùng để pha trộn vào các loại ca
cao khác khi chế biến, hoặc để dùng làm nguyên liệu để sản xuất ra những loại
chocolate đặc biệt. Tuy nhiên Criollo thƣờng hay bị bệnh tật tấn công. Forastero cho
năng suất cao nên đƣợc trồng rộng rãi. Ngày nay 80% ca cao trên thế giới đƣợc trồng
là ca cao Forastero. Trinitario là giống tƣơng đối mới đƣợc cấy gh p giữa Criollo và
Forastero, nó có mùi thơm đặc biệt của Criollo và sản lƣợng c ng nhƣ khả năng
chống chịu sâu bệnh của Forastero. Tuy nhiên do nó là giống mới nên sản lƣợng trên
thị trƣờng thế giới còn ít.


Tuy có từ khá lâu ở nƣớc ta nhƣng do kỹ thuật sơ chế còn thấp, phƣơng pháp



 Cây ca cao có tên khoa học là Theobroma, ca cao thuộc họ Sterculiacea, là cây
duy nhất trong số 22 loài của thứ Theobroma đƣợc trồng sản xuất.
Giới:

Plantae-Plants

Phân giới:

Tracheobionta-Vascular plants

Nhóm:

Magnoliophyta-Flowering plants

Lớp:

Magnoliopsida-Dicotyledons

Phân lớp:

Dilleniidae

Bộ:

Malvales

Chi:

Theobroma L. - Theobroma

Trong điều kiện sản xuất, chiều cao trung bình của cây ca cao khoảng 5 – 7 m, đƣờng
kính khoảng 10 – 18 cm. Trên mỗi thân cacao có thể có từ 4 – 5 tầng cành.
 Lá: Lá ca cao phát triển theo từng đợt, buông thỏng xuống. Màu sắc lá thay đổi
tùy theo giống, từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm. Trong quá trình
trƣởng thành, lá mất sắc tố nên có màu xanh hoặc xanh thẫm, cứng cáp hơn và có thể
nằm ngang. Lá dƣới bóng che có phiến rộng và xanh hơn lá ở ngoài nắng. Khí khổng
chỉ có mặt ở dƣới phiến lá. Trên mặt lá, mô dậu có nhiều khoang giữa các tế bào và
chứa đầy chất nhựa, lớp ngoại bì bị cutin hóa rất mạnh. Lá tồn tại đƣợc từ 4 – 5 tháng,
sau đó đi vào giai đoạn lão suy và rụng.
 Hoa: Hoa ca cao xuất hiện trên sẹo lá của thân, cành. Hằng năm, hoa xuất hiện
trên cùng một chỗ ở vết sẹo lá, lâu ngày chỗ ra hoa phình to và nhô lên thành đệm hoa.
Hoa có cuống dài 1 – 3 cm, có 5 cánh đều đặn xen kẽ với 5 cánh đài. Hoa nở từ 3 giờ
chiều đến 9 giờ sáng hôm sau.
 Quả: Những đặc tính về màu sắc, kích thƣớc và hình dạng quả thay đổi rất
nhiều tùy thuộc vào giống.
 Màu sắc: Quả chƣa chín có thể có màu xanh, đỏ tím hoặc xanh điểm sắc đỏ
tím,… Khi quả đạt độ chín, màu xanh chuyển qua vàng, màu đỏ tím thƣờng chuyển
qua màu da cam.
 Hình dạng, kích thƣớc: Hình dạng quả thay đổi từ hình cầu, hình oval đến hơi
dài, nhọn hoặc hình trứng. Thƣờng quả có chiều dài 7 – 30 cm, rộng 7 – 9 cm.
 Hạt: Hạt ca cao không có nhân, mập, dài 2 – 3 cm: và có cùi nhớt màu trắng, có
vị hơi chua bao bên ngoài. Kế lớp cùi nhớt là lớp vỏ mỏng, nhiều đƣờng gân bao bọc
lấy hạt ở bên trong. Hạt chứa tử diệp màu tím (màu trắng ngà hoặc vàng nhạt đối với
giống Criollo) và hóa nâu sau khi lên men. Kích thƣớc hạt có thể thay đổi tùy the o
giống và mùa vụ. Mỗi quả ca cao có từ 30 – 40 hạt đƣợc bao quanh bằng lớp nhầy.
Lớp nhầy này có vị hơi ngọt và đó chính là cơ chất cho quá trình lên men [25].

2



 Ca cao đƣợc trồng ở 50 quốc gia trên thế giới với diện tích khoảng 5 triệu ha,
tuy nhiên mức cung lại phụ thuộc vào 3 quốc gia chính là Bờ Biển Ngà, Indonexia và
Ghana, trong đó Bờ Biển Ngà là nƣớc sản xuất ca cao nhiều nhất thế giới, chiếm 40%
sản lƣợng toàn cầu, Indonexia chiếm 12 % sản lƣợng, Ghana chiếm 21 % [12].
 Sản lƣợng ca cao trên thế giới niên vụ 2003/04 lên tới 3,5 triệu tấn tăng so với
niên vụ 2002/03 là 13,8 %.
 Tây Phi sản xuất ca cao chiếm 72,4 % sản lƣợng ca cao thế giới. Từ những năm
1970 đến nay sản lƣợng ca cao ở Đông Nam Á tăng nhanh và hiện chiếm 17 %. Tại
Đông Nam Á ca cao đƣợc trồng ở một số nƣớc nhƣ: Indonexia, Philippin, Malaysia,
Việt Nam, Papua New Guinea, India, Srilanca và cho sản lƣợng khoảng 500 000 tấn.
 Tiêu thụ ca cao trên thế giới ngày càng tăng với tốc độ 2 – 3 % mỗi năm và ca
cao chủ yếu dùng để sản xuất socola. Ƣớc tính tiêu thụ ca cao trên thế giới năm
2004/05 tăng lên 3,23 triệu tấn và tăng thêm 3 triệu tấn năm 2008.
 Trong thế kỷ 20, tiêu thụ ca cao tăng nhanh do kết quả trực tiếp của việc gia
tăng nhu cầu socola. Nhu cầu socola tăng do nhiều yếu tố nhƣ tăng thu nhập, tăng dân
số, giá bán lẻ giảm, sản phẩm làm từ ca cao phong phú, kỹ thuật tiếp thị hiện đại,...
 Các nƣớc Tây Âu, Bắc Mỹ là thị trƣờng tiêu thụ lớn nhất thế giới, chiếm 70 %
sản lƣợng ca cao thế giới, riêng các nƣớc Liên minh Châu Âu (EU) tiêu dùng khoảng
một nửa sản lƣợng ca cao hằng năm trên thế giới (Bỉ là nƣớc tiêu thụ ca cao nhiều
nhất, trung bình cứ 5 kg/ngƣời) [30], [32].
 Cây ca cao ở Việt Nam đƣợc khôi phục và phát triển từ khi có sự hỗ trợ của dự
án quốc tế Success alliance, từ vài chục ha năm 2000 tăng lên 7320 ha năm 2006 và

4


đạt hơn 11 400 ha vào cuối năm 2007. Nhiều mô hình trồng ca cao đạt năng suất từ 1,5
tấn đến hơn 2 tấn hạt khô/ ha.
 Hiện nay, tổng lƣợng ca cao khô của Việt Nam mỗi năm khoảng 4.000 tấn.
Theo kế hoạch phát triển ca cao của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm


 Ủ đống có ƣu điểm: dụng cụ đơn giản, phù hợp với nhiều khối lƣợng khác nhau
[32].

Hình 1.2 ên men thành đống
[35]

1.2.2 Ủ trong thúng (fermentation in basket)
 Lót lá chuối xung quanh thúng tre, đổ đầy hạt và đậy thúng lại bằng lá chuối.
Hai ngày sau khi ủ trộn đều hạt bằng cách đổ từ thúng này sang thúng khác.
 Kích thƣớc thúng tuỳ theo khối lƣợng hạt để có thể chứa từ 10 – 150 kg hạt ca
cao tƣơi.
 Sau khi ủ độ 5 – 7 ngày, nếu ủ đúng cách và đúng mức thì các hạt ca cao đều
có màu nâu sậm. Ngƣợc lại nếu ủ không đúng cách thì các hạt bên phía ngoài có màu
nâu, phía trong hơi trắng và giữa đống ủ các hạt trắng hơn. Có thể hạt còn có màu đen,
nấm mốc phát triển và hạt xuất hiện mùi amoniac khi thời gian ủ quá mức.
 Đối với giống Forastero Trinitario thƣờng ủ khoảng 3 – 7 ngày, còn giống
Criollo chỉ cần 2 – 3 ngày là đƣợc [32].

6


Hình 1.3 Lên men trong thúng
[35]

1.2.3 Ủ thùng (fermentation in box)


Ca cao đƣợc chứa trong thùng gỗ có đục lỗ ở đáy. Kích thƣớc chiều dài và


vào quá trình lên men bao gồm vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Betabacterium,
Streptobacterium, Str p

,…), vi khuẩn acetic (Acetobacterraner, A. ascendens,

A. suboxydans, A. xylinodes, A. orleanense, Gluconobacter oxydans,…), vi khuẩn
Bacillus (B. subtilis, B. circulans, B. licheniformis,…) và nấm mốc (Aspergillus,
Mucor, P

,R z p ,…). Mỗi nhóm vi sinh vật đều có một vai trò rất quan

trọng ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình lên men c ng nhƣ chất lƣợng hạt thành phẩm.
Do đó, các công trình nghiên cứu tuyển chọn và ứng dụng hệ vi sinh vật chức năng để
điều khiển quá trình lên men c ng đƣợc quan tâm thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới
[16], [ 17].
 Theo Ardhana và Fleet (2003) có khoảng 124 loài vi sinh vật hiện diện trong
quá trình lên men hạt ca cao bao gồm các loài: nấm men (yeasts), vi khuẩn (bacteria),
nấm mốc (mould). Tuy nhiên mật độ và số lƣợng vi sinh vật ban đầu của mỗi vùng,
mỗi quốc gia là khác nhau, do đó quá trình lên men của các vùng c ng khác nhau. Phải
chăng đây là một trong những nguyên nhân và biện pháp điều khiển để tạo ra các loại
hạt ca cao có chất lƣợng đặc biệt và từ đó tạo ra các sản phẩm chocolate có nguồn gốc
và xuất xứ (chocolate đặc sản)[13].
 Trong quá trình lên men mật độ vi sinh vật c ng biến thiên theo thời gian lên
men: số tế bào vi sinh vật hiếu khí tăng lên từ 6,1 x 10 6 CFU/g đến cực đại 4,2 x 10 7
CFU/g chất khô sau 48 h lên men. Nấm men phát triển tới cực đại trong 24 h đầu của

8


lên men ở mật độ 6,1 x 10 7 CFU/g. Vi khuẩn sản sinh acid lactic và acid acetic phát

Lactobacillus

Vi khuẩn

mali

plantarum

lactic

Lactobacillus

Lactobacillus

collinoides

collinoides

Lactobacillus cellobiosus
Lactobacillus casei
subsp. pseudoplantarum
Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus

Lactobacillus

fermentum

fructivorans


Acetobacter

Acetobacter

Gluconobater oxydans

xylinum

xylinum

Gluconobater

Gluconobater

oxydans

oxydans

sinh acid
acetic

Brettanomyces claussenii
Candida spp.
Hansenula spp.
Kloeckera spp.

Candida spp.
Debaryomyces



Rhodotorula spp.

Schizosacharom
yces spp.
Torulopsis spp.

Candida reukaufii

Sacharomyces spp.

Kloeckera javanica

Torulopsis spp.

Pichia
membranaefaciens

10


Sacharomyces cerevisiea
Sacharomyces chevalieri
Sacharomyces spp
Schizosascharomyces
malidevorans
a: Nguồn: Carr và cộng sự
b: Nguồn: S.S Thompson và Pfeifer, số liệu chƣa công bố [7].
1.3.1 Nấm men
 Nấm men có mặt ngay trong giai đoạn đầu của quá trình lên men(24–48h lên